促有丝分裂的凝集素的纯化和表征Cephalosporium,致病性真菌引起的感染性角膜炎

文摘

眼科真菌病引起的传染性真菌被认为是一个严重的问题,因为它们会导致完全失明。Cephalosporium是一个在多个机会性真菌物种涉及眼科感染导致的感染性角膜炎。促有丝分裂的凝集素被纯化的真菌的菌丝Cephalosporium,孤立的角膜炎患者的角膜涂片。Cephalosporium植物血凝素(CSL)是一个四聚物与亚基的质量14 kDa,啤切人类a, B,和O红细胞,表现出高度的亲和力粘蛋白相比,胎球蛋白和asialofetuin但不绑定到单糖指示其复杂糖专一性。CSL显示强约束力的正常人类外周血单核细胞(PBMCs)引起促有丝分裂的活动。糖专一性凝集素及其与PBMCs互动展示促有丝分裂的影响表明其附着力和感染过程中可能的作用Cephalosporium。

1。介绍

眼科感染真菌而不是细菌引起的严重关切在许多发展中国家,因为它们导致失明。眼部真菌感染被称为眼科真菌病是导致角膜炎角膜(1]。一些真菌物种负责霉菌病的角膜炎和其他形式的眼部感染了最近[2,3]。镰刀菌素和Cephalosporium(枝顶孢属)是广泛的真菌物种,属于透明丝状组为眼科与真菌病(3]。所涉及的关键因素的感染性角膜炎的发病机制包括粘附、侵袭性、形态发生和产毒性4]。真菌凝集素越来越重要,因为它们涉及特定的过程识别寄生虫真菌及其宿主细胞之间,涉及protein-carbohydrate相互作用导致感染(5]。凝集素的蛋白质构成异质群体多发地起源与非催化结合位点能够识别和可逆地绑定到特定的碳水化合物(半个6]。虽然有几种报告从高等真菌凝集素7),很少有凝集素从动植物病原真菌是报道5,8- - - - - -13]。此外,更多关注的是真菌凝集素很多展览有趣的生理效应如lymphomitogenic活动,免疫调节作用,抑制细胞增殖和抗肿瘤活性(14]。

本文报道净化、表征和促有丝分裂的活动对人类PBMCs凝集素Cephalosporium,致病真菌,分离出感染角膜炎患者的注意。

2。材料和方法

2.1。真菌文化

真菌分离角膜涂片的真菌性角膜炎的48岁的女病人。角膜差点崩溃在Sabourd接种的葡萄糖琼脂(SDA)偏和股票文化保持在SDA偏。Cephalosporium文化是生长在500毫升厄伦美厄烧瓶内包含100毫升Byrde液体合成媒体(0.696 g K,0.149 g氯化钾,0.008 g的硫化锌2啊,0.2 g出来,0.2 g菲斯,0.006 g MnS,1 g N每升蒸馏水)与2%葡萄糖和孵化在室温下在静止的条件下(15]。10天后,菌丝团是收获,用蒸馏水洗净纱布。菌丝的质量随后冻结干和粉玻璃砂浆,并储存在细粉C和用于外源凝集素的纯化。

2.2。材料

粘蛋白(猪胃,类型III),胎球蛋白(胎牛血清),PHA-L, Histopaque 1077和细糖用于半抗原抑制研究从西格玛化工有限公司购买美国圣路易斯。琼脂糖4 b是来自法玛西亚精细化工,瑞典乌普萨拉。由斯皮罗和Bhoyroo Asialofetuin制备所述16]。Asialofetuin-Sepharose 4 b,关联矩阵,是由耦合asialofetuin氰bromide-activated琼脂糖4 b的方法[3月17]。氚标记的胸苷从英国采购(辐射和同位素技术委员会),印度。组织培养瓶和96孔板采购从NUNC(丹麦)。人类血液样本来自健康中心,Karnatak大学Dharwad,印度,机构审查委员会的批准。所有其他化学物质的分析试剂级。

2.3。CSL的分离和纯化

干Cephalosporium菌丝的粉末是均质在50毫升(1:50 w / v)50 mM钠磷酸盐缓冲剂,pH值7.2,包含154毫米氯化钠(PBS) 5分钟,搅拌过夜c .提取是离心机(9500 xg) 30分钟c .得到的上层清液膜过滤(0.45米)和用于外源凝集素的纯化。亲和色谱法的粗提取液受到asialofetuin-Sepharose 4 b列(101.3厘米),平衡与PBS和3毫升分数的流量收集15毫升/小时。列的洗涤与PBS继续,直到吸光度的淋洗分数读0 280海里(双光束分光光度计、日立2800)。结合凝集素与glycine-HCl筛选了缓冲区(100毫米,pH值2.0)包含500毫米氯化钠。分数含有凝集素活动汇集和透析广泛与PBS和存储C进行进一步的研究。

2.4。红细胞凝集试验和半抗原抑制研究

红细胞凝集活性CSL在不同阶段的净化是由串行两倍稀释法使用使胰蛋白酶化人类红细胞在96年,“U”底部微效价板(18]。提取的最高稀释导致可见红血球凝聚被视为滴定度和所需的最低浓度的蛋白质凝集(MCA)作为一个单元的红血球凝聚活动。具体的红血球凝聚活动表示为单位蛋白质。纯化的糖专一性凝集素是由半抗原抑制试验。抑制化验是由孵化凝集素样例(红血球凝聚的滴定度4)之前用连续稀释的糖/糖蛋白的红细胞总量的50l,红血球凝聚视觉观察。的最低抑制浓度的糖/糖蛋白作为半抗原抑制滴定度。

蛋白质浓度测定通常由洛瑞的方法(19)和可溶性总糖含量的凝集素是用苯酚-硫酸法估计20.]。

2.5。分子质量评估

纯化凝集素的分子质量是由15% sds - page凝胶,据Laemmli的方法(21),通过凝胶过滤色谱superdex (1.5 g - 75列80厘米,在PBS) precalibrated标准已知分子量的蛋白质。

2.6。人类PBMCs CSL的绑定

人类外周血单核细胞(PBMCs)从健康的捐赠者的血液密度梯度分离使用histopaque - 1077(σ)和resuspended在完全培养基(RPMI 1640 + 10% FCS)。荧光素isothiocyanate-conjugated CSL (FITC-CSL)流式细胞术所需准备使用高盛的协议22]。CSL的绑定PBMCs决心通过流式细胞术。细胞()与FITC-CSL孵化(2g / 100l) 1小时在冰上,用50 mM PBS彻底清洗,然后刚做好的多聚甲醛固定为2%。数据是10000事件使用流式细胞仪优势(Becton Dickson)配备了488 nm氩激光器与Cellquest-pro软件和分析确定%积极性和平均荧光强度(MFI)。无污点的细胞同样被用作负控制加工而成。

受体介导CSL PBMCs绑定是由preincubating FITC-CSL粘蛋白,胎球蛋白和asialofetuin (100g / ml)在室温下1小时。这lectin-sugar复杂添加到PBMCs准备并通过流式细胞术分析。

2.7。促有丝分裂的活动氚化胸苷掺入试验

新孤立PBMCs是悬浮在含有10% FCS rpmi - 1640细胞/ 100l /好96年镀好细胞培养板(NUNC、丹麦)和孵化CSL浓度从0.62510 g / mlg / ml 72小时在5% C。与PHA-L PBMCs刺激(0.1562.5 g / ml化学g / ml,σ)被用作积极控制。细胞与氚化胸苷(1脉冲Ci /英国人,印度)18小时收获之前,公司是测量每分钟计数(CPM)。

2.8。统计分析

使用学生的统计分析以及和Mann-Whitney排名和测试。一个P值<。05年被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。凝集素的分离和纯化Cephalosporium的菌丝体

凝集素的纯化是同质性在一个一步亲和色谱法asialofetuin-Sepharose列(图4 b1)。褶皱净化和总%复苏纯化凝集素的1 g的干菌丝的粉末进行了总结在表1;所需的最低浓度的蛋白质凝集1.145 (MCA)被发现粗提物和0.021 g为净化凝集素g。筛选了凝集素被发现同质,揭示了单带在15% sds - page凝胶(图1插图)。14亚基分子量kDa凝集素通过sds - page估计,而分子质量估计57 kDa的凝胶过滤色谱法(图2),表明植物血凝素的四聚物的性质。纯化CSL凝集的人类红细胞血型,表明它有一个血型特异性的本性。半抗原抑制研究表明,CSL的红血球凝聚活动被粘蛋白,抑制胎球蛋白,asialofetuin,粘蛋白是最强有力的抑制剂和最低抑制浓度(MIC)为0.785g / 50l(表2)。

3.2。人类PBMCs CSL的绑定

研究与PBMCs CSL之间的相互作用,细胞染色与FITC-CSL及其绑定被流式细胞术分析。如图3(一个),99.62%的细胞被发现阳性CSL绑定,与平均荧光强度(MFI)为411.27,相比,控制细胞无污点的积极性被设置为1%,这个1%的MFI细胞是76.89。受体介导的外源凝集素结合PBMCs证实了研究中超pre-incubation后绑定的凝集素与不同竞争glycoconjugates或半抗原。流式细胞术直方图CSL绑定与粘蛋白前后PBMCs阻塞,胎球蛋白,asialofetuin给出数据3(一个),3 (b),3 (c),3 (d),分别。粘蛋白在100克/毫升浓度是最有效的抑制剂CSL胎球蛋白和asialofetuin紧随其后,享年100岁克/毫升。

3.3。促有丝分裂的CSL的活动

促有丝分裂的影响,对人类PBMCs CSL是由氚化胸苷掺入试验。由人类PBMCs CSL刺激胸苷的吸收剂量依赖性的方式,以最大的合并发生在10不同剂量的g / ml检测(0.625 -10g / ml),而PHA-L、积极控制表现出最大扩散为1.25克/毫升(图4)。

4所示。讨论

在目前的研究中,凝集素从人类致病真菌Cephalosporium从霉菌的分离角膜炎患者纯化一步亲和色谱法在一个单一的同质性在asialo fetuin-Sepharose 4 b。CSL,四聚物,没有血型专一性,复杂的糖专一性和促有丝分裂的人类PBMCs活动。在过去的十年里,大批真菌凝集素报告,其中多数来自高等真菌,主要来自蘑菇子实体[7,23]。然而,很少凝集素是已知的真菌菌丝形成的低,特别是致病真菌、寄生虫与宿主相互作用尽管真菌凝集素与[5]。人们越来越意识到真菌凝集素像细菌凝集素粘附和感染过程中也发挥着重要的作用。几个透明丝状真菌被认为是机会主义的人类病原体(3]。大多数这些病原体表达表面因素,凝集素,调解绑定到宿主细胞的胞外基质糖蛋白。这样的绑定将促进真菌依从性并能诱导宿主细胞的免疫调节作用。在这方面,人类PBMCs CSL产生促有丝分裂的活动。到目前为止,很少有凝集素包括从人类致病真菌白色念珠菌,假丝酵母glabrata,荚膜组织胞浆菌,来自烟曲霉菌,Trycophyton石(5,10,24,25]。的凝集素白念珠菌它承认Fucα1-2Galβ,发生在所有血型物质的ABO血型类型,涉及坚持人类口腔上皮细胞(9]。一个32 kDa凝集素纯化答:来自烟,与唾液酸特异性建议发挥重要作用在附件的分生孢子宿主细胞的胞外基质成分10]。答:来自烟是一种已知的机会病原体负责各种眼科感染如泪囊炎、巩膜炎、眼内炎3]。一个细胞外凝集素Trycophyton石,著名的皮肤真菌对sialo特异性寡糖有牵连的粘附宿主细胞(25]。

没有直接的证据可以证实凝集素的作用在调节宿主寄生虫从这些病原体相互作用和免疫调节对宿主细胞的影响。相反,一些凝集素从高等真菌起到有趣的免疫调节作用。凝集素的诉volvacea和牛肝菌属菌类satanas对人类PBMCs[楞次展览促有丝分裂的影响26,27),而茶薪菇和裂褶菌属公社对小鼠脾细胞产生促有丝分裂的影响(28,29日]。的促有丝分裂的凝集素类似诉volvacea f中孢子,和灵芝被证明具有免疫调节作用[30.- - - - - -32),这种促有丝分裂的凝集素之间潜在的应用有重要的诊断和实验工具研究细胞生长和分化的各个方面。受体介导的绑定CSL人类PBMCs显然表明,因为它可以有效地阻止了竞争glycoconjugates如粘蛋白、胎球蛋白和asialofetuin。这些结果证实由半抗原抑制我们的观察研究,CSL优惠对胎球蛋白或asialofetuin相比粘蛋白亲和力。CSL的促有丝分裂的潜力被观察到的增加存在剂量依赖的相关性表明PBMCs扩散。

总之,与复杂的糖凝集素特异性纯化的病原真菌Cephalosporium,负责眼科真菌病,展品促有丝分裂的和红血球凝聚活动。这是为数不多的凝集素的特点从致病真菌报道和信息提供了有价值的理解占凝集素介导开始交互在真菌感染。

确认

作者感谢教授Arunaloke Chakrabarti、医学微生物学、民族文化的致病性真菌(NCCPF) PGIMER、昌迪加尔(印度)的鉴定真菌文化。这项工作是支持格兰特(SR /那么/ BB / 43/2003)由科技部资助,新德里,印度。

引用

1. l·a·莱文r·艾弗里j . w .海岸,j . j .伍格和a . s . Baker”轨道曲霉病的光谱:临床病理的审查,”眼科学的调查第41卷。。2、142 - 154年,1996页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. s . a . Klotz c·c·佩恩g . j . Negvesky和s . i Butrus真菌和寄生虫感染的眼睛,“临床微生物学检查,13卷,不。4、662 - 685年,2000页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. p·a·托马斯在眼科真菌病目前的观点,“临床微生物学检查,16卷,不。4、730 - 797年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. s . Ananthi t . Chitra r·比尼人n . v .般若p . Lalitha和k . Dharmalingam”撕裂的比较分析蛋白质在霉菌的角膜炎患者,”分子的愿景,14卷,第507 - 500页,2008年。视图:谷歌学术搜索
5. m·j·s·Mendes-Giannini m·l·泰勒,j·b·Bouchara et al .,”病机II:真菌对宿主反应:由于真菌的宿主细胞相互作用,“医学真菌学,38卷,第123 - 113页,2000年。视图:谷歌学术搜索
6. j·戈尔茨坦,r·c·休斯m . Monsigny大泽生,t . n .沙龙,“什么应该被称为凝集素?”自然,卷285,不。5760,66年,页1980。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. 第5期和g . Konska“高等真菌,凝集素”生物化学分类学和生态学,25卷,不。3、203 - 230年,1997页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. 中情局Ceitchley和l . j . Douglas”苷作为上皮细胞受体的作用白色念珠菌”,《将军和应用微生物学杂志》上,卷133,不。3、637 - 643年,1987页。视图:谷歌学术搜索
9. d .臂铠,a . Woltz m . Golliard J.-R。需要雇”,体外粘附的抑制白色念珠菌临床分离株对人类Fuc口腔上皮细胞$\alpha$1 - 2加$\beta$其复杂的碳水化合物,”感染和免疫卷,59号5,1605 - 1613年,1991页。视图:谷歌学术搜索
10. g . Tronchin k . Esnault m·桑切斯·g·落叶松,a . Marot-Leblond和j . Bouchara 32-kilodalton唾液酸的净化和部分特性特定外源凝集素Aspargillus来自烟”,感染和免疫,卷70,不。12日,第6895 - 6891页,2002年。视图:谷歌学术搜索
11. b . m .哲人,a·g·Bhat g . v .对冲基金,r·s·奈克,s . Kulkarni和s . r . Inamdar Immunolocalization和功能的作用菌核rolfsii凝集素在开发交互与其内生真菌的受体,”糖生物学,14卷,不。11日,第957 - 951页,2004年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. d . d .列奥尼达斯b . m .哲人g . n . Hatzopoulos et al .,“结构性碳水化合物识别的基础菌核rolfsii植物血凝素”,分子生物学杂志,卷368,不。4、1145 - 1161年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. j . Bhowal a·k·古和b . p . Chatterjee唾液酸的净化和分子特性特定外源凝集素的植物病原真菌Macrophomina phaseolina”,碳水化合物的研究,卷340,不。12日,第1982 - 1973页,2005年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. g . Konska“高等真菌(macromycetes)——出现,凝集素生理作用,和生物活动,“国际期刊的药用蘑菇,8卷,不。1,19-30,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. r . j . Byrde j·f·哈里斯,d .丘鹬“真菌解毒作用的新陈代谢$\omega$(2 - naphthyloxy)$n$-alkylcarboxylic酸的黑曲霉”,生物化学杂志,卷64,不。1,第160 - 154页,1956。视图:谷歌学术搜索
16. r·g·斯皮罗和v . d . Bhoyroo O-glycosidically与碳水化合物的结构单位的胎球蛋白,”生物化学杂志,卷249,不。18日,第5717 - 5704页,1974年。视图:谷歌学术搜索
17. s . c . 3月即帕里克说,p . Cuatrecasas”一个简化的方法,采用溴化氰活化琼脂糖亲和色谱法,“分析生物化学,60卷,不。1,第152 - 149页,1974。视图:谷歌学术搜索
18. 即留置权和e . g .山”,热处理的影响大豆油的营养价值和红血球凝聚活动吃饭,”营养学杂志》49卷,第620 - 609页,1953年。视图:谷歌学术搜索
19. o·h·劳里:j . Rosebrough a . l . Farr, r·j·兰德尔“蛋白质测量folin酚试剂,”《生物化学》杂志上,卷193,不。1,第275 - 265页,1951。视图:谷歌学术搜索
20. m·杜布瓦k . a . Gilles j·k·汉密尔顿,p . a . Rebers和f·史密斯,”比色法测定糖和相关物质,”分析化学,28卷,不。3、350 - 356年,1956页。视图:谷歌学术搜索
21. 英国Laemmli”劈理的结构蛋白组装T4噬菌体的头,“自然,卷227,不。5259年,第685 - 680页,1970年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. m .高盛“荧光抗体方法”程序结合学术出版社,页101 - 161年,纽约,纽约,美国,1968年。视图:谷歌学术搜索
23. t·b·Ng h . Wang,刘问:“隔离新heterodimeric凝集素和促有丝分裂的活动从蘑菇的子实体茶薪菇”,生命科学,卷70,不。8,877 - 885年,2002页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. b、p·科尔马克打进n . Ghori和美国Falkow adhesin酵母的病原体假丝酵母glabrata调解坚持人类上皮细胞,”科学,卷285,不。5427年,第582 - 578页,1999年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
25. j . Bhowal a . Mitra Banerjee s, s . Sikdar a·k·古和b . p . Chatterjee细胞外凝集素的纯化和表征Tricophyton石包含glycoconjugates特异性对唾液酸,”印度生物化学和生物物理学杂志》上第41卷。。2 - 3、81 - 88年,2004页。视图:谷歌学术搜索
26. 张齐兵。她,T.-B。Ng, W.-K。刘”,小说凝集素与强大的免疫调节活动分离培养的菌丝和子实体的可食用的蘑菇Volvariella volvacea”,生物化学和生物物理研究通信,卷247,不。1,第111 - 106页,1998。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
27. f . Licastro m . c . Morini o . Kretz g . Dirheimer和e·e·Creppy bolesatine的促有丝分裂的活动和免疫学特性,从蘑菇凝集素分离牛肝菌属菌类satanas楞次。”国际生物化学杂志》上,25卷,不。5,789 - 792年,1993页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
28. t·b·Ng h . Wang,刘问:“隔离新heterodimeric凝集素和促有丝分裂的活动从蘑菇的子实体茶薪菇”,生命科学,卷70,不。8,877 - 885年,2002页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
29. c·h·汉问:h . Liu t·b·Ng和h . x王”,小说homodimeric乳糖结合凝集素的食用药用蘑菇裂褶菌属公社”,生物化学和生物物理研究通信卷,336年,第257 - 252页,2005年。视图:谷歌学术搜索
30. H.-C。许,我。许,r。林,C.-L。花王,J.-Y。林,”一个新的真菌免疫调节蛋白分离Volvariella volvacea”,生物化学杂志,卷323,不。2、557 - 565年,1997页。视图:谷歌学术搜索
31. c . i, j·l·柯Hsu) r·h·林c . l . Kao j.y.林,“一个新的真菌免疫调节蛋白,从可食用的蘑菇FIP-fve孤立,菇中孢子及其完整的氨基酸序列,”欧洲生物化学杂志,卷228,不。2、244 - 249年,1995页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
32. w·h·林,c . h .挂c . i许j.y.林,“二聚氨基端两亲的$\alpha$螺旋域的真菌免疫调节蛋白灵芝tsugae(Fip-gts)定义为一个酵母2台混合动力系统和定点诱变,”《生物化学》杂志上,卷272,不。32岁,20044 - 20048年,1997页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

版权

版权©2010 Nagaraja n Nagre等。这是一个开放的分布式下文章知识共享归属许可,它允许无限制的使用、分配和复制在任何媒介,提供最初的工作是正确引用。