文摘

尽管MMP-28参与许多重要的生理和病理条件下,这种分泌蛋白酶的作用机制还不是很清楚。我们现在已经证明furin作为MMP-28分泌的分子间女伴MMP-28前肽领域的互动。用人COS-1细胞转染MMP-28 cDNA、蛋白质水平的MMP-28相当低的媒体相比,细胞溶解产物。Coexpression的MMP-28 furin cDNA导致显著增强MMP-28分泌。与预期相反,乳沟furin MMP-28的共识序列没有发生和蛋白水解活性furin在加强MMP-28分泌也同样有效。Furin和MMP-28 coimmunoprecipitated和部分coimmunolocalized转染细胞的细胞质中。Cotransfection furin cDNA也增强MMP-28诱导细胞迁移。总之,我们的数据提供了一种新颖的机制MMP-28功能的细胞furin作为分子间女伴。

1。介绍

在四十年后,发现一个两栖动物胶原酶(1],我们理解基质金属蛋白酶(MMPs)已经从区分MMP的家庭成员基于衬底偏好,核苷酸和氨基酸序列,以及最近structural-functional特征(2,3]。基质金属蛋白酶与细胞外基质降解、细胞迁移、增殖、凋亡和组织重构在许多生理和病理条件(2- - - - - -5]。锌结合地区的基本结构在催化域和半胱氨酸开关序列前肽域内保存在23日24人基质金属蛋白酶(5]。所有六个膜型基质金属蛋白酶(MT-MMPs)也包含一个配对基本氨基酸序列(参数- - - - - -X- - - - - -利斯河/参数- - - - - -Arg)之间的n端前肽域和催化领域。这种独特的主题促进乳沟和激活这些蛋白酶proprotein转化酶,如furin [6]。furin激活序列也被确定在选定分泌基质金属蛋白酶包括MMP-11 MMP-21, MMP-23,和最近的确定,MMP-28 [7- - - - - -9]。

Furin,无所不在地表达proprotein /转化酶家族的成员,主要功能细胞通过处理活性前体蛋白质功能/成熟的形式(10,11]。少,furin处理前肽(proADAMTS9和proMMP-2)可以减少功能的成熟蛋白(12,13]。Furin主要是局部的反式高尔基网络(TGN),高尔基体结构,后期负责分拣蛋白分泌途径的最终目的地。从TGN furin遵循高度管制贩运路线通过几个TGN / endosomal隔间和细胞表面14]。Furin劈开proproteins c端一侧的共识序列参数-X赖氨酸/ Arg-Arg TGN [15]。Arg残留在P1和P4裂解位点的位置是必不可少的,而P2碱性氨基酸不是必要的,但可以提高处理效率。因此,RXXR代表最小furin裂解位点。Furin调节在一些癌症,包括nonsmall肺细胞癌,鳞状细胞癌的头部和颈部,乳房癌,卵巢癌癌、恶性胶质瘤(16- - - - - -22]。furin表达升高导致增加肿瘤细胞迁移,入侵和转移。除了proproteins激活形式转换,furin也可以促进蛋白质贩卖,包括潜在MT1-MMP [23];机制增强proprotein交易还有待了解。

人类MMP-28 [24]最初指定为epilysin基于假定特定角化细胞中表达。从人类睾丸Furin随后克隆24)和肺cDNA库(25]。蛋白质包含所有典型的MMP的域。MMP-28也表示在其他正常的一个较小的程度上,完整的组织包括胃肠道、肺、肾、心脏、骨骼肌和神经系统。重组MMP-28报道降低酪蛋白(24),Nogo-A(髓组件),NCAM-1 [26),慢慢地劈开pan-MMP fluorogenic衬底(26]。除角质细胞、基底MMP-28已经报很低的表达以及其他细胞系(27]。在12个生长因子测试中,只有肿瘤坏死因子据报道上调MMP-28信使rna;MMP-28似乎不被细胞外调制矩阵表达式。MMP-28表达式是严格监管,已经涉及到组织内稳态24,28在细胞增殖,伤口修复(27),在神经系统发育和髓鞘脱失(26]。对体内基质和活化剂MMP-28 [27]。非洲爪蟾蜍MMP-28已经证明由furin体内激活(26]。Illman et al。29日)报道,过度的MMP-28肺腺癌细胞诱导epithelial-to-mesenchymal过渡和细胞入侵要求MMP-28的催化活性和细胞表面定位由MMP-28的血液结合素域。这epithelial-to-mesenchymal转型涉及的激活TGF -β接着upregulation MT1-MMP和MMP-9机制。细胞迁移的EMT细胞MMP的独立的活动。

虽然前肽领域最出名的基质金属蛋白酶的维护蛋白酶的活性,我们先前证明MT1-MMP函数的前肽域作为一个分子内女伴贩运和功能所需的蛋白酶在细胞表面(30.]。丙氨酸替代突变透露,守恒的四肽(酪氨酸⁴²- g⁴³酪氨酸⁴⁴低浓缩铀⁴⁵)前肽MT1-MMP至关重要的女伴prodomain涉及走私的函数功能MT1-MMP质膜(31日]。的兴趣,YGYL四肽完全守恒在人类和老鼠,老鼠,和非洲爪蟾蜍光滑的MMP-28 [9,26]。的功能在MMP-28 YGYL仍然是未知的。基于这样的独特功能肽在MT1-MMP [31日),我们在此检查的作用YGYL MMP-28前肽领域。我们主题的一个重要功能细胞的分泌MMP-28已经证明。潜在furin之间的胞内蛋白复合物的形成和prodomain MMP-28似乎发挥重要作用的蛋白酶分泌和功能。

2。材料和方法

2.1。试剂

低聚糖引物是购买的操纵子(铝、亨茨维尔)。pcDNA3.1和表达向量从英杰公司购买(CA)卡尔斯巴德。Anti-Myc单克隆抗体购买从罗氏(印第安纳波利斯,)。Antifurin多克隆抗体购自圣克鲁斯(圣克鲁斯,CA)。Anti-MT1-MMP铰链抗体从三相点购买生物制剂(森林树丛或)。Anti-tubulin抗体购自细胞信号技术(Davers, MA)。Alexa 568 -共轭山羊anti-mouse免疫球蛋白是从英杰公司购买(CA)卡尔斯巴德。Endoglycosidase H和肽:N-glycosidase F购买形式罗氏(印第安纳波利斯,)和内(伊普斯维奇,MA),分别。野生型、可溶性和显性负furin ()的互补是前面描述的(32]。MT1-MMP,嵌合体(33]和MMP-28 cDNA [24以前报道。

2.2。细胞培养和转染

COS-1细胞从写明ATCC购买(马纳萨斯,弗吉尼亚州),维护在杜尔贝科修改鹰的介质(表达载体)。质粒转染到COS-1细胞使用试剂(Bio-Rad, CA)。转染细胞在DMEM培养48 h在37°C含10%胎牛血清(FCS)。

2.3。构建质粒

MMP-28 carboxy-terminal Myc标签(MMP-28 / Myc)生成使用pcDNA3.1表达载体(表达载体)。包含的开放阅读框的MMP-28 cDNA MMP-28使用引物的PCR方法扩大了集:底漆,数量1086:5′3′:AAGAATTCCGGCGAGATGGTCGCGCGCGTC和反向引物,1117号:- - - - - -AAAAGCTTGAACAGGGCGCTCCCCGAGTTGGC。PCR结果片段克隆到pcDNA3.1向量在EcoR我和后第三网站生成MMP-28 / Myc嵌合的互补。

构造一个既定的活动MMP-28 / Myc (/ Myc),谷氨酸()转化为丙氨酸MMP-28的pcr诱变方法使用野生型MMP-28 / Myc作为模板与突变引物(底漆,没有。1166年,5′3′:TGGTGCTGGCGCACGCGATCGGTCACACGC和反向引物,不。1167年,5′3′:GCGTGTGACCGAT公司治理文化GTGCGCCAGCACC)(下划线字母代表突变网站)(快速改变定点诱变工具包,Stratagene)来生成。使用类似的方法,,,生成与底漆集:(向前,5′3′:ACCAAACTGAGGCGTAAGGCAGCCTTTGCAAAGCAAGGTAA和反向引物5′3′:TTACCTTGCTTTGCAAAGGCTGCCTTACGCCTCATTTTGGT);(向前引物5′3′:GCGGAGGCATTCCT AGAGAAGGCCGCATACCTCAATGAACAGGTCCCC和反向引物5′3′:GGGGACCT GTTCATTGAGGTATGCGGCCTTCTCTAGGAATGCCTC公司治理文化);和(向前引物5′3′:GCATTCCTAGAGAAGTACGGAGCCGCCAATGAACAGGTCCCCAAAGCT;和反向引物5′3′:AGCTTTGGGGACCTG TTCATTGGCGGCTCCGTACTTCTC TAGGAATGC)。所有结构被DNA测序验证。

2.4。Immunofluorescent染色和激光扫描共焦显微镜

培养细胞和4%多聚甲醛固定(PFA) / PBS阻塞3% BSA / PBS紧随其后。MMP28-Myc和furin检测到抗体对Myc标签(MMP-28)和furin二级抗体共轭Alexa 568和FITC紧随其后(表达载体)。应用细胞检查使用蔡司LSM 510元NLO双光子激光扫描共焦显微镜系统。

2.5。Co-Immunoprecipitation

COS-1细胞cotransfected furin连同MMP-28 / Myc或MT1-MMP / Myc的互补与•瑞帕裂解缓冲细胞溶解。还救了一个整除的原样品来评估转染细胞的蛋白表达蛋白免疫印迹。细胞溶解产物与antifurin抗体免疫沉淀反应后通过捕获抗原抗体复合物与琼脂糖珠蛋白(表达载体)。Myc标记MMP-28和MT1-MMP复合物分离通过sds - page(10%聚丙烯酰胺凝胶)和使用anti-Myc抗体进行免疫印迹。在互惠coimmunoprecipitation实验中,细胞溶解产物与anti-Myc抗体免疫沉淀反应后通过免疫印迹antifurin抗体。

2.6。消化与EndoHand PNGase F

COS-1细胞转染的细胞溶解产物与MMP-28 furin煮10分钟在变性缓冲区包含1% 2-mercaptoethanol和0.5% SDS充分暴露所有的糖基化网站,然后deglycosylation是由治疗Endo H或PNGase F在37°C 3 H。这些酶反应中使用的缓冲区50 mM柠檬酸钠(pH值5.5)Endo H和50毫米磷酸钠(pH值7.5)含1%诺乃清洁剂p 40 PNGase f .样本然后通过sds - page分离之后,使用anti-Myc抗体免疫印迹。

2.7。Transwell迁移分析

聚碳酸酯膜13毫米直径的8μ米孔隙大小(神经探针,MD)插入到Blind-Well趋药性的钱伯斯(神经探针,MD)。播种到transwell插入之前,COS-1细胞从盘子trypsin-EDTA和释放细胞/好放置在顶部商会transwell迁移钱伯斯在一式三份。众议院充满DMEM含有10% FCS (200μL)。6小时后,COS-1细胞没有迁移到下议院被移除的上表面transwell膜用棉签。降低膜表面的迁移细胞固定,沾0.1%结晶紫,在显微镜下检查。细胞的数量在10个地区的过滤器是计算获得迁移细胞的数量。每个实验重复三次。

2.8。统计分析

数据提出了的意思扫描电镜。采用GraphPad棱镜5,利用学生的统计显著性进行了测试t以及(与和)。

2.9。程序制备细胞溶解产物和免疫印迹

基本协议描述了这些技术在最近的一篇论文(34]。

3所示。结果

我们之前证明MT1-MMP作为一个分子内伴侣蛋白的前肽领域所需的走私和质膜上的蛋白酶的功能(30.,35,36]。我们进一步证明了守恒的⁴²YGYL⁴⁵前肽内的序列,这是目前所有六个成员MT-MMP亚科,出现功能分子内伴侣的关键(31日]。通过分析分泌基质金属蛋白酶的氨基酸序列,前肽域MMP-19和-28被发现包含相同的YGYL序列和RXXR furin共识主题显示在MT-MMPs(图1)。这些观察结果使我们思考是否YGYL序列MMP-28分泌的授予一个类似的功能。

3.1。表达MMP-28 COS-1细胞:Furin MMP-28促进分泌

确定的要求YGYL主题前肽域内蛋白质贩运和分泌,MMP-28 / Myc cDNA暂时性的转染到COS-1细胞随后使用anti-Myc抗体免疫印迹。但出乎意料的是,(分泌)MMP-28 / Myc几乎没有细胞条件培养液(图中发现2(一个));大部分的重组蛋白被发现在细胞溶解产物。两个MMP-28乐队近似56 kDa的分子质量和52 kDa的细胞溶解产物(图2(一个))。其他实验进行破译MMP-28的有限的分泌。减少分泌MMP-28并非由于故障MMP-28的氨基端信号肽,由于更换信号肽的互补脱氧核糖核酸的MMP-28 MT1-MMP没有提高MMP-28嵌合体的分泌(数据没有显示)。

自MMP-28带有RKKR furin前肽和催化域之间的共识序列(图1),我们furin的预期反式高尔基网络(TGN)就会裂开之前激活MMP-28分泌,导致两种不同的分子(参见下面的解释)。为了验证这种可能性,COS-1细胞cotransfected MMP-28 / Myc连同furin或GFP(控制)的互补。18个小时后,条件媒体和细胞溶解产物收集和使用anti-Myc抗体进行免疫印迹。出乎意料地,coexpression MMP-28 furin导致增加分泌MMP-28条件媒体(图2(一个))。相比之下,MMP-28的细胞溶解产物总量似乎并未受到coexpression furin(图2(一个))。相对MMP-28 mRNA水平没有影响cotransfection furin cDNA,最小化furin的作用在调节转录(图2 (b))。

虽然分子量差异紧身上衣乐队(56和52 kDa)细胞溶解产物的MMP-28不到~ 10 kDa的不同预期之间的潜在的和基质金属蛋白酶激活,需要更多的研究来确定furin劈理(激活)proMMP-28增强分泌所需。为此,我们采用丧失突变的furin之前报道(12]。COS-1细胞的转染活性furin (互补脱氧核糖核酸或可溶性furin (Sol.Furin)互补脱氧核糖核酸(12]导致增强MMP-28分泌;没有作用的表观分子量MMP-28野生型之间指出furin或突变furin-transfected细胞(图2 (c))。此外,COS-1细胞的转染野生型furin cDNA以及含丙氨酸MMP-28 cDNA中断furin共识序列(R^119年KAA R的相反^119年KKR)没有改变MMP-28紧身上衣的分泌蛋白质乐队(图2 (d))。使用另一种方法来确定是否需要激活proMMP-28分泌之前,谷氨酸丙氨酸替代突变(——)在催化领域应用技术来生成一个nonproteolytic MMP [37]。孵化与MMP-28 COS-1细胞转染——cDNA或野生型孵化MMP-28转染COS-1细胞具有广谱MMP抑制剂(BB94数据未显示)没有废除furin-induced分泌MMP-28(图2 (d))。此外,条件媒体COS-1细胞转染MMP-28或MMP-28连同furin互补dna蛋白水解活性不显著使用fluorogenic基质试验(38(数据未显示)。这些结果表明,furin促进分泌的MMP-28 COS-1细胞没有处理/解理的潜在形式的蛋白酶。

鉴于缺乏证据的蛋白水解乳沟解释MMP-28的紧身上衣的乐队,我们继续探索报告期间,MMP-28 N-glycosylated分泌贩卖(39]。测试如果糖化MMP-28 COS-1表达细胞,细胞条件培养基从COS-1 cotransfected MMP-28和furin互补是接受endoglycosidase H和肽:N-glycosidase F (PNGase F)。endoglycosidase H劈开asparagine-linked oligomannose和混合,但不复杂,糖蛋白的寡糖,生成一个截断糖分子与一个N-acetylglucosamine残渣剩余的天冬酰胺。相比之下,PNGase F劈开asparagine-linked高甘露糖混合以及复杂的糖蛋白的寡糖。在我们的实验中,两种糖苷酶导致转换的双重MMP-28低分子量的乐队(图3)表明较高的乐队代表了N-glycosylated MMP-28形式。

3.2。要求MMP-28 YL图案的分泌

进一步描述是否YGYL氨基酸序列(31日]MMP-28域前肽的分泌,需要一系列的点突变是使用定点诱变方法生成。COS-1细胞cotransfected furin cDNA野生型和突变MMP-28 / Myc的互补。无血清条件媒体收集和MMP-28 / Myc分泌评估。四肽(YGYL)丙氨酸替代突变导致减少MMP-28分泌(数据没有显示)。的四肽YGYL tyrosine-leucine (Y⁴⁵l⁴⁶)前肽的氨基酸序列MMP-28 MMP-28 furin-induced分泌的是至关重要的。与野生型相比MMP-28,分泌没有增加的cotransfection furin cDNA 28(图2 (d))。tyrosine-glycine突变()氨基酸序列MMP-28分泌(图上没有影响2 (d))。这些结果表明,酪氨酸⁴⁵低浓缩铀⁴⁶主题需要MMP-28分泌。

3.3。复杂地层MMP-28和Furin之间

自从furin扮演一个关键nonproteolytic MMP-28分泌,我们追求的可能性furin可以作为分子间女伴MMP-28贩运。为此,COS-1细胞cotransfected MMP-28 / Myc cDNA连同furin cDNA或GFP的互补。细胞溶解产物收集和免疫沉淀反应MMP-28 / Myc复合物进行使用鼠标单克隆anti-Myc抗体。如图4(一),免疫印迹雇佣一只兔子抗体furin透露furin-MMP-28复杂的存在。这种交互也明显细胞转染MMP-28和既定的活动,这表明MMP28-Myc之间的交互和furin furin的激活状态无关。在互惠coimmunoprecipitation实验中,MMP28-Myc furin-immunoprecipitated中也可以检测到复杂(图4 (b))。作为co-immunoprecipitation积极控制实验中,我们证实myc-tagged MT1-MMP形式与furin复合物(图4 (b))。

已经证明furin合成在内质网(ER)然后成为本地化TGN和细胞表面40,41]。基于我们的生化数据展示复杂地层MMP-28和furin之间,我们采用双间接免疫荧光染色的方法之后,共焦显微镜检查,以确定这些蛋白质的胞内定位(图4 (c))。通过分析染色MMP-28模式/ Myc和furin五单个细胞的胞质囊泡和120年彩色泡在每个细胞,70%的平均MMP-28同样被发现与furin colocalize转染COS-1细胞囊泡。综上所述,这些数据表明,furin与MMP-28分泌囊泡。

3.4。前肽域内的最小要求主题MMP-28 Furin对于复杂地层

Furin报道与基质金属蛋白酶的前肽领域包含RXXR前肽之间的主题域和催化域的MMP激活(7,23]。确定furin也为MMP的交易与其他领域,我们驾驶实验采用先前生成域交换和删除构造MT1-MMP cDNA [33,42转染到COS-1细胞。MT1-MMP Coimmunoprecipitation细胞溶解产物使用抗体,随后使用furin抗体,免疫印迹证实MT1-MMP之间复杂的形成和furin(图5(一个))。而替换的催化域()或血液结合素域()MT1-MMP MMP-2 cDNA没有改变与相应地区的复杂地层,删除前肽MT1-MMP域()导致废除复杂furin和MT1-MMP之间形成。相互作用的失败与furin不是由于缺乏表达式,证明了使用anti-MT1-MMP抗体免疫印迹的整除的细胞溶解产物(图5(一个),下半部分)。这些数据符合要求与furin前肽在复杂地层。

为了研究特定领域的MMP-28与furin需要互动,我们比较前肽的氨基酸序列域MT1-MMP MMP-28。这一分析显示42%序列MT1-MMP和MMP-28(图之间的身份1)。身份最高的地区位于小说Y⁴³GYL⁴⁶主题,c端附近地区包含PRCGVPD半胱氨酸切换地区常见的基质金属蛋白酶,和c端端包含RKKR furin共识序列。与MT1-MMP基于类比,我们集中在前肽域和证明,整个前肽的删除域MMP-28 MMP-28导致损失的能力与furin coimmunoprecipitate(数据没有显示)。来解剖YGYL主题的角色与furin MMP-28的互动,互补编码野生型和突变MMP-28 YGYL主题与furin cotransfected紧随其后coimmunopre cipitation。在随后的免疫印迹描绘在图5 (b)tyrosine-lycine ()前肽的序列MMP-28被证明是至关重要的对于复杂地层MMP-28和furin之间。前肽域的删除YGYL MMP-28也导致未能与furin coimmunoprecipitate(数据没有显示)。有趣的是,furin共识序列的突变(RKKR)被发现没有影响furin复杂的形成。同意coimmunoprecipitation数据,激活MMP-28不是一个先决条件与furin因为替换的关键催化谷氨酸残基丙氨酸(a等)29日MMP-28没有干扰的复杂突变MMP-28和furin之间形成。这些数据突出了关键作用MMP-28 YL主题在前肽域的绑定furin和促进MMP-28分泌。

3.5。Furin增强MMP-28-Induced细胞迁移

我们先前已经表明,激活proMMP-28,以及proMMP-9 proMT1-MMP,不是一个先决条件增强细胞迁移通过裸膜8毛孔(34]。评估的功能效应furin MMP-28-induced细胞迁移,细胞COS-1与furin cotransfected连同MMP-28 cDNA或GFP cDNA控制transwell室迁移试验紧随其后。符合我们之前的观察(34),表达MMP-28 COS-1细胞明显增强细胞迁移相比GFP控制()(图6)。MMP-28-induced细胞迁移是进一步提高通过coexpression furin相比furin + GFP cDNA转染细胞()。Furin也有类似的影响提高MT1-MMP cDNA转染COS-1细胞的迁移(图6)。这些结果支持这一概念,furin作为分子间女伴MMP-28增强分泌,促进细胞迁移独立的蛋白水解活性。

4所示。讨论

最近发现MMP的MMP-28,涉及重要生理和病理过程包括神经发展(26),组织修复(24),细菌感染(43),和癌症(29日]。在这个报告中,我们提出一个独特的机制MMP-28分泌前肽域之间的交互MMP-28和furin MMP-28分泌的先决条件。相反的经典角色furin裂开前肽的基质金属蛋白酶在furin共识序列,furin-induced前肽的乳沟MMP-28没有观察到。丙氨酸取代突变前肽内MMP-28证明furin作为分子间女伴MMP-28分泌通过直接与酪氨酸的交互⁴⁵低浓缩铀⁴⁶前肽MMP-28领域的主题。

在我们最初的研究从转染COS-1细胞释放MMP-28,我们遇到意想不到的困难在条件检测MMP-28媒体。尽管MMP-28容易检测到细胞溶解产物,异位表达的MMP-28 COS-1细胞导致最小释放MMP-28条件培养基。然而,coexpression furin与MMP-28 cDNA COS-1细胞导致显著增强分泌proMMP-28(图2(一个))。MMP-28分泌的增加furin不伴随着upregulation MMP-28基因表达(图2 (b))。这些数据表明,furin增强贩卖/ MMP-28分泌。

YGYL主题是高度保守的膜型基质金属蛋白酶,被发现是必不可少的MT1-MMP质膜定位(31日]。在分泌基质金属蛋白酶中,只有MMP-19和-28年前肽领域拥有这个主题。在MMP-28 YGYL主题是守恒的人类,老鼠,老鼠,非洲爪蟾蜍光滑的蛋白质(9]。使用突变分析,我们证明了YL coimmunoprecipitation YGYL主题至关重要的和furin MMP-28分泌分泌(数字2 (d)和5)。

细胞的分泌MMP-28被报道变量在不同条件下(44]。MMP-28报道通过furin劈理机制被激活,导致分子质量的变化~ 58 kDa ~ 48 kDa [39]。这是符合99个氨基酸的前肽领域内容(9)和11.9 kDa的推断分子质量。相比之下,我们证明coexpression furin proMMP-28 cDNA COS-1细胞并没有导致MMP-28的激活。尽管我们发现了一个双重免疫印迹分析MMP-28的转染细胞溶解产物和条件媒体,紧身上衣的质量的差异~ 5 kDa(图2)。采用Endo H和PNGase F,我们表明,上层乐队代表了一种糖化MMP-28(图。3)。据报道小鼠MMP-28也被N-glycosylated [39]。

MMP-28分泌入条件媒体furin-cleaved蛋白(Mr-48 kDa)据报道与人类HT1080纤维肉瘤,海拉宫颈癌细胞和肺腺癌A549细胞转染用鼠标MMP-28互补脱氧核糖核酸(29日,39,44]。相比之下,免疫印迹分析条件媒体隔绝是暂时性的转染CHO细胞识别潜在的MMP-28蛋白质的58岁的57岁和52 kDa;激活MMP-28(没有被观察到39]。之间的差异没有激活MMP-28转染良性的COS-1细胞(图2)和CHO细胞激活MMP-28相比转染肿瘤细胞不能容易解释了。理论上,preprotein转化酶含有furin-consensus furin负责激活基质金属蛋白酶序列(6]。越来越多的证据也表明,乳沟MMP MT1-MMP,在furin共识序列不是一个先决条件的激活MT1-MMP [30.,31日,35,45,46]。采用furin抑制剂,Dec-CMK MT1-MMP表达VSMCs Kappert et al。47]表明MT1-MMP酶活性没有受到furin抑制剂的影响,建议不需要furin MT1-MMP / MMP-2蛋白水解主要VSMCs激活级联。提出了MT1-MMP furin-independent通路的激活(48,49]。这些差异反映了复杂的分子和细胞生物学和详细机制仍有待理解这些差异。

在这个报告中,我们表明,furin MMP-28和MT1-MMP形成复杂,涉及他们的前肽域(图5)。这种交互似乎促进MT1-MMP质膜贩运和MMP-28分泌30.,31日,35,36]。虽然MMP-28包含一个成对的碱性氨基酸(RKKR) furin裂解位点之间的前肽和催化领域,我们发现突变在MMP-28这个网站没有损害furin-enhanced MMP-28分泌。此外,结构上不活跃furin拥有有增无减增强MMP-28分泌的能力。共焦显微镜显示了furin和MMP-28检测到细胞,主要在细胞核周围的地区。虽然这co-localization染色本身并非结论性的交互的MMP-28和furin之间,我们的生化数据一起采用免疫染色数据证明MMP-28的确与furin分泌途径。我们的数据与先前的报道显示,在协议furin-induced furin共识序列的乳沟proproteins[干扰素-(50),透明带糖蛋白ZP3 [50],proneurotrophin-3 [51]]没有必要proprotein贩卖/分泌。

MMP-28报道既提高(34和减少44细胞迁移。MMP-28 Illman等人报道,酶活性的人类A549肺癌不是一个先决条件增强细胞迁移(29日]。同意这些观点,我们表明转染MMP-28 cDNA COS-1细胞导致增强的迁移;furin co-transfection进一步促进细胞迁移。相比之下,Manicone et al。43]MMP-28-null小鼠肺炎模型用来证明MMP-28抑制巨噬细胞的迁移;身份不明的因素在血清牵连(52]。

总之,我们观察到的一本小说的角色为MMP-28分泌furin作为伴侣。这个增强的分泌是基于交互的furin YL前肽MMP-28领域的主题。这些发现增加了小说的功能列表furin YGYL域的和不同的特征选择基质金属蛋白酶。

缩写

基质金属蛋白酶:	基质金属蛋白酶
Endo H:	Endoglycosidase H
PNGase F:	多肽N- - - - - -糖苷酶F
干扰素-:	干扰素- - - - - -γ
TGN:	反式高尔基网络
产生HPRT:	次黄嘌呤ribosyltransferase
G6PDH:	Glucose-6-phosphate脱氢酶。

确认

作者感谢Pallavi Kozarekar她的技术援助。这项工作是由国家卫生研究院资助(5 ro1ca11355301a1) (J.C.)和绩效评估格兰特的退伍军人事务部(S.Z.)。