文摘

心脏瓣膜是动态的结构,表现出高度专业化的体系结构组成的细胞和细胞外基质相关蛋白多糖和粘多糖含量、胶原蛋白和弹性纤维。生物瓣膜替代品来自异种的心脏,心包组织。为了克服这种非可行的替代品的极限,组织工程方法出现创建细胞添脱细胞支架。执行这项研究确定粘多糖含量、分布和二糖成分在猪主动脉和肺动脉瓣膜和心包前后detergent-based去细胞过程。galactosaminoglycans结构特点的硫酸软骨素,考察了硫酸dermatan的脸。此外,脱细胞心包的力学性能及其倾向通过体外播种成纤维细胞重新填充。结果表明,galactosaminoglycans和心包和阀门之间的透明质酸不同分布在心脏瓣膜自己之前和之后去细胞。葡糖氨基葡聚糖也依赖于血管的分布地区和地形本地化。去细胞协议采用了相关但不选择性galactosaminoglycans枯竭。作为一个整体,数据表明,脱细胞猪心脏瓣膜和牛心包代表前途的材料轴承未来发展潜力的组织工程心脏瓣膜支架。

1。介绍

心脏瓣膜疾病有深度的影响在全球范围内与大量的每年瓣膜替换操作。典型阀替代机械假肢和bioprostheses获得cardiac-valvulated管道(主动脉和肺动脉根部)或心包组织猪和牛的起源。瓣膜,尽管相关血栓栓塞的风险较低的机械,具有有限的寿命由于营养不良的钙化顺向戊二醛(GA)治疗用于预防排斥反应(1)和遭受折磨的许多相同的退化过程原生阀门(2]。在过去的几年,组织工程(TE)方法在响应限制与组织和器官移植和稀缺的捐助者。三个组件所必需的TE替代:细胞、支架(旨在维持细胞在三维环境中),基因表达和信号,引导和ECM生产期间组织开发3]。典型的方法依赖于矩阵非细胞异种移植的使用(主要是猪和牛)作为支架,最终成为利用细胞从病人4]。自然矩阵异种移植的重新提出了更大的成功的机会对biopolymeric支架(5,6]。手术,到目前为止用于植入商用设备,是由经导管主动脉瓣置换术(泰薇)技术和开放的胸部经典方法。泰薇确实是新兴的使用特别是严重主动脉瓣狭窄患者和胸部打开多个并发症可能排除阀更换(4]。这些扩展移植是建立在心包组织。

粘多糖的相对数量和分布/蛋白聚糖(笑话/动力已报告显示不同类型的机械负荷(7,8]。的知识的组成和分布各种笑料和动力分配似乎是必不可少的理解之间的关系结构和力学的心脏瓣膜传单(9]。笑料和动力分配的影响细胞迁移、增殖,并分化是众所周知的,除了他们在形态发生的作用,血管生成,伤口愈合,免疫反应,维护组织的粘弹性和抗压缩和紧张(7,10,11]。

结构和功能的维护ECM诚信是最重要的阀门替代品的性能;因此,他们的消耗或变更可以负责贪污恶化[12]。

重复是能够吸收大量的水在组织矩阵,由于高浓度的负电荷和亲水性。这个原因导致考虑他们作为基本组件的机械行为,鉴于能力水合物松质层(减少剪应力与阀cuspal挠曲函数),和吸收压缩部队减少翘曲在弯曲(13- - - - - -16]。此外,高负电荷可以减少通过螯合钙离子钙化过程。这些观察表明,石斑鱼的损失可能会戏剧性地妥协机械功能,结构,和/或营养不良的发病bioprosthetic心脏瓣膜钙化[17,18]。

失去笑料被描述在两个固定的组织,在准备bioprostheses,在低温贮藏原生组织(19和可能的后果,贪污的性能。报告描述阀的搞笑方式很大程度上被称为瓣膜,组织工程心脏瓣膜(TEHVs) [14,16,19),而只有少数调查有关GAG分布在本机阀(20.- - - - - -22)和他们的精细结构。张口器的结构属性,如硫酸盐化作用的程度和模式,电荷密度和差向异构化作用的糖醛酸一半被认为是关键的功能和细胞信号(23- - - - - -25]。体内每一个都可以调制调解一些生物过程,促进不同ECM分子和细胞的相互作用。最近,我们报道的影响洗涤剂细胞移除基于结构组成分布和水化在主动脉和肺动脉心脏瓣膜管道突出相关损耗的笑话(26]。本研究重点是最丰富的精细结构分析galactosaminoglycans (GalAGs),即硫酸软骨素(CS)同分异构体。本研究的目的是描述的分布以及精细结构GalAGs在本机和脱细胞猪心脏瓣膜和心包由于其广泛使用在心脏瓣膜置换bioprosthetic材料。此外,我们测试了decellularized-treated心包的力学性能及其propension体外播种成纤维细胞重新填充。

2。材料和方法

2.1。化学物质

标准准备ΔDi-nonS_cs,2-acetamido-2-deoxy-3-0 - (4-deoxy -α-L-threo-hex-4-enopyranosyluronic 4-d-galactose酸);ΔDi-mono6S 2-acetamido-2-deoxy-3-0 (4-deoxyα-L-threo-hex-4-enopyranosyluronic 6-o-sulpho-d-galactose酸);ΔDi-mono4S 2-acetamido-2-deoxy-3-0 (4-deoxyα-L-threo-hex-4-enopyranosyluronic酸)4-o-sulpho-d-galactose都购自Seikagaku(日本东京);ΔDi-nonS_哈,2-acetamido-2-deoxy-3-O - (4-deoxy -α-L-threo-hex-4-enopyranosyluronic 4-d-glucose酸);ΔDi-mono2S 2-acetamido-2-deoxy-3-O (4-deoxy-2-O-sulphoα-L-threo-hex-4-enopyranosyluronic -D-galactose酸);ΔDi-di(2、4)年代,2-acetamido-2-deoxy-3-O——(4-deoxy-2-O-sulfo -α-L-threo-hex-4-enopyranosyluronic 4-o-sulfo-d-galactose酸);ΔDi-di(4、6)年代,2-acetamido-2-deoxy-3-O——(4-deoxy -α-L-threo-hex-4-enopyranosyluronic酸)4,6-O-sulpho-D-galactose买来Dextra实验室。木瓜蛋白酶和木瓜乳胶(EC 3.4.22.2),软骨素ABC裂合酶变形杆菌属寻常的AC裂合酶(EC 4.2.2.4),软骨素节细菌属Aurescens(4.2.2.5)AMAC(> 98%),冰醋酸,醋酸钠,氯酸,DMSO溶液(99.9%)、钠cyanoborohydride,半胱氨酸,氯化钠,EDTANa₂都从Sigma-Aldrich获得。丙烯酰胺和N, N′-methylenebisacrylamide来自BioRad, tem(99%),和过硫酸铵(98%)从Sigma-Aldrich购买。DEAE Sephacel Amersham生物科学。所有其他化学物质的分析试剂级。

2.2。收集和组织分析

从10-12-month-old猪心猪体重从160到180公斤获得当地屠宰场。2小时内死亡,12切割心脏瓣膜管道,主动脉和肺动脉根部(AR和公关),以及一个pericardia池(),收获和脱细胞根据先前detergent-based过程描述(26]。的心包组织分为2部分。一个被认为是控制和其他接受去细胞。阀门管道被分为2组:12 ARs和12 PRs;每组6个样本被认为是控制和被称为NT和6样品脱细胞Triton x - 100和胆盐和钠称为TriCol。

NT样品在等渗盐水冲洗并立即处理。简而言之,TriCol样本中提取低渗的溶液中使用1% (w / v)特里同x - 100存在的蛋白酶抑制剂(PI)在4°C。治疗后高渗条件下,组织在10毫米钠提取胆盐在室温下(26,27]。大量泥沙洗涤剂去除后,每个AR和公关样本切成三个区域对应:主动脉和肺动脉壁,窦区域和传单。从pericardia脂肪坚持被温柔的剥落。湿重的每个阀门管道组件和心包样品确定后轻轻地用滤纸吸去3号(147年绘画纸过滤器纸)。阀和心包剁碎组织脱水有20卷的丙酮4°C 24 h,脱脂20卷的氯仿:甲醇(2:1,卷/期)在4°C 24 h,干24 h 60°C在3300×g离心后15分钟,最后重(dry-defatted组织(DDT)重量)。

2.3。总笑话的提取和纯化

滴滴涕(100毫克)水化24 h在4°C 0.1醋酸钠,pH值6.0,包含5毫米半胱氨酸和5毫米乙二胺四乙酸(每克DDT 37卷)。然后,木瓜蛋白酶(0.3 U /毫克的DDT)添加到混合物,这是在孵化56°C下48 h温和的风潮。摘要被离心澄清(9000 g×20分钟+ 4°C)。消化上层清液加载在(diethylamino)乙基纤维素列(0.7×6厘米,2.3毫升),平衡与50毫米醋酸钠,pH值6.0。列然后用50毫升的缓冲和筛选了两步盐梯度(0.55和1.0 M氯化钠)。分数为1毫升hexuronate内容的收集和化验了苦涩和缪尔的方法,利用葡萄糖醛酸内酯作为标准(28]。总GAG浓度估计加法两个洗脱步骤的内容。分数包含石斑鱼从洗脱步骤都汇集并使用4卷冷绝对乙醇沉淀。混合了隔夜−20°C,和被离心分离,沉淀用乙醇洗两次,然后晒干。

2.4。Fluorophore-Assisted碳水化合物电泳(脸)分析

脸被用来分析不同插科打诨的数量和精细结构类,主要是HA和软骨素/ dermatan硫酸盐(c / d)。这种技术可以快速提供关于GalAGs硫酸盐化作用和iduronation模式的特点,提供线索的识别特定的后卫在瓣膜组织。所用的酶降解的CS同分异构体属于家族chondro / dermato裂解酶。Chondroitinase ABC劈开己醣胺之间的糖苷键和葡萄糖醛酸酯(GlcA)降解透明质酸(HA)和硫酸软骨素同分异构体(CS A、C C和d),生产含有二糖单位α,β不饱和hexuronic酸:ΔDi-0S_哈,ΔDi-0S_CS、ΔDi-mono4SΔDi-mono6S。Chondroitinase AC二世作用于相同的债券,但这是无法坚持己醣胺之间的糖苷键,iduronate (IdoA),所以它完全降解CS连锁店,在某种程度上,DS的。在本文,CS的定义是只含有葡萄糖醛酸酯,而DS被定义为包含一定数量的iduronate。

干笑话于100年解散μL(100毫米醋酸铵,pH值8.0。单独进行消化和软骨素ABC和AC二裂合酶在37°C进行24 h,使用0.1 U / 100μg hexuronic酸。消化混合物煮1分钟灭活酶,在11000 g×5分钟离心机,vacuum-dried。乳沟可以自由组织暴露减少酶荧光标记2-aminoacridone (AMAC)在还原胺化钠cyanoborohydride (NaBH的存在₃CN) [29日,30.]。这种方法允许减少的标签结束后获得的不饱和二糖酶促降解插科打诨的连锁店,大幅提高灵敏度的各种分析技术用于识别和定量的笑话30.,31日]。

简单地说,40μL(12.5毫米AMAC在冰醋酸溶液/ DMSO (3: 17 v / v)添加到冻干样本整除,和样品在室温下培养10 - 15分钟。然后40μL (1.25 NaBH₃CN在超纯水被添加到每个样本,和混合物孵化为4小时45°C。衍生化后,20μL(甘油(最终浓度20%)电泳之前添加到每个样本。页面执行根据Karousou et al。31日),Mini-Protean II细胞垂直板凝胶电泳仪(Bio-Rad)。电泳是在0.15 Tris-borate, pH值8.8,在400 V和4°C。凝胶在紫外线扫描框使用CCD相机(凝胶Doc XR系统)和分析数量一个4.6.3 Bio-Rad实验室。定量Δ-disaccharides, CS校准曲线是由商业硫酸软骨素受到软骨素ABC和AC裂合酶治疗和衍生化过程。

葡萄糖醛酸酯的比例iduronate含有二糖和4-sulfation 6-sulfation计算。

GAG类水平从每个样本的脸被规范化DDT重量估计组织浓度。

2.5。隔离和播种TriCol-Treated心包牛成纤维细胞

牛成纤维细胞被隔绝牛心包2毫克/毫升二胶原酶消化和培养在DMEM玫瑰(美国圣路易斯σ)修改(10%的边后卫,1%谷氨酰胺,1%青霉素、链霉素)在37°C和5%的公司₂。细胞被留在文化到第三段。

播种进行1.77厘米²装有猛的TriCol-treated心包样本24-well平bottom-culture板(美国新泽西州BD)。暂停750000细胞/厘米²1毫升DMEM玫瑰(美国圣路易斯σ)修改(10%的边后卫,1%谷氨酰胺,1%青霉素、链霉素)被分发到每个心包样本。经过7天的文化孵化器,标本收集处理和组织学评价。

2.6。组织学染色

评估存在,表面扩散和渗透的成纤维细胞体外培养7天后TriCol-treated心包,标本是嵌入在最佳切削温度介质(10月Bioptica、米兰、意大利),切割8点μm和苏木精和伊红染色(H和E)(快速冰冻切片工具,Bioptica、米兰、意大利)。

2.7。机械测试

应力-应变测试的本地和脱细胞牛心包进行张力计Zwich Z0.5 (brgger HSG / ETK)。对本地和TriCol-treated心包,骨头状样本从心包切除区域面临的左心室前壁和室间隔与主轴正交。标本的面积的控制是一个矩形,长度为34毫米和6毫米的宽度。试样的厚度测量与数字测厚仪,用于计算横截面积。机械测试是在生理溶液RT执行,每样30 mm的伸长/ m应用将组织破裂。数据的伸长和收集每一秒所施加的力。

2.8。统计分析

数据报告为均值±标准差或总数和相对频率。比较两组学生的t以及执行。的值被认为是具有统计学意义。分析与微软进行SPSS 11.0和SigmaStat 3.11.0软件。

3所示。结果

的三个渠道组织(传单、窦和墙)NT AR和公关,总笑话的微分浓度(规范化DDT)反过来深感在心包(表不同1)。特别是在AR、传单的插科打诨内容和窦相似和动脉壁的三倍。然而,在公关呕吐两次传单的内容发现窦和肺动脉壁。否则,通过比较两个valvulated管道,插科打诨浓度在AR传单了两次,在公关传单,在主动脉壁是类似于肺动脉壁。反过来心包的插科打诨内容占大约一半的动脉壁valvulated渠道。

TriCol-based去细胞过程产生笑料的相关损失。相对于本地主动脉瓣,插科打诨的内容在传单TriCol-decellularized标本降低了72%,69%在窦,动脉壁的52%。肺动脉瓣,在传单总呕吐减少49%,53%在窦,33%在墙上。在心包样本,去细胞总插科打诨的浓度降低了39%。

已经报道在之前的文献[26),呕吐分布部分是不同的在每个不同的部分(传单、窦壁)的NT AR和公关。在这两个渠道硫酸软骨素(CS)同分异构体和透明质酸是存在于最大的比例,透明质酸表现出减少梯度从传单到动脉壁。此外,在传单和鼻窦的阀门CS同分异构体组成一个缓慢的迁移CS,所评估的醋酸纤维素电泳的免费完整的多糖。

在心包,呕吐类中最大的比例是dermatan硫酸(DS),与非常低的大量的透明质酸,评估不连续电泳完整的链(数据没有显示)。

3.1。GAG结构分析

因为商品的相对比例在鼻窦和本机心脏瓣膜的传单和心包非常低,我们专注于CS同分异构体的结构表征纯化从NT和TriCol样本。脸分析使我们能够检测mono和di-sulfated CS-derived双糖,也从CS nonsulfated之间的歧视形式发布的同分异构体与HA(图1)。Δ-disaccharides在猪的心脏瓣膜的分布是相似的在每个选定的部分主动脉和肺动脉导管,而心包组织含有大量的ΔDi-mono4S和ΔDi-diS nonsulfated和6的比例非常低硫酸Δ-disaccharides(图2)。

Δ-disaccharides分布没有明显的变化在每个样本去细胞后,即使在主动脉传单和心包损失似乎影响主要公顷。

数据分析在ABC / ACII解聚作用显示,阀门传单和鼻窦CS是galactosaminoglycan出现在最大的比例,而心包组织几乎完全DS(图3)。

统计分析的结果相对于GalAG结构特征在本机和脱细胞阀和心包表明总含量不会产生的损耗分布的显著变化CS同分异构体。从CS的百分比nonsulfated双糖同分异构体被发表在表2。有趣的是,在under-sulfation程度显著差异检测本机主动脉和肺动脉瓣管道相比,传单和鼻窦。

额外的数据差向异构化作用和硫酸盐化作用的CS模式同分异构体计算综合在本机和治疗(表样本3)。主动脉传单和窦显示更高比例的CS对肺的,价值是相反的,在动脉壁,而在心包组织,正如我们已经提到的,主要的CS异构体是DS。

3.2。组织学

H和E染色突出的居民细胞牛心包TriCol治疗后(图4 (b)(图)相比,本地组织4(一))。结果矩阵的胶原纤维束周围展出许多空白领域表现出更定义波浪模式(即使部分缩水)对本机样本。播种后成纤维细胞并坚持七天,拥挤的心包表面,开始殖民底层detergent-treated矩阵(图4 (c))。此外,胶原纤维束显然恢复了形态学特征接近原生的样本。

的倾向TriCol-treated猪心脏瓣膜传单由体外的细胞重新填充之前已经报道过(27,32]。

4所示。机械测试

典型的应力-应变图本机和脱细胞心包样本报道在图5。承载纤维组成部分心包治疗似乎是张拉低应变对本机的样本是部分调整的方向的压力。然而在其线性部分的斜率图相似在准备即使TriCol样本的断裂载荷占大约一半的本地的。

的机械性能TriCol-treated瓣膜传单从猪曾被报导过27)不明显不同于未经处理的样品虽然圆周样品表现出更高的可扩展性和趋势降低20%(大约10%)刚度。

5。讨论

最近的去细胞研究组成我们的离子和非离子去污剂显示良好的细胞清除能力与保护的主要结构性ECM分子虽然离子洗涤剂如十二烷基硫酸钠(SDS)和钠脱氧胆酸盐(DOC)可能以某种方式修改生成的脚手架矩阵(33,34]。据报道,尤其是采用TriCol过程彻底删除α加抗原负责iperacute拒绝异种的移植,并可能为慢性炎症引起bioprosthetic设备处理戊二醛(35]。

然而,石斑鱼的损失去细胞后可以对ECM的结构有很深的影响。事实上,石斑鱼的提取可能影响阀门通过引入抗弯刚度的力学行为,厚度减少,有利于提高组织Ca^{2 +}内容。所有这些变化在ECM成分可能会导致阀功能或直接在阀故障的问题。摘要fluorophore-assisted碳水化合物电泳(脸)被用来提供详细的信息关于呕吐分布以及数量和精细结构的各种笑话猪血管组织(主动脉瓣、肺动脉瓣和心包)用作心脏瓣膜移植异种移植。

这项研究表明,石斑鱼的内容和分布在本地主动脉瓣、肺动脉瓣,心包非常不同。在阀门管道水平和构成笑料是有针对性的。传单,体验压缩,含有最高浓度的笑料,大量的HA和under-sulfated CS。石斑鱼的量化和描述猪阀门管道的脸很大程度上同意我们之前的结果通过分析完整的多糖(26]。心包组织包含相对较少的笑料,但更高比例的dermatan-4-sulfated和dermatan oversulfated。尤其是oversulfation水平已经明显高于报告oversulfated DS从其他猪组织(例如,达10 - 20%的皮肤)进而表现出显著HC-II-mediated抑制凝血酶活性,36]。值得注意,oversulfation水平在这里找到与DS从海洋的海鞘(50 - 70%)也对其凝血酶抑制活性研究(37]。所有可以背后的基本原理仍然无法解释低thrombogenicity心包瓣膜异种移植的潜力等慢性抗凝治疗的患者(38]。此外,这一发现是在良好的协议与公布的数据描述的低分子量dermatan硫酸盐在牛心包组织中蛋白聚糖(39]。丰富的特定的笑料和动力分配不同根据不同生物组织的需求。在例子中,硫酸dermatan(主要是4-sulfated)后卫decorin和实验调节胶原原纤维的形成和方向,因此组织抗拉强度,而透明质酸(HA),而不是一个核心蛋白共价结合,使陷入大量的水来创建一个膨胀力(40,41]。推测,水合物松质层的能力是在阀功能,减少剪切应力和带负电荷的插科打诨的存在分子可能通过螯合钙离子减少钙化,从而防止羟磷灰石的成核(13,14,42]。此外,它被认为更容易去细胞处理提取透明质酸和软骨素/ dermatan-6-sulfate,它存在于组织的透明质酸的聚合和versican PG (43]。这些观察表明,石斑鱼的损失可能是至关重要的发展新的bioprostheses。

我们的结果显示,有一个笑话有关提取后TriCol去细胞过程,但是它没有选择性,唯一例外的HA主动脉传单和心包。分布在维管组织后卫和笑料据报道复杂,地区和分层的,与不同的机械环境(11),组织工程心脏瓣膜来说有着重要的意义,bioprosthesis发展。尽管这些成分的差异可能会出现相当微妙,如硫酸的程度和位置和5′的程度和位置差向异构化作用在硫酸插科打诨链,这些优良的角色可能有重要的生物结构差别矩阵结合位点等其他组件或信号细胞分化除了对脚手架thrombogenicity其可能的影响。仔细评估可能性ΔDi-mono4S和ΔDi-mono6S内容的组织是很重要的考虑到修改ΔDi-mono4S /ΔDi-mono6S比和nonsulfated比硫酸石斑鱼被描述在衰老和疾病。C4S / c6率具有重要的生物意义;在人类中,逐步降低肺动脉,髂动脉和主动脉44]。此外,相对含量的人类主动脉(C4S减少约5倍45和脑动脉46)与衰老和C4S / c6比率减少特别是与动脉粥样硬化发展(47]。

此外,这个比例可能会收集更多的信息关于机械行为,因此,用于假设相关的阀门类型的后卫在插科打诨类浓度和精细结构特征(10,11]。

H和E染色显示TriCol过程实际上是把细胞从本机心包而产生的矩阵适合细胞的重新发现。成纤维细胞坚持心包表面,开始,后7天文化,传播到潜在的细胞外基质。移除细胞做了部分修改本机心包的机制,否则兼容的特性将使阀门的替代品虽然添支架的最终机械特性仍有待探索。作为一个整体TriCol-decellularized猪心脏瓣膜和牛心包出现一种很有前途的材料轴承的未来发展潜力的组织工程心脏瓣膜支架能够recellularized由病人自己的细胞。

未来的研究将检查阀内的固有复杂性组织,由于组织层,机械力量,矩阵组成及老化的影响,也不同石斑鱼的功能特征,可能会影响正常的阀门的功能和心血管组织的选择候选人产生最好的组织工程心脏瓣膜支架的发展。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者希望感谢墨尔本大学的爱德华·詹姆斯Buratto先生对本文的科学审查和Nvt Jotec (Hechingen、德国)处理机械测试仪器设施。这项研究受到了基金会银行di萨丁岛,萨萨里,意大利,从基金会Cassa di Risparmio di帕多瓦e罗维戈(意大利核心项目)。