文摘
胰岛移植是一种很有前途的治疗1型糖尿病;然而,成功率在实现短期和长期胰岛素独立是不一致的,部分是由于胰岛数量和质量不一致造成的复杂的性质和多步胰岛分离和移植的过程。自2000年引入埃德蒙顿协议,更多的注意力一直放在保护线粒体功能,越来越多的证据表明,受损的线粒体完整性可以影响临床结果。一些最近的研究已经证明,可以实现胰岛cytoprotection随后通过维持线粒体功能和改善胰岛移植的结果。然而,mitoprotection在很多情况下是有争议的好处和潜在的机制尚不清楚。本文总结了最近的进展与线粒体有关cytoprotection胰岛分离和每一步的移植过程,以及胰岛效力和可行性分析的基础上,测定线粒体的完整性。此外,我们简要讨论免疫抑制的副作用对胰岛移植物功能以及如何移植选址影响胰岛移植和临床结果。
1。介绍
自从2000年引入埃德蒙顿协议(1),人类胰岛移植已成为一个有前途的治疗1型糖尿病(1型),是唯一的微创治疗能够实现没有外源性胰岛素血糖控制。细胞疗法,胰岛移植是一个多步过程涉及胰腺器官和保存,组织消化和分解,胰岛净化、细胞培养、胰岛移植接受者通过肝门静脉,和维护贪污的非甾体类免疫抑制剂兵团。成功的胰岛移植是由上述的累积成功的步骤。迄今为止,胰岛移植已被证明有胰岛素独立变量在短期和长期的成功(2- - - - - -5),这种变化与器官捐献者和接受者的因素。为了最大化的成功率达到胰岛素独立,相当大的努力一直集中在以下几方面:(i)发展一个合适的器官保护解决方案;(2)的标准化良好生产原则(GMP)在胰岛细胞分离;(3)开发一个精确的力量测试,可以预测移植前胰岛移植肾功能(要求概述FDA生物制品许可);(iv)开发的一种新的免疫抑制方案减少胰岛移植物毒性;(v)改善胰岛移植物生存通过体外和在活的有机体内操纵;(vi)选择一个更理想的移植。
当我们经常关注越来越从每个胰岛分离、小岛之一,不应被忽视的首要任务是实现更高质量的小岛与保存β细胞功能和生存能力。位于细胞质中线粒体的主要功能是为细胞提供能量的形式ATP。细胞使用这种能量来执行工作细胞生存和功能所必需的。此外,线粒体还参与其他的细胞过程,如细胞生长、分裂和细胞凋亡。胰岛细胞由一群1000 - 2000细胞和规模在50 - 400之间不等μ米直径。组合1 - 2%的胰腺质量,每个胰岛包含至少五个不同的细胞类型:α肽(15 - 20%的胰岛质量)产生胰高血糖素;β肽(65 - 80%的胰岛质量)生产胰岛素和胰淀素;δ肽(3 - 10%的胰岛质量)生产生长激素抑制素;PP细胞(3 - 5%的胰岛质量)产生胰多肽;ε肽生产grhelin(< 1%的胰岛质量)。专门为β肽、线粒体发挥关键作用在分子生物学胰岛素分泌,不仅ATP提供能量的形式支持胰岛素分泌,也合成anapleurtoic代谢物可以行动,两个内部和extramitochondrially夫妇葡萄糖胰岛素感应颗粒胞外分泌的因素。ATP的,可能由这些anapleurotic调制耦合因素,触发ATP-sensitive钾通道的关闭,导致膜去极化,增加细胞内钙导致胰岛素分泌(6- - - - - -9]。
最近,线粒体在cytoprotective应用程序中涉及的角色缺血再灌注(I / R)损伤已经承认,继续积极研究用化学和物理方法在胰岛细胞分离和具有重要胰岛移植。然而,在这方面没有做系统综述。在本文中,我们将检查当前和过去的研究从过去十年在线粒体的作用和mitoprotective策略应用于胰岛细胞分离过程的每个阶段。
2。线粒体和Mitoprotection胰腺器官保存和存储
而人类胰岛移植的初步结果使用埃德蒙顿协议是有前途的,需要大量的小岛来实现每个病人胰岛素独立于多个器官人类胰岛移植的应用程序创建一个障碍作为一个常规的临床过程。胰腺保存和存储是胰岛细胞分离过程的第一步,关键对胰岛产量和品质的影响。在分离过程中,只有一小部分在整个胰腺胰岛可以成功分离具有良好的功能和可行性;特别是器官长期冷缺血时间。
缺血损伤有显著减少的数量和质量可以孤立的小岛从胰腺(10- - - - - -12]。缺氧缺血,胰腺采购和存储过程中,引发了一连串的胰岛细胞信号通路妥协可行性和功能(13- - - - - -15]。威斯康辛大学(UW)和Histidine-Tryptophan-Ketoglutarate (HTK)解决方案是两个最常用的器官保护解决方案用于胰岛细胞分离。都是为了保护ischemia-related细胞损伤的器官。作为金标准,威斯康辛大学的解决方案是第一个解决方案若有所思地设计用于器官移植和第一intracellular-like保存介质。威斯康辛大学的解决方案包含新陈代谢惰性物质(lactobionate、棉子糖和羟乙基淀粉)代替葡萄糖,维护本地渗透压,从而防止细胞水肿。此外,威斯康辛大学的解决方案还增加了自由基食腐动物类固醇和胰岛素。相比之下,HTK组成类似于细胞外液和开发基于的原则去活化和暂停撤军的细胞器官功能的细胞外钠离子和钙。一起密集的细胞外空间的缓冲的组氨酸/盐酸组氨酸,期间器官可以容忍长时间中断的含氧血液可能增加。然而,这两个解决方案并不防止缺氧和缺血的有害影响本身,特别是对于长时间冷藏的胰腺16- - - - - -18]。
巨大的努力已经通过氧化减少缺血损伤保护解决方案。全氟化合物(全氟化物)的化学物质已经发展到目前为止对胰岛细胞分离与最重要的影响。全氟化合物有很广的循环或脂肪族烃分子中所有的氢原子被氟原子取代。全氟化合物有很广的良好溶剂气体和大约40毫升的氧气可以溶解在100毫升90 - 95% PFC解决方案。这使得复合吸引力作为车辆运送氧气和其他气体在活的有机体内和在体外。全氟化物最初由黑田等人在1988年整个胰腺保护(19- - - - - -21)作为一个两层的存储方法(TLM)结合UW解决方案,之后采用胰腺胰岛隔离保护。自那时以来,50多个研究论文已发表在人类和动物模型的影响全氟化物对胰岛细胞分离结果了(22- - - - - -27]。在下一节中,我们将简要地解决这些研究的主要发现和讨论可能的原因为观察到的差异在成功和失败胰岛隔离使用全氟化物和总结这些观察表1以及额外的氧载体用于胰岛细胞分离。
在早期的研究中,松本和黑田显示全氟化物TLM协议中使用时,他们证明胰岛产量显著增加,功能和生存能力。此外,全氟化物延长保存时间(28- - - - - -30.]相比对威斯康辛大学独自解决方案。TLM当时立即和广泛采用早期由几个著名的胰岛项目,这证明相似的结果(10,31日- - - - - -33),后来被别人(34,35]。一项研究表明,小岛孤立使用TLM ATP含量较高的一种改进的充满活力的形象,ATP / ADP比率,井少40%过氧化损伤,表明线粒体作为一个可能的目标在一个潜在的机制36]。2006年,拉玛钱德朗等人分析了赞成和凋亡基因的表达在小岛孤立使用TLM,显示的抑制剂的表达显著增加细胞凋亡(IAP)和生存;伴随着减少的表达不好,伯灵顿,还存在(caspase-2 8和9)。改善胰岛产生的全氟化物与鼻窦线粒体介导的细胞凋亡途径的抑制(37]。然而,最近,一些大规模的研究和回顾性分析表明胰岛的TLM隔离的有益作用和临床移植结果最小为全氟化物可能只提高边际器官的保护(38- - - - - -42]。许多穷人这一发现有助于能力的全氟化物促进氧气渗透到整个胰腺全氟化物不能刷新到胰腺血管系统要么有或没有威斯康辛大学解决方案由于其水溶性差。2009年,松本等人重新分析他们之前的数据和观察到的差异导致了缺乏经验的器官采购团队(27)由于标准化的协议并没有被广泛接受的所有中心。
到目前为止,很少有其他氧载体,检测其对胰腺保护用于胰岛细胞分离的影响,主要是由于他们的低氧载体功能,可怜的水溶性,生物相容性差。在猪胰腺模型中,含氧perfluorodecalin (PFD)在不同温度下使用表明猪胰腺氧化在20°C增加胰岛ATP生成;然而,小岛被发现有损害葡萄糖刺激的胰岛素分泌43]。F6H8S5在人类胰岛的一项研究中,新开发的氧载体由F6H8 (perfluorohexyloctane)和硅油聚二甲硅氧烷5 PFD相比,显示比较结果链接优化ATP生产冷藏期间(44]。
在warm-ischemia鼠模型中,氧合聚SFH-P(聚合和stroma-free hemoglobin-pyridoxalated)应用于胰腺酶消化之前,表明聚SFH-P治疗胰腺的胰岛分离得到了改善β细胞生存能力和线粒体潜在葡萄糖刺激的变化。此外,阿2交付的保利SFH-P没有增加谷胱甘肽(GSH)含量(氧化应激的指标)和丙二醛(MDA)水平(氧化损伤的指标)45]。这些结果支持这样的观点:有一个mitoprotective效应与保利SFH-P相关治疗。然而,值得注意的是,其他组没有进一步证实本研究在啮齿动物或人类胰岛细胞分离过程由于产品的中止。
已经有多个试图补充UW解决方案与其他mitoprotective代理如营养因素(46,47],mitochondria-targeted抗氧化剂mitoquinone [48),卡维地洛(无选择性β拦截器/α1阻滞剂)(49)、表皮生长因子(EGF)和胰岛素样生长因子- 1 (igf - 1)50,51]。然而,这些化学物质的好处没有被验证了系统研究或用于胰腺器官用于胰岛细胞分离。
此外,一个特定的问题与胰腺器官保存从外分泌胰腺是发酵菌的泄漏。在胰腺内,丝氨酸蛋白酶活性的酶原的形式存在,从胰腺分泌胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原,proelastase。激活胰腺蛋白酶在隔离观察和发现引起部分原油杂质在胶原酶制剂(52]。由此产生的细胞死亡在隔离过程中会释放出免疫原性细胞内蛋白酶,提示线粒体自由基的生成和触发激活的巨噬细胞产生促炎细胞因子。此外,黑等人报道,有一个强大的胰蛋白酶消化阶段活动水平在增加,这些增加的水平与胰岛收益率差和相关函数(53]。它也在几项研究表明,蛋白酶抑制剂,如Pefabloc和抗胰蛋白酶(A1AT)在华盛顿大学和HTK解决方案,以及用作TLM,可以增加胰岛产量和函数有效地抑制这种不受控制的蛋白酶活动(32,54- - - - - -56]。然而,最近的一项大规模研究表明,Pefabloc实际上没有改善胰岛收益率。此外,在一项研究中,发现在胰腺保存在TLM可能提供更好的胰岛移植质量没有Pefabloc [57]。
总之,尽管一些有前途的研究显示有益mitoprotective影响胰岛的氧化和化学除器官保护解决方案,涉及潜在机制及其整体影响仍有争议和进一步研究的理由。此外,由于埃德蒙顿协议的引入,从一个胰腺胰岛产生仍然较低,平均300000 - 400000 IEq根据中心的专业知识。器官保存解决方案如华盛顿大学或HTK仍被认为是最有效的解决方案对预防缺血性损伤,直到其他备选方案具体地址需要独特pancreata用于胰岛移植。
3所示。线粒体和Mitoprotection胰岛细胞分离和文化
因为再灌注损伤与胰岛细胞死亡相关的主要因素之一在胰岛细胞分离,有广泛的调查,致力于减少再灌注损伤的影响,以提高胰岛细胞分离的结果。部分Reperfusion-related细胞损伤是由于胰岛组织的炎症反应介导的炎性因子的释放包括白细胞介素和活性氧(ROS)。虽然机制不完全的特征,两种炎症因子和ROS交织在一起,引发剂或在炎症级联效应可能引起的胰岛细胞分离β细胞功能障碍和死亡。在再灌注和再氧化,显著增加的ROS水平可以降低细胞和毛细血管膜导致额外的释放自由基和行为间接启动redox-signaling途径导致细胞凋亡。此外,再氧化会恢复ATP水平可能导致线粒体钙吸收的增加,导致大量的线粒体钙超载和破坏。
氧化应激可以发挥关键作用在细胞损伤胰岛细胞分离和移植过程(106年- - - - - -108年];因此,阻断氧化应激对移植的结果应该有一个有益的影响。到目前为止,一些抗氧化剂已经被用于保护胰岛细胞氧化损伤在隔离和文化时期。在此,我们将简要地讨论这些发现。
核factor-kappaB Bottino等人表明,激活(NF -κB)和聚(ADP-ribose)聚合酶(PARP)的两个主要途径负责细胞反应压力,发生在胰岛细胞在隔离过程和先于细胞功能障碍和死亡包括破坏线粒体膜电位(基质金属蛋白酶);线粒体通透性转换孔(MPT)形成;和增加细胞内的活性氧的积累。NF -κB-dependent反应,如生产和释放白细胞介素(il - 6和引发)和巨噬细胞化学引诱物蛋白1 (MCP-1),观察几天后隔离程序。促炎反应更加明显当小岛被培养在特定条件下的模仿与更高的胰岛细胞隔离压力和相关损失和分泌功能受损(58]。此外,Bottino等人表明,早期干预旨在减少β细胞氧化应激通过使用催化氧化剂探针AEOL10150(锰(III) 5、10、15日20-tetrakis [1 3 -diethyl-2imidazoyl]五氯化manganese-porphyrin [TDE-2 5-IP])可以有效地减少NF - DNA结合κB和随后释放细胞因子,趋化因子,和PARP激活胰岛细胞;因此导致更高的生存和更好的胰岛素释放控制相比,(58]。同一个作者的一个类似的研究表明,两个SOD模拟的应用程序(AEOL10113和AEOL10150)也可以保护人类胰岛从氧化应激,显示明显高于可行的胰岛和更好的质量在活的有机体内胰岛移植肾功能使用边际质量胰岛移植模型(59]。
谷胱甘肽(glutamate-glycine-cysteine)是最重要的一个非酶的抗氧化剂;然而,它不是细胞渗透。细胞可以合成谷胱甘肽的前体,如谷氨酰胺。谷氨酰胺对细胞生存和扩散的重要性在体外在1956年首次被鹰等人[60]。谷氨酰胺的cytoprotective和凋亡效应已经被埃文斯在肠道上皮细胞et al。61年)和胰岛细胞表明谷胱甘肽增加β细胞胰岛素分泌(62年- - - - - -64年]。在人类和动物模型中,胰腺导管内谷氨酰胺交付到消化之前可以增加谷胱甘肽水平,降低MDA水平,减少凋亡细胞的数量。除了改善胰岛产生,裸体小鼠的百分比呈现normoglycemic glutamine-treated小岛高于控制和时间达到normoglycemia从平均水平下降天天(65年,66年]。
虽然大部分抗氧化化合物有一个细胞外和细胞内分布广泛,他们经常失败积累在线粒体和需要与亲脂性的阳离子结合线粒体定位。进入线粒体内和积累的能力矩阵还取决于内部的线粒体膜电位(MMP)及其质子梯度;其中一个功能可能会改变取决于细胞的代谢状态。这个要求可能会限制他们的渗透能力去极化的细胞。此外,这些抗氧化剂在线粒体基质阳离子的积累会导致内部耗散MMP的事件,常常会导致细胞死亡。因此,这些代理展览狭窄的治疗剂量范围。为了解决这一问题,正在探索遗传策略以增强抗氧化防御的小岛。体外锰超氧化物歧化酶的转移(MnSOD)基因小鼠胰岛自身免疫性糖尿病小鼠胰岛移植物功能扩展。已经观察到小鼠的小岛,过表达谷胱甘肽过氧化物酶和SOD改善血糖控制的两个亚型在边际胰岛质量模型。
其临床应用的关注是它已经表明,病毒运载系统可以带来潜在的致癌风险,妥协胰岛功能,并提高免疫原性;后者,特别是鉴于T1DM的病理生理的设置信息。最近,两个研究小组证明人口多价金纳米粒子携带共价固定化DNA寡核苷酸(AuNP-DNA)高渗透的胰岛细胞的能力可以达到两个老鼠和人类的胰岛核心小岛没有毒性的证据;证明胰岛功能是保存好在体外和在活的有机体内与控制。一项研究显示,AuNP-treated小岛有正常的线粒体反应动力学在葡萄糖刺激时,保存与钙流入和胰岛素分泌控制相比,109年]。另一项研究表明,AuNP-DNA共轭和反义eGFP减少eGFP表达MIP-eGFP小岛(鼠标胰岛素启动子控制eGFP) [110年]。AuNP和/或AuNP-conjugates可能代表新一代的核酸治疗平台旨在改善胰岛移植,生存,和长期的在活的有机体内函数。预计更多的调查使用纳米粒子对货物交付小岛将会确认这个观察,同时提高功能交付系统。
除了使用物理、化学和病毒抗氧化货物交付平台,分子具有良好的穿透能力也被调查。SS-31 (D-Arg-2′, 6′-dimethyltyrosine-Lys-Phe-NH2),一种新型水溶性抗氧化肽,是几个分子渗透的能力测试,展示的小岛和定位在线粒体的核心67年]。此外,SS-31保留基质金属蛋白酶,可以减少胰岛细胞凋亡,增加胰岛细胞产生,并提高posttransplantation函数证明了一个提示和持续normoglycemia;而未经处理的胰岛移植受者仍然是糖尿病。一项研究表明,SS-31可以抑制,以最小的细胞毒性、线粒体肿胀、氧化细胞死亡,和I / R损伤的心脏和神经细胞(68年]。然而,到目前为止没有SS-31的影响的报告发表在人类胰岛移植。
细胞因子诱导的效应机制β细胞死亡也可能包含依赖一氧化氮(NO)和独立通路(69年]。在啮齿动物胰岛,interleukin-1β(il - 1β)就可以诱导伊诺表达和损害结果没有生产β细胞氧化功能的线粒体顺乌头酸酶(m-con)导致减少葡萄糖氧化和ATP生产(70年]。引导等人证明这NO-mediated通路β坏死细胞死亡主要是由高机动组框1蛋白的释放(HMGB1) [71年]。相比之下,似乎人类胰岛抗细胞因子诱导生产功能障碍的主要机制可能是由于线粒体活性氧的生产和激活proapoptotic半胱天冬酶酶(72年]。各种特定的和非特异性抑制剂的活性氮和氧物种已经评估了他们在文化和影响胰岛在活的有机体内具有重要。伊诺的抑制NG-monomethyl-L-arginine (NMMA)或氨基胍(Pimagidine)在文化可以阻止没有生产在啮齿动物和人类胰岛(73年]。用n -乙酰半胱氨酸、谷胱甘肽过氧化物酶治疗能增强胰岛的抗氧化能力β肽(74年,75年]。
当人类胰岛细胞治疗与细胞因子il - 1的结合β肿瘤坏死因子-α(TNF -α)和移行细胞(IGN -γ72 h),显著增加细胞死亡的数量被TUNEL观察(末端转移酶的dUTP结束标记)和细胞死亡检测(68年]。此外,这项研究表明,这种细胞死亡与细胞凋亡和线粒体肿胀。之间的可能联系已经建议外围苯二氮受体(PBR),也称为蛋白质转运蛋白(TSPO),其中牵扯到一个特定的线粒体渗透性转换孔和组织损伤与炎症介质的产生有关。
各种维他命(D3、E、核黄素和C)也被用作抗氧化剂在体外和在活的有机体内并显示防护效益包括增加胰岛素的分泌,提高胰岛细胞生存能力,增加了胰岛素基因表达,降低脂质过氧化作用。由于这些结果了以前[76年),综述我们不会进一步讨论研究结果。
最近,它被假定一个更好的策略可能是块的起始引发的炎症通路il - 1之间的交互β与细胞受体(interleukin-1受体,IL-1R)。的有效性IL-1R拮抗剂(Kineret (Anakinra))在阻塞proapoptotic和坏死外源性il - 1的影响β肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ对培养的大鼠胰岛调查。Anakinra是美国FDA批准的药物作为抗炎治疗在人类对象与类风湿性关节炎的临床试验(77年和2型糖尿病(T2DM)病人体内78年]。这是一个人类重组,nonglycosylated形式的人类interleukin-1受体拮抗剂(IL-1ra)由153个氨基酸组成的分子量为17.3 kDa。的生物活动Anakinra来源于竞争抑制il - 1β绑定到interleukin-1 I型受体(IL-1RI)。在一些动物模型在体外人类胰岛研究,阻断il - 1β受体(IL-1R)显示一个有效抑制il - 1的激活β端依赖炎症通路(79年),增强胰岛移植的80年)和胰岛移植肾功能衰减的淀粉样蛋白polypeptide-induced释放促炎细胞因子(81年]。所有这些结果支持其可行的应用对人类胰岛在活的有机体内作为一个治疗团具有重要的意义。
一组进行的两项研究已经证明要么pan-caspase抑制剂的应用(N-benzyloxycabonalyl-Val-Ala-Asp-fluoromethyl酮[Z-VAD-FMK])或更多选择性半胱天冬酶抑制剂(EP1013 [zVD-FMK])在postisolation文化在活的有机体内治疗可以减少胰岛损失后长期边际人类文化和反向移植后糖尿病胰岛质量减少(80 - 90%)到老鼠82年,83年]。几个类似的研究也证明了半胱天冬酶抑制剂对胰岛移植的好处(84年,111年]。
一些研究已经证明了一个重要的有益影响重组人类的催乳素(rhPRL)β细胞增殖,胰岛分泌,cytoprotection,胰岛移植,移植胰岛的血管再生和功能β细胞存活率(85年- - - - - -87年];然而这种现象的潜在机制仍不清楚。最近的一项研究表明,cytoprotection可能涉及BCL2 /伯灵顿比率的增加和抑制等还存在8,9,和388年]。
c-Jun NH的信号转导通路2终端激酶(物)的成员压力激发了群增殖蛋白激酶(MAPKs),优先激活胰岛细胞分离过程,氧化应激和细胞因子的毒性89年]。据报道,il - 1β风暴造成脑死亡显著激活物和减少胰岛产量、生存能力,和功能在体外和在活的有机体内移植后(90年]。它也表明胰岛注入肝门静脉系统导致强烈激活物(91年]。物抑制剂的应用在胰岛移植可以防止胰岛损失和文化在活的有机体内移植肾功能(91年,92年]。此外,物抑制剂也还添加了胰腺保护解决方案显示强烈的抑制物,阻止细胞凋亡后立即隔离(93年]。
之前,我们讨论了胰蛋白酶和其他的激活内源性胰脏酵素原有助于减少胰岛收益率通过控制蛋白质水解的胶原酶和延长消化时间。试图用在隔离过程中Pefabloc代替器官保存阶段,表明Pefabloc可以抑制丝氨酸蛋白酶活性在整个组织消化过程;但是,与有争议的结果对胰岛产量和函数(94年- - - - - -96年]。此外,由同一组最近发表的两篇研究论文表明,当人类胰岛培养或perifused Pefabloc postisolation,葡萄糖刺激胰岛素分泌人类的小岛是妥协,这表明Pefabloc不适合人类胰岛细胞分离(97年,98年]。
总结在表2,是主要的抗氧化和抗炎物质用于胰腺保护、胰岛细胞分离,胰岛的文化。
4所示。线粒体的完整性评估人类胰岛功能和可行性分析
美国食品和药物管理局(FDA)定义了制备胰岛产品的生物药物;因此,胰岛移植需要准备产品在fda的指导下胰岛移植前批准,可以作为临床治疗。尽管标准化和应用程序当前的良好生产规范(cgmp)胰岛细胞分离过程,lot-to-lot变异性仍然无法避免。适当降低劣质胰岛移植的风险,产品发布测试是必要的。虽然测试不育、身份和纯度已经很成熟,到目前为止没有可靠的胰岛效能评估可用之前移植。这仍然是一个关键的变量与临床移植相关的结果。
现有的标准分析用于评估胰岛功能和生存能力包括静态分子胰岛素刺激(GSIS)效力,和包容和独家染料染色膜完整可行性。这两种技术预测的值较低,不相关与临床移植的结果112年- - - - - -116年]。目前,临床医生确定一个给定的适用性胰岛准备主要基于主观测量(例如,形态)和胰岛细胞质量(IEq,胰岛的体积量化质量)。GSIS预测价值差的根本原因是不太清楚;然而,有几种可能的解释。静态GSIS只有措施“散装”胰岛素释放一个小岛在极端条件下制备葡萄糖(16.7毫米和60分钟曝光),完全忽视的动态生理特性β胰岛素分泌细胞动力学响应葡萄糖。此外,“大部分”胰岛素数据不提供任何有用的信息的关键stimulus-coupling必需的因素,控制和调节胰岛素分泌和生存能力在活的有机体内。例如,胰腺保护和胰岛细胞分离过程中轻微的压力可能导致临时胰岛素脱粒和泄漏引起的细胞膜损伤,虽然小岛还是可行的。因此,低GSIS并不表明不可逆损失函数,因为暂时受损的胰岛细胞可能恢复当移植到受体。同样,一个高GSIS的结果可能是由于胰岛素通过细胞膜损伤脱粒。
胰岛大小是另一个因素可能会导致变量GSIS的结果。不像原位分离胰岛的传感环境葡萄糖的变化是完全依赖葡萄糖的被动扩散99年,114年]。自从小小岛有更大的表面积,更好的GSIS预计将[One hundred.,117年在人口规模较小的小岛。在临床实践中,IEq作为决定性因素在决定的适用性胰岛准备当人类胰岛效力不定义或难以量化。这是一个普遍的共识,为了扭转糖尿病1型糖尿病人,至少5000 IEq接受者的每公斤体重需要一个移植手术。矛盾的是,大小岛贡献更多的IEq但少释放胰岛素是一个可能的解释为什么胰岛移植的成功没有什么特别强烈的关联与移植胰岛的质量。
相反,在活的有机体内效能分析评估小岛的人类胰岛移植到免疫缺陷裸小鼠移植临床结果的关联非常好,目前的黄金标准评估胰岛效力。然而,这在活的有机体内分析需要几周才能完成,因此,只提供了一个回顾表明胰岛功能,呈现这个化验不切实际的移植前评估临床时间至关重要的(101年,103年,118年,119年]。
为了解决这个问题,各种各样的在体外测试进行了调查和发展为了评估胰岛效力和活力为移植胰岛释放之前,包括:测量耗氧速率(OCR) [104年,114年,115年,120年,121年];量化的活性氧(ROS) (116年];和ADP / ATP比例(105年,122年]。除了回顾有用和更少的预测,这些化验有多种限制。首先,大多数OCR和ROS化验进行静态作为单个参数。此外,OCR和ROS化验β作为胰岛细胞特定的,至少有五种不同的细胞类型β肽仅占65 - 80%的人类胰岛细胞的人口。没有加权分析ROS为每个单独的细胞群,这些信息是蒙羞;甚至然后测量可能是出土文物的小岛是一个生理和代谢功能单位。最近,越来越多的证据表明,化学和/或离子之间的沟通β之间的肽或β肽和α肽对胰岛素分泌的调节很重要123年,124年]。此外,差距相邻胰岛细胞之间联接的复合物也需要促进intraislet荷尔蒙输出信息的沟通与协调(102年]。因此,别人经常挑战ADP / ATP测定的准确性因为化验需要胰岛分离。全面回顾这些化验最近发表(113年]。在此,我们将简要讨论化验测定线粒体完整性胰岛效能和生存能力。在表3,我们总结了这些化验的长处和局限性。
在寻找更可靠β细胞特定的效能分析,测量线粒体完整性已成为另一种形式的分析一个参数或结合其他参数胰岛生存能力和效力。
锌是高度集中β肽但更集中在其他胰岛细胞类型。锌中扮演一个重要的角色在包装胰岛素颗粒牢固确立为胰岛素晶体作为一个不可分割的原子协调2-Zn-insulin六聚体。最近,纽波特绿色(NP),一个盒子zinc-sensitive荧光探针,已被用于识别和净化人类的β肽(125年]。2005年,Itchii等人报道小说结合的分析方法β肽首次明确具体的使用由激光扫描NP标签和分类血细胞计数(LSC)。NP+阳性细胞被评估使用TMRE可行性(tetramethylrhodamine乙酯),线粒体膜电位荧光探针(126年]。报告中的数据研究强烈建议分析β细胞生存能力由TMRE临界值在免疫缺陷小鼠移植结果的预测模型。此外,研究发现,dna结合蛋白染料排斥并不总是与可行性在活的有机体内移植肾功能;一个强有力的论据表明染料作为一个包含/排除的不足长期胰岛可行性的预测分析。这些发现进一步证实了其他研究[127年]。此外,TMRE与FluoZin-3一起使用,另一个zinc-specific调查但是更高的亲和力(= 15 nM)和较高的量子产率,也可以用来评估β用流式细胞术细胞生存能力。的功能β肽是由MMP的保留指标结合TMRE FluoZin-3+β肽(128年,129年]。在其他的研究中,线粒体的MMP测量JC-1荧光探针用于并行关联luminol-measured ROS的变化,显示出减少的百分比与正常的线粒体细胞极性与葡萄糖和低响应指数rotenone-stimulated小岛。回归分析显示了鱼藤酮刺激指数显著相关与胰岛细胞的百分比与极化线粒体(116年,130年]。
虽然这些结果是有前途的,上述的评估线粒体完整性测量一个静态值β细胞能量状态只有回顾因为这些化验值可能需要几天进行,不能预测胰岛移植肾功能的移植。此外,作为酶分离的胰岛,化验的方法经常被质疑文物的介绍,如选择性损害或损失β细胞数量。此外,这些实验室化验需要更复杂的设置,如流式细胞仪、激光共焦显微镜,扫描血细胞计数。然而,这些发现强烈建议有能力的测试方法测量动态变化在整个小岛潜在线粒体动力学响应胰岛素促分泌素(如葡萄糖),与其他测量关键胰岛素stimulus-secretion耦合因素的分析,将有助于确定移植前胰岛功能。为了实现这种类型的测试,需要使用微流控技术。
微流控技术已经被用于广泛的分析应用程序,最近采取了这些技术开发版本的胰岛灌注设备,结合一种或者多种胰岛和分析工具β细胞研究[131年- - - - - -133年]。微流控技术在传统技术有许多优点,少量的试剂和bioanalyte是必需的,它是简单的创建和维护一个实验性的微环境,和微流控评估等分析工具允许轻松集成光学和电子化验。此外,制造技术良好的可移植性和经济批量生产的高精密的设备。最近,microfluidic-based灌注设置了线粒体势变化的同时成像和钙流入以及整个小岛的胰岛素释放动力学响应葡萄糖刺激(134年,135年]。这mitochondria-based胰岛化验与以下功能:(i) multiparametric分析关键的胰岛素stimulus-secretion耦合因素,包括细胞内钙信号,线粒体势变化,和胰岛素分泌动力学;(2)实时胰岛化验没有胰岛修复或分离是必要的;(3)β细胞特定由于胰岛评估响应胰岛素刺激器刺激;(iv)足够的时空分辨率的测量参数。虽然系统显示了有前景的结果,需要人类胰岛的大规模评估产品与数据关联结果在活的有机体内动物和人类模型移植肾功能。这项工作目前正在临床试验后,预计将验证数学模型的胰岛功能指数(IFI)得分。
尽管各种化验,一个结论性的效能测试仍然需要开发和验证胰岛移植社会普遍接受的。理想情况下,这个力量测试需要实时β-cell-specific、敏感、可靠的、健壮的、实用性。
5。线粒体对选择的影响和移植免疫抑制团网站
除了注入足够数量的高质量的小岛和小心收件人选择肾功能正常的患者和低胰岛素需求,成功的另一个重要因素埃德蒙顿协议是发展的一个新的前者免疫抑制治疗相结合的西罗莫司(雷帕霉素,mTOR抑制剂)和低剂量他克莫司(吸收FK506钙调磷酸酶抑制剂)和感应daclizumab (anti-IL2-receptor单克隆抗体)。
建议在过去,胰岛移植具有重要的失败可能是由于几个原因包括初始胰岛移植的失败,炎症反应在移植网站,alloreactive(拒绝)或自身免疫反应,和免疫抑制药物β细胞毒性(136年]。尽管他们的长期副作用仍不完全清楚,直接免疫抑制药物的副作用包括口腔溃疡、胃肠障碍(胃部不适和腹泻),高胆固醇、高血压、贫血、疲劳、白细胞计数减少,肾功能下降,对细菌和病毒感染的易感性增加。服用免疫抑制药物也会增加肿瘤和癌症的风险。几项研究系统性回顾这些方面;本文只能短暂的地址的一些结果的影响免疫抑制剂与胰岛mitochondrial-based cytoprotection。
尽管大量的研究调查的影响,西罗莫司和他克莫司在小岛上在体外和在活的有机体内,以及在胰岛移植患者,已报告互相矛盾的结果。西罗莫司抑制mTOR(哺乳动物雷帕霉素靶)通路通过直接绑定mTOR复杂1 (mTORC1)。它已经表明mTOR信号通路整合细胞内和细胞外信号和作为细胞代谢的核心监管机构,生长,增殖和生存。它也表明,线粒体代谢和生物转化都是由mTORC1监管。通过抑制mTORC1,西罗莫司降低MMP的耗氧量,ATP的水平。此外,它降低了线粒体DNA拷贝数和许多参与氧化代谢的基因编码的蛋白质137年,138年]。mTOR信号通路也阻止胰岛细胞启动authophagy [139年]。因此,抑制mTORC1的西罗莫司的差别会导致对这些t淋巴球同时促进authophagy和增加启动细胞死亡的概率。这已经证明在老鼠模型中,西罗莫司治疗诱导的增加膜结合轻链3 (LC3-II) authophagy的早期标志,以及降低细胞生存能力。在这个实验中,sirolimus-mediated激活authophagy显示治疗来拯救3-methyladenine (3-MA)抑制剂authophagy [140年]。
自西罗莫司单方不足以抑制胰岛移植排斥,通常用于其他免疫抑制剂。他克莫司是一种最常用的免疫抑制剂代理通常会与西罗莫司。他克莫司的免疫抑制块antigen-stimulated如- 2基因的表达在t细胞,t细胞增殖所需。一般认为他克莫司毒性的机制类似于环孢霉素(CsA)抑制线粒体ATP生产和破坏线粒体离子通道。然而,一些研究人员提出,在I / R模型中,他克莫司保护神经组织等不利条件下的overaccumulation钙、氧化应激、细胞色素c的释放,和坏的磷酸化(141年,142年]。
在临床实践中,西罗莫司已被证明增加基底和刺激胰岛素分泌内维护plasma-drug浓度目标时降低β细胞凋亡(143年]。当培养人类的小岛,西罗莫司降低TNF -α,il - 1β、MCP-1和巨噬细胞炎性protein-1beta (MIP-1β)不洁净的胰岛的准备工作(144年]。在患者接受西罗莫司作为胰岛移植预处理,空腹c肽水平的增加和降低胰岛素需求观察(145年]。在一个在活的有机体内啮齿动物模型中,胰岛移植物功能是保存与移植前减少趋化因子CCL2,抑制趋化因子的响应具有重要146年]。然而,冲突的结果也被报道。西罗莫司被发现影响代谢分泌耦合通过抑制碳水化合物代谢导致ATP水平较低,较慢的葡萄糖氧化速率,抑制alpha-ketoglutarate脱氢酶(AKGDH) [147年]。此外,西罗莫司与减少有关的血管内皮生长因子(VEGF)发布的小岛;减少胰岛可行性通过阻断VEGF-mediated生存途径(148年),以及glucose-induced胰岛素分泌减少在活的有机体内(149年]。
他克莫司的不利影响β细胞功能已经被很好的记录包括减少胰岛素的颗粒;减少胰岛素的释放;抑制胰岛素转录由RT-qPCR胰岛素mRNA水平;减少葡糖激酶(I-GLK hexokinase-4)活动使用细胞系,啮齿动物胰岛,和人类胰岛150年- - - - - -154年]。一项研究已经表明,他克莫司线粒体密度和耗氧量减少药物相关浓度没有变化的速率ATP生产和细胞凋亡。微阵列数据表明他克莫司修改路径涉及ATP代谢、膜贩运和细胞骨架重塑,表明他克莫司线粒体功能障碍的原因导致减少线粒体基因转录和翻译内容和呼吸(155年]。2009年,一项研究对西罗莫司的影响相比,他克莫司,霉酚酸酯(MMF) glucose-induced人类胰岛胰岛素分泌,发现三个药物测试caspase-3乳沟和caspase-3活动增加。他克莫司已被证明有急性和直接作用于胰岛素胞外分泌,而MMF不但是仍有胰岛素分泌受损表明间接影响胰岛素胞外分泌。有趣的是,exenatide (exendin-4) GLP-1受体激动剂,可以改善在西罗莫司造成的胰岛素分泌障碍,他克莫司,MMF [156年]。
在一个在活的有机体内大鼠模型中,西罗莫司和环孢霉素已经使用,表明联合治疗增加血糖和HbA1c水平,以及HOMA-R[空腹胰岛素(μ/毫升)×空腹血糖(更易/ L) / 22.5]索引。CsA撤回时,在活的有机体内胰岛移植肾功能损害时病人保持与西罗莫司(157年]。临床病例的一项研究报告说,一个病人面对西罗莫司毒性不耐受是转换为MMF与低剂量他克莫司和维护每月注入daclizumab,显示良好的长期胰岛移植肾功能和改善肾功能(158年]。
而证据似乎支持这一概念,大多数目前免疫抑制剂用于胰岛移植至少有某种程度的毒性在小岛和影响胰岛移植物功能,报告了一些相互矛盾的结果。许多贡献这些不一致的观测实验模型的选择:在活的有机体内与在体外,短期和长期,细胞株和主细胞,动物和人类,剂量的差异。
除了免疫抑制剂的毒性,胰岛移植部位的微环境内的肝门静脉系统也被认为是一个主要因素与胰岛的损失具有重要的质量和功能。在胰岛移植的时候,非特异性炎症的级联事件称为即时血液介导炎症反应(IBMIR)发起,包括激活blood-mediated凝固路径(159年)和释放促炎细胞因子(PIC)主要来自巨噬细胞、枯氏细胞,内皮细胞。它也表明,细胞因子产生的免疫系统可以渗入胰腺胰岛和作为介质具有重要的意义β细胞的破坏(136年];以及更高层次的immusuppressants直接有毒或有害的移植胰岛。肝门静脉系统的物理和化学微环境也被认为是次优的胰岛移植和生存:低氧张力和高浓度的浪费和营养物质可能导致胰岛glucotoxicity和lipotoxicity。当小岛暴露于慢性高血糖的和hyperlipidemic环境中,他们的整体功能可以妥协,包括葡萄糖的敏感性,β电池耗尽,glucotoxicity / lipotoxicity [160年,161年]。Glucotoxicity和lipotoxicity密切关联和互补的有害影响β细胞的功能。Glucotoxicity涉及许多转录因子和部分由慢性线粒体活性物种的生成和积累。Lipotoxicity积累可能是介导的胞质信号来自脂肪酸酯化反应通路。很少有研究已经出版,探讨胰岛移植的肝门脉系统由于缺乏良好的在体外和在活的有机体内模型可以密切模仿这个胰岛移植微环境。新的替代网站目前正在调查包括肌肉、骨髓,腹腔小岛,可能会减少压力。虽然这个话题很重要改善胰岛移植结果之前已经在其他论文中报道了大深度(162年,163年]。
6。总结
最近,胰岛细胞分离技术的改进和选择最佳的免疫抑制兵团人类胰岛移植一个可行的临床途径治疗T1DM的病人。不一致的成功率之间观察到的短期和长期的移植中心中生存,这可能与胰岛的使用的产品不到最佳的质量和数量。线粒体功能潜在损害胰岛分离和移植过程的每一步,随后可以负面影响胰岛移植和生存。这个审查的证据支持以下假设:(i)线粒体功能障碍是一个中介胰岛i / R损伤的发病和进展;(2)潜在疗法针对线粒体流程,包括能量代谢、细胞因子诱导的炎症反应,自由基生成,将承诺保护胰岛功能和生存能力。然而,确认线粒体的作用在孤立的小岛cytoprotection移植,这将是必要的证明这些结果在适当的动物模型和大型队列研究由多个中心相关临床移植胰岛细胞分离的结果。此外,它是重要的关联更加敏感和可靠的胰岛生存能力和效能分析基于线粒体完整性的评价与低质量的其他参数来防止移植胰岛的准备。未来的努力也需要更好地理解底层机制immunosuppressant-mediated胰岛毒性和免疫抑制剂的发现新一代少损害胰岛。最后,重要的是要改善胰岛移植过程通过减少胰岛损失可能找到一个更合适的移植网站为了实现移植的结果一致。
承认
作者真诚地感谢UIC-COM(芝加哥伊利诺伊大学医学院)人类胰岛团队提供技术援助和芝加哥糖尿病项目(CDP),http://www.chicagodiabetesproject.org)。