文摘

翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)同事与微管(MT),然而,这种关联的细节是未知的。在这里我们分析TCTP MTs和中心体的关系非洲爪蟾蜍光滑的使用免疫荧光和哺乳动物细胞,标记TCTP表达式和immunoelectron显微镜。我们表明,TCTP associates MTs和中心体在纺锤体两极时检测到特异性的抗体,通过Myc-XlTCTP表达式非洲爪蟾蜍和哺乳动物细胞。然而,当抗体XlTCTP用于哺乳动物细胞,TCTP发现只在中心体。这些结果表明,不同的池TCTP可能是特定的,和助理,中心体。TCTP和双标签γ摘要电子显微镜的微管蛋白非洲爪蟾蜍光滑的oogonia显示的本地化TCTP的外围γ-tubulin-containing pericentriolar材料(PCM)包络中心体。TCTP在密切的附近,而不是直接在MTs非洲爪蟾蜍卵巢表明这个协会要求不明链接器蛋白质。因此,我们首次显示:(1)与中心体TCTP协会,(2)外围的本地化TCTP中心体和的关系γ-tubulin-containing PCM在中心体,(3)间接与MTs TCTP协会。

1。介绍

翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)是涉及广泛的细胞功能的多样性。它刺激细胞增殖、生长、生存和应激反应(1]。在高度增殖的细胞是非常丰富的,包括癌细胞。的兴趣TCTP近年来迅速增加,因为越来越多的证据在致癌作用的关键作用和罕见的肿瘤回归现象2,3]。最近,它是优雅的证明,TCTP表达式由p53和负调控反之亦然,TCTP负调节p53通过诱导细胞水平的退化引发了MDM2泛素连接酶(4]。证据之间的相互反馈TCTP和p53提供了额外的证据的重要性TCTP在癌症发展和进展/降级。TCTP也与细胞骨架和整个协会相关影响细胞形状、能动性、转移和侵略性的癌症。它已经建立,TCTP associates (MFs)和肌动蛋白微丝骨架MTs [5]。生化分析这些相互作用表明,最有可能的是,TCTP与MFs和MTs间接交互;然而,这些交互的细节尚不清楚(出处同上)。TCTP击倒大幅修改细胞形状和MFs和MTs架构(5,6]。TCTP行为与actin-binding蛋白质cofilin[竞争7]。因为cofilin促进肌动蛋白分解,与TCTP竞争可能导致增加细胞内肌动蛋白聚合TCTP较高水平。不太了解TCTP和MTs。我们之间的关系表明,TCTP和微管蛋白定位非洲爪蟾蜍和人类细胞非常相似,但是不完全相同表明“TCTP纤维”的存在与MTs以及TCTP-negative MTs的存在(5]。TCTP定位在有丝分裂纺锤体微管蛋白也不重叠localization-it更同质的模式,这表明只有一个族群的TCTP与MTs或者TCTP定位在附近而不是直接在MTs。另一方面,TCTP似乎强烈与纺锤体的两极(5]。这些观察表明,TCTP可能与MTs通过中间链接器蛋白质和TCTP也可能centrosome-associated蛋白质。我们在这里介绍的研究调查了这些假设。

2。材料和方法

2.1。组织培养细胞

XL2细胞系培养在l - 15中补充10%胎牛血清(FCS);全介质)和孵化25°C在空气中。海拉、NIH3T3 Cos7细胞保持在杜尔贝科的修改鹰中补充10%胎牛血清(FCS)和孵化公司37°C的5%2。媒体补充与青霉素(100单位/毫升)和链霉素(100毫克/毫升)。

2.2。免疫细胞化学

细胞的玻璃盖玻片固定在75%甲醇、3.7%甲醛,0.5 x PBS,或在3.7%多聚甲醛在1 x PBS 10分钟在室温和permeabilized有0.1%在PBS Triton X100 5分钟。用DAPI DNA可视化。多克隆抗体XlTCTP(雷恩在实验室生产)和HsTCTP (santa cruz)或鼠TCTP使用稀释的1:1000和1:100年,分别与隔夜孵化项目在4°C。反α微管蛋白(σ)和反β微管蛋白(Euromedex)稀释1:200。纯化anti-c-myc抗体(σ)稀释1:100。二次抗体(RITC共轭,1:1000稀释;分子探针)在室温下培养1小时。盖玻片是安装在Vectashield和检查使用徕卡DMRXA2荧光显微镜或徕卡共焦显微镜SP2。使用黑白照片拍摄COOLsnap ES相机(Roper科学),并使用Metamorph图像处理软件(通用成像)。

2.3。无细胞提取物,在体外纺锤体组装

抑制细胞生长的factor-arrested提取物(CSF提取物)准备被穆雷(8]。为在体外纺锤体组装,0.5μL rhodamine-labeled牛脑微管蛋白(细胞骨架)增加了0.2毫克/毫升和2μ精子头部的L ~ 1000核/的浓度μL添加到50μL(60 - 90分钟的提取和孵化21°C。纺锤波(15μL(提取)前缀1毫升BRB80缓冲区(80毫米K-Pipes, pH值6.8,1毫米EGTA MgCl和1毫米2)包含30%甘油、1%多聚甲醛,0.5% Triton x - 100和离心机(在室温下2300 xg, 30分钟)通过40%的甘油缓冲BRB80到玻璃盖玻片12-well盘子。他们固定通过添加1毫升冷甲醇(−20°C)在室温下10分钟(孤立的纺锤波)。然后固定主轴加工为免疫细胞化学TCTP使用anti-XlTCTP,观看和拍摄上面的细胞。

2.4。细胞转染

XL2和NIH3T3细胞的转染质粒编码非洲爪蟾蜍Myc-TCTP, 细胞被镀在玻璃盖玻片12-well盘子。细胞转染与0.5μ使用FuGENE 6 g的质粒DNA转染试剂(罗氏)后,制造商的指示。

2.5。小鼠卵母细胞

三个月大瑞士白化雌性腹腔内注射10 IU孕马血清促性腺激素(PMSG;Folligon Intervet、荷兰)刺激卵泡的发展。40 8 - 50两小时后女性被颈椎错位。成熟卵母细胞第一次减数分裂前期的被捕division-germinal泡阶段(问)从卵泡释放。卵母细胞被释放从积云细胞移液,然后培养2 h M2中包含牛血清白蛋白(BSA;4毫克/毫升)。卵母细胞减数分裂恢复,也就是说,接受胚泡崩溃(GVBD)在第一2 h在体外文化,被用于进一步的操作和为以下阶段:收集GVBD, MI, (GVBD后6小时)和信息产业部(20小时GVBD之后)。卵母细胞被固定在3.7%甲醛在PBS, permeabilized 0.01 Triton X100 PBS,并受孵化后免疫荧光XlTCTP抗体的存在,与组织培养细胞一样。

2.6。非洲爪蟾蜍光滑的蝌蚪卵巢和电子显微镜

麻醉的发展中卵巢被跟踪和无尾的幼蛙(阶段62 - 66年)的野生型非洲爪蟾蜍光滑的。卵巢被固定在TEM固定剂(2%甲醛、3%戊二醛、EM年级,Ted斗篷,雷丁,CA, 0.1钠甲次砷酸盐缓冲pH值7.3,Polysciences,沃灵顿,PA)包含10μ丹佛市m紫杉醇(细胞骨架)稳定微管和中心粒。提高中心粒的可视化,材料在0.5%醋酸双氧铀染色,和锇tetraoxide治疗省略。这导致了很轻的染色膜结构;然而,它允许高度对比中心粒和微管的可视化。嵌入和切片作为描述代码等。9]。Postembedding疣状使用anti-XlTCTP和反γ微管蛋白抗体进行所述Bilinski et al。10]。标签,然后在电镜下观察卵巢被固定。超薄部分(60 nm厚)收集在镍单槽网格(涂上formvar)和屏蔽2%牛血清白蛋白(BSA;σ)PBS和0.1% NaN3 30分钟,在4°C隔夜孵化后与主抗体(兔子anti-TCTP,或鼠标单克隆抗-γ微管蛋白[gtu - 88], ab11316 Abcam)稀释1:50−1:100年孵化解决方案(NaN3 BSA PBS, 1%, 0.1%)。在PBS几个洗之后,网格是孵化了两个小时,在室温下,用二次抗体(山羊anti-rabbit共轭18纳米金粒子或山羊anti-mouse共轭到10纳米金粒子,杰克逊ImmunoResearch实验室。)稀释1:100 - 1:200年孵化的解决方案。随后,网格在PBS最后在蒸馏水清洗。干燥后,部分与醋酸双氧铀及柠檬酸铅形成,认为JEOL 100 sx电子显微镜在80千伏。在控制实验中,部分治疗完全相同的如上所述,但是没有孵化的主要抗体。二次抗体还测试了之前大双标记实验。

3所示。结果与讨论

我们重点分析TCTP在有丝分裂纺锤体的定位,因为它允许我们研究协会同时TCTP MTs和中心体,位于纺锤体两极。Immunolocalization TCTP的有丝分裂非洲爪蟾蜍光滑的XL2细胞显示存在TCTP在浓度较高的有丝分裂纺锤体轴杆(图1(一))。纺锤体极积累TCTP也明显的纺锤波隔绝M-phase-arrested无细胞提取(图1 (b))。因为在有丝分裂非洲爪蟾蜍光滑的细胞和无细胞提取物,TCTP与中心体的纺锤体两极相关联,这表明TCTP可能centrosomal蛋白质。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
(e)
(f)
(f)
图1
免疫荧光定位TCTP非洲爪蟾蜍光滑的有丝分裂纺锤波使用XlTCTP抗体。(一)共焦段XL2细胞显示TCTP的存在在纺锤体两极纺锤体密度较高的。(b)分离轴形成的精子头CSF中提取。红色MTs沾罗丹明-β微管蛋白的提取、绿色TCTP XlTCTP抗体免疫荧光探测到。白色箭头指向纺锤体两极TCTP染色。蓝色的DNA与DAPI染色。可见黄色染色TCTP的纺锤体两极和缺乏TCTP主轴的剩余部分。(c)的共焦部分小鼠中期NIH3T3细胞染色与DAPI XlTCTP抗体(绿色)和DNA。注意,XlTCTP污渍完全两个不同的点对应的中心体,相对应的纺锤体两极。(d)共焦部分人类的海拉细胞中期。绿色与XlTCTP TCTP检测到抗体,蓝色的DNA。XlTCTP污渍两个纺锤体两极;细粒度的背景染色是在细胞质中也能看到。 (e) Human HeLa metaphase cell. Green TCTP detected with homologous HsTCTP antibody, blue DNA. HsTCTP stains the whole spindle. (f) Monkey Cos7 metaphase cell incubated with anti-rat TCTP antibody showing a very distinct staining of spindle poles. Bar is equal to 20 μm。

TCTP非常进化保守的蛋白质(11]。因此,我们测试了抗体针对不同物种TCTP非洲爪蟾蜍光滑的和哺乳动物细胞。令人惊讶的是,当我们使用多克隆抗体非洲爪蟾蜍光滑的TCTP (XlTCTP) TCTP检测小鼠NIH3T3和人类起源的海拉细胞(所谓的异种的或种间检测),我们总是看到一个非常明亮染色中心体的纺锤体两极(数字1 (c)和1 (d))。然而,当我们使用相应的抗体和细胞,也就是说,反TCTP抗体,检测人类海拉细胞TCTP,统一整个主轴的染色可见(图1 (e)),同意我们之前研究[5和盖和他的同事们的研究12]。当我们使用另一个不同的组合,也就是说,the-anti-rat TCTP抗体在猴子Cos7细胞中,我们也发现明确centrosomal染色(图1 (f))。这些观察结果表明,免疫的亚种群不同TCTP可能出现在人类和猴子细胞的有丝分裂中心体,同样的非洲爪蟾蜍光滑的细胞。

为了进一步阐明这些观点,我们表示Myc-tagged XlTCTP非洲爪蟾蜍光滑的XL2细胞(同源表达式)和在小鼠NIH3T3细胞(不同的表达式)和本地化的青蛙在这两类蛋白质重组细胞通过与anti-myc免疫荧光抗体。数据2(一)和2(b)显示的例子anti-Myc immunodetection XL2外生XlTCTP的细胞。在这些细胞中,我们总是观察MT-associated本地化和积累Myc-tagged XlTCTP小负区域周围的主轴(数据2(一)和2(b))。控制细胞表达Myc标签单独均匀染色(图2(c))。此外,在间期细胞XL2 Myc-XlTCTP被纳入不同的胞质纤维(图2(d))。Myc-XlTCTP表达小鼠NIH3T3细胞导致强大的本地化TCTP纺锤体两极;然而,我们从来没有观察到TCTP-negative区域相似的存在中可见XL2细胞(图1 (e))。在间期NIH3T3细胞表达Myc-XlTCTP青蛙TCTP成立MT-like纤维(图2(f))。这些结果表明,TCTP的确定位纺锤体的两极非洲爪蟾蜍光滑的在老鼠的细胞,但其定位略有不同的模式当immunodetection同源和不同的系统使用。因此,外源Myc-XlTCTP合并到有丝分裂XL2 pericentrosomal区域细胞,在细胞有丝分裂的鼠标,纳入整个细胞中心体。另一方面,XlTCTP可见的同质免疫荧光染色XL2细胞的纺锤体两极表明在整个XlTCTP中心体的存在。这表明,取决于物种或细胞类型,TCTP是本地化在中心体内的轴杆或在中心体pericentriolar材料(PCM)组成的特定蛋白质(包括γ微管蛋白)。


图2
Myc-XlTCTP的表达式非洲爪蟾蜍光滑的XL2细胞。(一)共焦段XL2细胞后期与高浓度的XlTCTP纺锤体两极(白色箭头)。(b)共焦段两个分裂XL2细胞与高浓度的XlTCTP纺锤体两极。(c)控制细胞有丝分裂XL2表达Myc标签。(d)间期细胞表达Myc-XlTCTP XL2。XLTCTP本地化在不同的纤维在细胞质中。(e)有丝分裂细胞小鼠NIHT3T表达Myc-XlTCTP。高浓度XlTCTP存在的纺锤体两极(白色箭头)。(f)间期小鼠NIH3T3细胞表达Myc-XlTCTP。注意,XlTCTP形式MT-like纤维在细胞质中。 Bar is equal to 20 μm。

小鼠卵母细胞没有中心粒(13,14),但他们有不规则的疫源地的PCM纺锤体两极MI和信息产业部减数分裂的阶段15- - - - - -17]。因为小鼠卵母细胞PCM但没有中心粒,我们使用成熟小鼠卵母细胞分析是否TCTP associates PCM疫源地。当我们染色在体外与anti-XlTCTP成熟小鼠卵母细胞,我们发现典型的PCM疫源地(图的图像3)而不是整个主轴染色观察到当anti-rabbit TCTP抗体用于小鼠卵母细胞(18]。问阶段卵母细胞第一次减数分裂前期的被捕,几个不同的焦点可能会检测到本地化主要在卵母细胞细胞核(称为胚泡的问;图3(一个)),从而显示的数量和分布模式典型PCM (19]。后GVBD(胚泡崩溃)和在MI和信息产业部,TCTP-positive疫源地的极化相对广泛的纺锤体两极(数字3 (b),3 (c),3 (d))。显示出相同的极化PCM疫源地Schatten et al。16],马络et al。17]。总的来说,这些结果表明,TCTP检测到的分组人口anti-Xenopus TCTP抗体的确PCM焦点所在。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
(e)
图3
免疫荧光定位的TCTP anti-XlTCTP抗体在小鼠卵母细胞成熟。问:前期我抓卵母细胞,GVBD:成熟的开始,MI和信息产业部:在MI和MII期卵母细胞减数分裂,分别控制PI:控制信息产业部卵母细胞染色preimmune血清。XlTCTP抗体染色PCM在所有阶段的成熟小鼠卵母细胞。DNA(蓝色)与DAPI染色。酒吧= 40μm。

小鼠卵母细胞相比,非洲爪蟾蜍光滑的oogonia(或巢细胞)形成的典型的中心体中心粒和PCM (9]。我们使用这些细胞分析TCTP本地化与MTs和中心体电子显微镜检测然后使用光学显微镜免疫荧光法和电镜下观察。免疫荧光使用反β巢细胞微管蛋白和anti-TCTP抗体显示,这两个蛋白的分布类似于他们在XL2细胞的分布,也就是说,在大多数情况下这两个蛋白质与,但MTs的分组人口缺乏TCTP也发现,和一些TCTP-rich地区缺乏β微管蛋白(图4(一)和4 (b);参见[5详情]类似的本地化TCTP和MTs XL2细胞)。与anti-XlTCTP抗体标记然后电镜电镜下观察表明,TCTP总是本地化的距离大约24海里(MT)的直径太,但从未直接在MTs(图4 (c))。这表明TCTP并不直接与MTs,而是由一些中间体作为连接器。Immunolocalization的β微管蛋白和TCTP在有丝分裂非洲爪蟾蜍光滑的oogonia显示中期,整个轴区域(与反检测β微管蛋白抗体)严重染色(图5(一个)),而在末期,tubulin-positive中体不利于TCTP(图5 (b))已经显示在非洲爪蟾蜍光滑的XL2细胞(5]。为了方便识别中心体在电镜水平和准确地识别领域的PCM,我们发现反γ微管蛋白抗体与二次抗体共轭10纳米金颗粒和anti-XlTCTP抗体与18个二级抗体结合纳米金粒子。这种双重免疫染色显示γ微管蛋白存在于附近的中心体在一个不规则的PCM云,TCTP是出现在PCM(图周围的一层6,插图在右下角显示了分布示意图γ微管蛋白和中心体TCTP域用星号标记)。因此,TCTP associates的PCM中心体,但它并不colocalizeγ微管蛋白。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图4
MTs和TCTP非洲爪蟾蜍光滑的蝌蚪卵巢。间期细胞。上面板上,左:β微管蛋白,右:TCTP本地化。Anti-XlTCTP用于本地化。白色箭头指向积极对细胞结构β微管蛋白和TCTP。双箭头指向β-tubulin-positive和TCTP-negative纤维。箭头指向TCTP-positive和三倍β-tubulin-negative纤维。酒吧等于20μm;底板:电子显微镜黄金immunolabeling TCTP(黑粒子中心)附近的MTs(黑色箭头)。酒吧= 100海里。
(一)
(一)
(b)
(b)
图5
MTs和TCTP在有丝分裂非洲爪蟾蜍光滑的oogonia。左:β微管蛋白,右:蝌蚪oogonia TCTP本地化。Anti-XlTCTP用于本地化。上面板:中期细胞。左:有丝分裂纺锤体可视化β微管蛋白染色(白色箭头)。右:整个TCTP主轴是积极的(白色箭头)。底板:两个末期oogonia。左:突出midbides被反可视化β微管蛋白immunoflorescence(白色箭头)。白色的星号显示两个子细胞的位置。注意没有TCTP中间体。酒吧等于20μm。

图6
双标记的γ微管蛋白和TCTP中心体非洲爪蟾蜍光滑的卵原细胞。中心体用黑色星号标记;18纳米金粒子(黑色箭头)对应于TCTP的存在,小,和10纳米金粒子在中心体马克的存在γ微管蛋白。插图的右下角显示了中心体,中央周围γ微管蛋白存在(中心区域清晰),和TCTP-containing中心体的外部区域(深灰色)。酒吧= 100海里。

总之,我们在这里展示TCTP associates的中心体非洲爪蟾蜍光滑的、人类、猴子和老鼠细胞和PCM疫源地acentriolar小鼠卵母细胞。此外,在中心体,TCTP同事与外部PMC焦点的一部分,但不是直接与中心粒。我们还表明,TCTP同事与MTs约24海里的距离。这种强烈表明,MT-TCTP协会需要连接器的性质,目前,仍是未知的。虽然我们仍然不知道TCTP在中心体的作用,考虑到中心体异常重复的致癌作用的关键因素(看过的20.,21]),我们的观察的研究打开一个新的大道TCTP /中心体交互。有趣的是,p53与中心体相关也证明是(22]。考虑到相互之间的负反馈TCTP和p53 [4),在中心体TCTP可能涉及的潜在作用对抗这两个蛋白质之间的相互作用。

确认

盖世的要感谢Ada Jankowska女士和贝亚特Szymanska优秀技术支持和Elzbieta Kisiel女士帮助数据。m . K . Jaglarz支持由格兰特K / ZDS / 001962和j . z Kubiak由弧及低成本航空。