文摘
利什曼虫物种的病原体leishmaniases,被忽视的热带病的频谱。无鞭毛体阶段寄生虫存在于巨噬细胞清除宿主因素为生存,例如,利什曼虫物种利用主机鞘脂类合成复杂的鞘脂类。在这项研究中l .墨西哥内吞作用是调节在无鞭毛体显著,表明鞘脂类清除可能会增强。然而,抑制宿主鞘脂类生物合成没有显著影响巨噬细胞细胞株内无鞭毛体扩散。此外,感染本身并不直接影响宿主生物合成。值得注意的是,相比之下l .主要,l .墨西哥无鞭毛体表示拥有一个完整的生物合成途径表明回收鞘脂类可能是不必要的扩散。这表明新旧世界物种与巨噬细胞相互作用不同的主机。这将需要考虑当目标利什曼虫鞘脂类生物合成途径的新疗法。
1。介绍
利什曼虫物种是昆虫媒介传播kinetoplastid原生动物病原体引起广泛的被忽视的热带病(leishmaniases-cutaneous黏膜与皮肤的,和内脏)在人类在全球范围内。此外,传播和疾病严重程度加剧了地位的重要合并感染艾滋病患者(1]。利什曼虫物种展览digenetic生命周期:(a)现有鞭毛在沙蝇promastigotes向量;(b)昆虫叮咬和吞噬细胞吸收由专业,特别是巨噬细胞,分化成aflagellate无鞭毛体形式。在寄生虫宿主巨噬细胞内酸性内遍布,fusogenic, endosome-derived吞噬溶酶体(2]。这个舱相交phagosomal和autophagosomal途径意味着寄生虫获得营养丰富的混合造成退化吞噬大分子裂解环境内的吞噬溶酶体。然而,居住在这样一个隔间也可能导致接触组件的主机主要组织相容性复合体(MHC),随后的巨噬细胞激活,和寄生虫杀死。为了克服某些种类的利什曼虫隔离和降低MHC分子(3,4];通过内吞作用可能发生这种情况虽然没有特征的机制。内吞作用也是营养的过程可以采取到寄生虫,例如,l . amazonensis据报道无鞭毛体胞饮吞噬溶酶体的转铁蛋白(5]。然而其他物种,包括l .墨西哥没有显示出这种行为(6]。低密度脂蛋白(7和血红蛋白8也被证明是内源性的利什曼虫promastigote形式。
鞘脂类是两性分子的脂质鞘氨醇骨干组成的长链脂肪酸和极地酒精作为附件。神经酰胺是一种修改的鞘脂类,函数作为第二信使在无处不在的,真核生物的信号机制。修改(复杂)的鞘脂类的主要组件外传单真核等离子体膜被认为是参与,固醇,microdomains或脂筏的形成。筏功能多样化的过程提出了油脂修改贩卖两极分化的蛋白,信号转导复合物的组装(9]。第一,病原反应,酶在鞘脂类的生物合成是丝氨酸palmitoyltransferase (SPT)。SPT触媒作用L-serine的凝结和棕榈酰辅酶a 3-ketodihydrosphinganine。随后,N乙酰化sphingoid基地的内质网(ER)导致神经酰胺的形成,它可以转化为复杂的鞘脂类(例如,鞘磷脂SM或肌醇phosphorylceramide-IPC)通过鞘脂类合成酶。动物的鞘脂类合成酶,SM合成酶(SMS),转移的磷酰胆碱磷脂酰胆碱(PC)神经酰胺给SM;酵母相比,植物,kinetoplastid原生动物寄生虫利什曼虫利用IPC合成酶催化形成IPC通过转让phosphorylinositol磷脂酰肌醇(PI)(发朵)神经酰胺(10]。这种非哺乳类酶一直建立作为抗真菌药物目标(11),最近,鞘脂类合成酶锥虫属brucei(kinetoplastid相对的利什曼虫)已被证明是至关重要的12,13]。
有趣的是,sphingoid基础和神经酰胺的生物合成前体的复杂的鞘脂类,缺席和不必要的扩散l .主要吞噬溶酶体在一个模型中无鞭毛体动物系统[14,15]。然而,intramacrophage无鞭毛体合成复杂的鞘脂类IPC新创从选择利用前兆,主机资源和维持这种脂质物种promastigotes(相当于细胞水平15]。它已被证明l . donovani刺激宿主巨噬细胞移植神经酰胺的生产,IPC合成酶的底物(16)和SPT的下游产品。此外,最近的研究已经确定了l .主要SMase (LmjISCL)和显示它的致病性动物模型是必要的。这表明,从主机SM神经酰胺的生成,通过LmjISCL,是吞噬溶酶体中扩散的关键17,18]。综上所述,这些研究表明l .主要(也许l . donovani另一个旧世界的物种)进行主机鞘脂类为无鞭毛体增殖,产生神经酰胺致病性和IPC生物合成。
如无鞭毛体利什曼虫,细菌病原体柯克斯氏体属burnetti(Q热病aetiologic代理)复制在一个内吞作用的隔间酸化和食的鞘脂类SM质膜通过内吞作用[19]。在这个工作我们确定利什曼虫雇佣了一个类似的策略来获取和利用重要主机鞘脂类。
2。材料和方法
2.1。细胞培养
利什曼虫墨西哥(MNYC /商务/ 62 / M379) promastigotes维持在26°C在施耐德的媒体(西格玛奥德里奇)pH7补充15%胎牛血清(的边后卫,Biosera有限公司)。Promastigotes分化无鞭毛体形式在施耐德的媒体有20%的边后卫在pH值5.5和32°C根据公布的协议(20.]。连续的小鼠巨噬细胞细胞株RAW264.7保持在DMEM (Gibco-BRL)和10%的边后卫,在37°C和5%的公司2。myriocin细胞毒(西格玛奥德里奇)成立使用AlamarBlue(表达载体)试验根据制造商的协议,如前所21,22]。的功效myriocin确认使用酵母扩散试验(23]。
2.2。代谢标签
l .墨西哥无菌promastigotes和无鞭毛体(107毫升−1Schneider)在无血清培养的媒体30分钟在标签和5一样μ米的BSA共轭BODIPY FL C5神经酰胺(表达载体)26°C和32°C,分别为2小时。Promastigote寄生虫也贴上了16小时DMEM (ICN)补充10% FCS (Gibco BRL)和mCi 20毫升−1[myo -3H]肌醇(102 Ci更易−1Amersham) [14]。serine-containing脂质分析无菌无鞭毛体(毫升−1)在MEM鹰孵化45分钟(西格玛奥德里奇),那么标记8个小时在同一介质包含20 mCi毫升−1(3H] -L-serine (20 Ci更易−1;ICN) [14]。脂质提取和分析如前所述23]。
2.3。内吞作用分析
l .墨西哥使用温暖的无血清细胞被洗了三次媒体和使用纽鲍尔血球计算。107细胞培养与50μgmL−13 k 500年德克萨斯红葡聚糖(表达载体)μL无血清媒体2小时32°C。控制孵化在冰。细胞随后被洗了5次与冰冷的PBS和3.7%甲醛固定。洗后,细胞在500年resuspendedμL PBS和荧光量化使用板读者(FLx800TM BioTek;590/20交货645/40 Em)。通过荧光显微镜观察细胞表明了右旋糖酐的寄生虫。
2.4。巨噬细胞感染
1×105RAW264.7小鼠巨噬细胞在DMEM允许在每个的坚持盖玻片24-well细胞培养板(Nunc),然后孵化24小时在适当的媒体(DMEM Nutridoma与10%的边后卫或1%,罗氏公司)有或没有myriocin。l .墨西哥无鞭毛体被应用在一个比10:1在媒体和感染任48小时32°C和5%的公司2在适当的地方,媒体的日常变化myriocin。
2.5。表达分析
寄生虫变性溶菌产物分离和免疫印迹(描述24)和过滤器;探讨了鼠标反LmjLCB2或兔子反LmjNMT主要多克隆抗体(141:1000年,其次是辣根peroxidase-conjugated二级抗体(Sigma-Aldrich)。使用ECL复合物检测系统(Amersham淀粉微球)。总RNA信使RNA分析,从等效的48小时内感染,或未感染,RAW264.7细胞提取使用RNeasy工具包(试剂盒)根据制造商的协议。DNase治疗后(RQ1 Promega)互补脱氧核糖核酸合成使用ImProm-II逆转录系统(Promega)根据制造商的协议。定量PCR在执行Rotor-Gene RG3000 (Corbett研究)使用SYBR绿色启动Taq准备混合(西格玛奥德里奇)根据制造商的指示。的小鼠MmLcb2(SPT的编码单元2)是放大使用底漆pair-5′AGGTGGATATCATGGAGAGA 3′, 5′GATCCAGTGTTCCTCGC 3′。参考基因,MmCasc3,使用引物如前所[放大25]。3日qPCR是一式三份和退火温度为52°C复制MmLcb2和55°CMmCasc3。
3所示。结果与讨论
3.1。内吞作用在Promastigote和无鞭毛体l .墨西哥
就像利什曼虫物种,锥虫属brucei(这将导致神经被忽视的热带病的非洲昏睡病)是一种kinetoplastid寄生虫。然而,而致病性无鞭毛体形式的利什曼虫物种的避难所内巨噬细胞,哺乳动物的形式t . brucei遍布在主人的血液细胞。这里必须避免免疫系统的全部力量,和转换的主要表面分子,可变表面糖蛋白(VSG),这是关键。内吞作用的VSG抗原变异的一个重要组成部分和免疫逃避。值得注意的是,在血液内吞作用的速度形式(BSF)t . brucei在昆虫阶段亦是10倍形式(PCF),和整个VSG外套每7分钟被替换(26]。这允许掩饰和结合抗体的降解和补充因素,这有助于保护独立生存的寄生虫的体液免疫反应。这种内吞作用upregulation推波助澜的增加表达的因素参与VSG的吸收及其随后的交易和处理(27,28]。在这项研究之前仍未知是否利什曼虫物种增加了他们的内吞作用对哺乳动物分化无鞭毛体形式。这可能是预测,以便观察吸收MHC和免疫逃避的6)或允许收购主机鞘脂类使用IPC合成(15,18]。
为了解决这个新的世界的物种l .墨西哥采用。不像l .主要这个物种可以promastigote和无鞭毛体生长阶段无菌细胞培养(20.)允许进行直接的比较分析29日]。利用量化内吞作用荧光标记的葡聚糖。此前,右旋糖酐已经证明了,通过内吞作用的途径l . donovanipromastigotes [30.]。这里,无菌细胞相当于promastigotes (noninfective,扩散效应-,感染性,nonproliferating metacyclics)和无鞭毛体标记在相同条件下(32°C血清媒体)。右旋糖酐是明显被promastigotes亦;然而无鞭毛体内源性的数量超过4倍(图1)。有趣的nondiving metacyclic形式展示类似的老年病的活动。
这些数据表明,内吞作用是无鞭毛体形式的监管,这可能是猜测,以促进有效的免疫逃避或衬底扫气进行了讨论。类似的内吞作用的活动水平的观察metacyclic promastigotes惊讶,他们明显静止(20.]。然而,一个可能推测,这表明,这个过程是在这个阶段获得的机械准备建立无鞭毛体感染哺乳动物宿主。
3.2。主机鞘脂类的生物合成的作用l .墨西哥入侵和扩散
调查IPC合酶的活动l .墨西哥、无菌promastigotes和无鞭毛体新陈代谢用荧光标记BODIPY FL-ceramide(图2)。两种细胞类型产生了与IPC comigrated标签产品,虽然在无鞭毛体是相对较低的水平反映了这种形式的增长放缓。这些数据表明,l .墨西哥有一个活跃的IPC合酶在这两个生命周期阶段,一样吗l .主要(15]。
正如上面所讨论的,主机必须获得的鞘脂类神经酰胺IPC合成酶的底物无鞭毛体l .主要(15]。支持这几项研究已经确定了宿主细胞鞘糖脂在intramacrophage无鞭毛体利什曼虫物种(31日- - - - - -33]。此外,据报道,fumonisin B1 (dihydroceramide合酶和神经酰胺合成的抑制剂)抑制intramacrophage的复制l . donovani(34]。利用myriocin(一个强有力的、特定的SPT抑制剂(35])主机合成鞘脂类的角色了l .墨西哥感染RAW264.7细胞,一个持续的小鼠巨噬细胞细胞系。无菌promastigotes的可行性和无鞭毛体(数据未显示)被50的存在影响μM myriocin如前所报道(36]。同样,在50 RAW264.7宿主细胞是可行的μM myriocin;高于这个水平导致分离的细胞组织培养(数据未显示)。
在这项研究中50μM myriocin用于RAW264.7细胞24小时之前的挑战l .墨西哥无菌无鞭毛体的比10:1。日常应用的药物感染被允许继续固定前48小时,染色,计数节中描述2。这个实验是在进行完整的存在(10%)血清或serum-reduced Nutridoma(1%)媒体。后者可用条件减少外源性鞘脂类的数量RAW264.7细胞和细胞内的寄生虫。两组条件下巨噬细胞感染的比例无鞭毛体由myriocin的存在(图未受影响3),平均每个宿主细胞(图的寄生虫数量4)。这些数据表明,鞘脂类的生物合成和外生鞘脂类不是中央的入侵和扩散l .墨西哥在RAW264.7macrophages。
同样,myriocin报道不抑制l .主要无鞭毛体复制在培养小鼠巨噬细胞15]。此外,不像l . donovani(34),具体的神经酰胺合成酶抑制剂fumonisin B1对intra-macrophage的增殖没有明显影响l .主要无鞭毛体(15]。总之,这些结果表明,宿主鞘脂类合成不扩散的核心l .主要或l .墨西哥巨噬细胞内无鞭毛体。然而,它仍有可能自由神经酰胺是由主机通过复杂的鞘脂类catabolism-a过程的监管l . donovani感染巨噬细胞(16]。在这项研究中巨噬细胞与myriocin preincubated 24小时在缺乏血清为了耗尽可用的主机鞘脂类寄生虫清除。然而,抑制的SPT的时间长度相当于这里采用的实验条件只会部分(~ 80%)损耗复杂的鞘脂类在CHO细胞(37]。这表明,预成型的复杂的鞘脂类在细胞膜稳定保持抑制后的一段时间新创合成。可能这样的脂质可以继续catabolised和回收无鞭毛体l .墨西哥。
3.3。宿主和寄生虫丝氨酸Palmitoyltransferase (SPT)表达在巨噬细胞感染
尤其是主持人新创鞘脂类合成期间监管l . donovani巨噬细胞内增殖(16,有可能是在类似的效果l .墨西哥感染可能会掩盖myriocin SPT抑制剂的功效。来测试假设增加主机鞘脂类的生物合成,通过调节生物合成的酶,是由寄生虫引起的,主机的水平MmLcb2(SPT的编码单元2)成绩单有或没有l .墨西哥使用实时qPCR建立了感染。需要做这个正常化参考;9个常用的参考基因RAW264.7细胞Casc3以前发现合适和足够的为此感染鸟型分支杆菌(25]。正常化,MmCasc3表达式,MmLcb2感染后48小时mRNA水平持平l .墨西哥(表1)条件下描述。这表明主机鞘脂类的生物合成是不能感染管制。
这些结果可能是惊讶,以前观察到的下调LmLCB2蛋白质l .主要无鞭毛体形式(14,38),加上维护IPC生物合成(15)和回收的要求分解代谢SM (17,18]。根据这些数据被选为检查的表达谱l .墨西哥SPT。利用交叉反应性反LmjLCB2抗体(14,39)的表达LmxLCB2探索利用免疫印迹(图5)。表达的结构上的水平N-myristoyltransferase (NMT)作为加载控制24]。
这表明,LmxLCB2,所以LmxSPT是既定的表示的整个生命周期l .墨西哥。这些数据已经被孤立的蛋白质组分析最近证实,intra-macrophagel .墨西哥无鞭毛体(40]。此外,代谢标签无菌无鞭毛体展示了氚化丝氨酸整合进主复杂的鞘脂类,IPC(图6)。
综上所述,这些数据表明这个新的世界物种有一个完整的和积极的新创鞘脂类的生物合成途径无鞭毛体阶段,这与旧世界l .主要(14,38]。此外,myriocin可能抑制的可能性Lmx在intra-macrophage SPTl .墨西哥无鞭毛体需要考虑与数据如图4。如果这种化合物能够访问和抑制寄生虫酶在这些化验,然后获得的结果可能意味着宿主和寄生虫SPT活动都是不必要的l .墨西哥扩散,类似的场景l .主要(15]。
3.4。总结
这些数据是第一个证明致病的内吞作用的速率,无鞭毛体阶段利什曼虫物种promastigotes亦与昆虫相比提高阶段。这是让人想起的情况t . brucei在分化,内吞作用是调节哺乳动物生物沙子饮用水过滤系统寄生虫为了促进免疫逃避(36]。这戏剧性的改编是通过增加表达的因素参与分子的吸收及其后续走私和退化27,28]。在利什曼虫物种的蛋白水解活性是高度分化期间监管从promastigotes无鞭毛体,这正值多泡溶酶体的外观(megasomes) [41]。这与主机MHC分子的吸收41),如下所示,内吞作用的增加。然而,不同于t . brucei没有已知的内吞作用分子机制研究利什曼虫物种已经证明任何增加微分表达式(24,42]。然而,RAB-like GTPasel .主要已被证明在mRNA水平增加了表达无鞭毛体形式,尽管这一因素的作用在细胞中是未知的(43]。
promastigotes和无鞭毛体l .主要(15),l .墨西哥能够合成的主要复杂的鞘脂类,IPC吗。旧世界l .主要没有能做到这一点新创SPT活动,因此观察到的内吞作用的增加活动相关的能力清除主机鞘脂类作为底物(15]?这里给出的数据表明l .墨西哥无鞭毛体可以入侵和扩散通常当主机鞘脂类生物合成受到抑制和/或外生的脂质(血清)来源时删除。这表明寄生虫也并非完全依赖于持续的主机鞘脂类合成,尽管仍然会残留一些主机复杂的鞘脂类,是足够的病原体。分析主机MmLcb2和寄生虫LmxLCB2表达式表明,感染不影响主机鞘脂类的生物合成和promastigote和无鞭毛体阶段l .墨西哥同样表达SPT,第一个酶在鞘脂类的生物合成40]。这是形成鲜明对比l .主要在哪里LmjLCB2了监管和不必要的发病机理和复杂的鞘脂类的生物合成14,38]。这意味着有深远的区别新旧世界物种之间的关系利什曼虫寄生虫和哺乳动物宿主细胞。进一步了解这些差异需要考虑脂生物合成的目标发展的新的治疗方法。
确认
这项工作是由一个伊拉克高等教育和科研奖学金z h·阿里,威康信托基金会度假奖学金c·r·哈丁和沃尔夫森研究所小额赠款奖:p·w·丹尼。作者也谢谢黛安·哈特和Jen技术支持和史密斯教授黛博拉(约克大学)反LmjLCB2和反LmjNMT抗体和有益的讨论。