文摘

几项研究已经证明等离子体粘多糖含量在生理和病理条件下的变化。在正常的人血浆笑话存在主要是undersulfated硫酸软骨素(CS)。本研究的目的是评估可能的等离子体之间的相关性CS /结构水平和颈动脉粥样硬化病变的存在/类型学。等离子CS从46个对照组和纯化47接受颈动脉内膜切除手术的患者显示软或硬斑块。等离子体的浓度和结构特点CS进行评估通过毛细管电泳的组成不饱和fluorophore-labeled双糖。结果表明,总CS同分异构体的浓度增加了21.4% ( )等离子体的患者,由于undersulfated CS的显著增加。因此,患者血浆c电荷密度的显著降低对控制。排序斑块类型之后,我们发现患者软斑块和硬的不同导致观察到的变化。在患者血浆从软斑块,CS含量的增加与修改无关的硫酸盐化作用模式。相反,硬斑块的存在与CS硫酸盐化作用模式修改总CS同分异构体的存在很正常的水平。这些结果表明,等离子体CS内容和结构可能与动脉粥样硬化斑块的存在和类型学和可以提供一个有用的诊断工具,以及负责斑块不稳定的分子机制的信息。

1。介绍

动脉粥样硬化是一种进行性疾病,其特征是脂类的积累和纤维元素在中型和大型动脉。斑块破裂和血栓形成是最重要的临床并发症急性冠状动脉综合征的发病机制和周围性血管疾病1,2]。虽然很多风险因素,比如高血压、糖尿病和高脂血症被认为扮演一个角色在病理学的发展和发展3),斑块形成和发展的机制仍然不太为人所知。动脉的异常表达和结构修改硫酸软骨素蛋白聚糖(CS-PGs)与动脉粥样硬化进展(4- - - - - -6]。动脉CS-PGs在早期动脉粥样硬化病变明显增加,参与脂质保留、修改和积累。此外,CS-PGs与动脉粥样硬化相关炎症过程中起着关键的作用[6]。众多原位证据表明,斑块的不稳定是由于蛋白水解活性的大幅度增加和炎症状态(7]。然而,现在具体系统性标记动脉粥样硬化病变的早期诊断和预后尚未确定。

几项研究已经证明等离子体粘多糖的变化(GAG)水平与生理和病理条件下,如强大的体能训练(8),慢性淋巴细胞白血病和基本thrombocythaemia [9],红斑狼疮[10),和黏多糖病11,12]。

硫酸软骨素(CS)是主要的呕吐在正常人类的等离子体。它由12 - 18重复二糖单位,每个包含一个hexuronic酸联系在一起β(1 3)债券N-acetyl-D-galactosamine残渣,其中约30%在c - 4羟基己醣胺的硫酸盐。它循环共价连接到蛋白聚糖bikunin [13),光亚基等离子serine-proteinase国米的antiproteinase活动α抑制剂(我α我)。一些数据表明,bikunin在炎症中起着重要的作用。我的α我家人分子合成在一个或两个多肽的肝细胞,称为重链(高碳钢),与CS bikunin链。刺激后,我α我分子离开循环,在血管外的网站,高碳钢的从CS链转移到本地合成透明质酸(HA)形成serum-derived hyaluronan-associated-protein - HA复杂(世鹏科技电子),扮演重要的角色在稳定细胞外基质和它往往与炎症相关条件(14]。此外,它被描述,bikunin也充当一个内皮细胞生长因子,调节细胞内的钙含量,抑制肾结石形成和平滑肌细胞收缩(15]。

本研究的目的是评估可能的等离子体之间的相关性硫酸软骨素(CS) /结构水平和颈动脉粥样硬化病变的存在/类型学。

2。材料和方法

2.1。样品收集

CS同分异构体分析47例患者进行术前血浆样本(狭窄> 70%,70.4±7.9岁)接受颈动脉内膜切除手术,显示软(26患者)或硬斑块(21例),和来自46个健康normolipidemic志愿者(对照组),年龄从20到75(47.8±14.4岁)。病人的主要临床参数研究报告在桌子底下1。患者血脂水平和同型半胱氨酸水平和控制表2。斑块类型是由超声评估使用Mylab 70 Xvision ecocolordoppler配有LA332 AppleProbe取得MHz (Esaote)。斑块是根据Gray-Weale分类(分类16软),性特征(类型1和2),和困难,高回声特征(类型3、4和5)。报名之前获得知情同意。这项研究是由当地伦理委员会批准按照机构的指导方针。

表1
47例患者的主要临床参数根据斑块类型进行颈动脉内膜切除手术。
表2
患者血脂水平和同型半胱氨酸水平和控制。
2.2。等离子体CS同分异构体分析

GAG净化是由一个microanalytic制备方法,如前所述[17]。简单地说,500年μL血浆样本受到蛋白水解与木瓜蛋白酶治疗。等离子体CS通过阴离子交换色谱法纯化和5卷的乙醇沉淀−20°C 24 h。随后,纯化血浆c同分异构体受到解聚作用通过软骨素ABC裂合酶(0.1 U / 100μg hexuronic酸)和不饱和二糖与0.1 mol / L derivatized 2-aminoacridone (AMAC) [18]。

分离和定量的软骨素sulfate-derived双糖是通过毛细管电泳(CE)分析用P / ACE毛细管电泳系统(贝克曼)装备有75毫米id和47厘米长度裸熔融石英毛细管使用60 L更易与醋酸钠缓冲,含有0.05%甲基纤维素(17]。分离进行了25°C和监控用激光诱导荧光(生活)探测器在488 nm励磁和520 nm发射波长。定量分析一个自制的标准c从人血浆净化池的制备方法。简单、标准c同分异构体被阴离子交换色谱法从papain-treated获得等离子体,化验hexuronic酸内容(19),冻干成整除,储存在−20°C。Δ-disaccharide分析,校准曲线是由提交plasma-purified CS同分异构体软骨素ABC裂合酶治疗和衍生化过程。

CS含量表示为μ克每毫升血浆hexuronic酸( /毫升)和CS电荷密度是评价比4-sulfatedΔ-disaccharides(ΔDi-4S)和总不饱和二糖(ΔDi-4S +ΔDi-nonS)。

2.3。统计分析

统计分析进行了使用SigmaStat软件(Systat软件,Inc .)。学生的 以及正态分布的数据,用于评估差异而Mann-Whitney等级和应用非参数的测试。的值 被认为是重要的。CS含量之间的相关性,CS电荷密度和年龄是由皮尔逊积矩相关测试有95%的置信区间。

3所示。结果

动脉粥样硬化患者和健康志愿者血浆样本进行分析。在两组患者分类根据类型学的颈动脉病变(软、硬)由ecocolordoppler超声评估。两组患者的主要临床(表没有差别1(表)和生化参数2),作为一个整体和subsorting性别。血脂水平和同型半胱氨酸水平(表2在病人和对照组()相似 )。

CE被用来分析等离子体的数量和精细结构CS同分异构体。同时测定的方法允许采用透明质酸,CS-derived双糖有良好的再现性迁移时间(CV %, 0.25)和峰值区域(CV %, 1.4)。内部和interassay CVs是7.23%和5.37,分别分析复苏大约86% (17]。已经验证了这个方法的比较参考试验(fluorophore-assisted碳水化合物凝胶电泳)利用传球和Bablock回归分析和Bland-Altman测试作为测量比较具体的统计方法(17]。

CE分析等离子体显示CS同分异构体的存在两个主要的不饱和二糖,在nonsulfated(ΔDi-nonS)和4-monosulfated(ΔDi-4S)。

排除任何时代对我们的影响分析和结构的结果,我们评估其协会与内容和电荷密度的等离子体CS在对照组。在这方面,即使不存在相关性排序控制性别。年龄不相关也与ΔDi-nonS ( ; 与ΔDi-4S)和( ; )的水平。

统计分析允许我们整个组患者证据之间的显著差异(表的集团控制3增加undersulfated CS水平)组成(4.46±1.59和3.56±0.99 /毫升, ),总CS含量随之增加(6.28±2.28和5.17±1.48 /毫升, )和减少其电荷密度(28.6±4.6和30.8±4.5%, )。排序后斑块类型,有趣的是,我们总c浓度显著差异就是一只软斑块患者对健康受试者(6.76±2.16和5.17±1.48 /毫升, ),由于水平明显高于ΔDi-nonS(4.73±1.48和3.56±0.99 /毫升, )和ΔDi-4S(2.03±0.75和1.61±0.56, ),而患者硬斑块显示很正常的水平。在等离子体软斑块患者normosulfated和undersulfated CS同分异构体都显著增加,它们的相对比例持平。所以,未发现明显的CS电荷密度的变化。相反,在患者血浆从硬斑块,尽管CS同分异构体都是很正常的水平,相对比例的显著差异被发现对控制,产生一个显著降低CS电荷密度(−12%)。

表3
总等离子体CS,ΔDi-4SΔDi-nonS水平和CS电荷密度在对照组,患者的整体,根据斑块类型。

没有学生的差异 以及总CS含量和CS电荷密度后出现subsorting病人和控制性别。

4所示。讨论

人类正常的等离子体包含主要的软骨素undersulfated形式的浓度约为4 /毫升(20.),其起源和生理作用尚未完全阐明。它循环共价链接到bikunin [13,14),或作为主要产品的组织分解代谢或由血液细胞,如淋巴细胞,与各种各样的血浆蛋白(21,22]。众所周知,等离子体的呕吐与低密度脂蛋白可能影响他们的一些物理化学性质(23)和一些生理和病理条件可能会导致增加血浆GAG水平(8- - - - - -12]。此外,炎症介质等一些细胞因子和生长因子可以调节大小,程度,和硫酸盐化作用的模式,以及呕吐的程度的差向异构化作用链(24- - - - - -26]。

在这个工作我们之间可能存在的相关性研究等离子体CS /结构和水平存在/类型学的颈动脉粥样硬化病变。在之前的文献[17),我们开发了一个敏感的和可再生的定量分析方法和结构评估人血浆c同分异构体使用毛细管电泳(CE)。,采用这种分析方法评价CS浓度和结构特点在46个健康的人体和47动脉粥样硬化患者软或硬斑块。

斑块类型是由双超声评估颈动脉斑块特征代表了一种非侵入性方法。这种技术允许检测领域具有不同深浅的灰色斑块上提供信息的一致性。特别是,低回声区特性与lipid-rich颈动脉斑块,而与纤维或fibrocalcific高回声特性的(16]。在这方面,最近的一些超声研究已经证明,呈斑块,以GSM(灰度值)值低,有关脑血管缺血性中风的风险增加(27- - - - - -29日]。所以,软斑块显示特征的不稳定和propension破裂。一般认为斑块不稳定是由于蛋白水解活动大量增加和炎症状态。

排除任何年龄的影响我们的结果,我们评估其与血浆c含量和硫酸盐化作用模式通过皮尔森的相关性。在这方面,不存在相关性。一些相互矛盾的数据关于等离子恶作剧的内容之间的关系和老化出现在文献中。一些调查发现总等离子体GAG内容并不随年龄的变化而变化(30.,31日]。相反,总血浆GAG水平和年龄之间的正相关报道在男性32]。定性分析完整的等离子体笑话用醋酸纤维素电泳显示CS进行年龄的下降33),而等离子CS解聚后的结构分析与特定的细粒/ CS dermatolyases透露显著增加数量和其电荷密度取决于年龄(34]。我们的研究结果的基础上,血浆c水平及其电荷密度似乎受到年龄的影响。此外,与性别不存在相关性。

关于动脉粥样硬化病变的存在的影响,我们发现显著差异在总等离子体CS含量(+ 21.4%),组患者和控制。这些差异是由于的水平明显高于undersulfated CS在这些患者(+ 25.3%)。

动脉粥样硬化病变的影响的统计分析类型学等离子CS含量和硫酸盐化作用模式表明,在存在软斑块CS含量明显增加,电荷密度没有显著变化,而在硬斑块的存在其电荷密度降低,而不改变其内容。

中观察到的修改的意义等离子CS的同分异构体接受动脉内膜切除术的患者可能与不同的PG /呕吐在维管组织代谢软/硬动脉粥样硬化斑块的存在。动脉粥样硬化有关硫酸软骨素蛋白聚糖的生物合成的不平衡(4- - - - - -6]。描述,6-sulfated比4-sulfated双糖增加动脉粥样硬化II型主动脉和显著降低动脉粥样硬化型V,表明血管笑料的浓度不同的影响在疾病的进展(4]。水平的提高这两个undersulfated术后血清样本中描述和normosulfated CS已经提交给冠状动脉搭桥手术的患者,建议作为指示性炎症状态的病人的35]。

在这方面,据报道,在炎性疾病CS链由bikunin大小成正比增加炎症反应的严重程度(36),而他们的硫酸盐化作用程度降低(37]。

此外,一些研究报道,硫酸盐化作用的CS模式同分异构体可能重要从氧化损伤的保护作用38- - - - - -43]。石斑鱼的抗氧化性质可以解释为笑料螯合二价阳离子的属性(如铜2 +和菲2 +负责氢氧自由基反应的起始)及其改善影响内源性抗氧化防御系统。特别是,CS同分异构体的抗氧化性质似乎与硫酸盐化作用位置4半乳糖胺残留的二糖单位。

在一个整体,我们的数据表明,等离子体CS水平和结构显著不同的动脉粥样硬化患者对控制和这些差异不取决于年龄。此外,结果表明,循环CS同分异构体的含量和分布相关的存在以及颈动脉斑块的类型。如果等离子体CS水平和结构反映,几乎部分,CS-PGs代谢受影响血管组织,测定血浆c同分异构体可能对动脉粥样硬化进展的分子机制提供信息。

因此,评价内容和分布的等离子体CS同分异构体在诊断颈动脉动脉粥样硬化可能是有用的。进一步研究对象临床动脉粥样硬化是明智的。的确,这些分子之间找到一个协会和动脉粥样硬化早期阶段可以提供病人的随访的一个重要工具试图避免凶兆脑血管事件。

承认

本研究支持由“基金会银行di萨丁岛,”萨萨里,意大利。