酶和绵羊的mRNA转录响应6-Phosphogluconate脱氢酶(6 pgd)对不同的牛奶产量

文摘

绵羊的6-phosphogluconate脱氢酶(6 pgd)是磷酸戊糖途径的一种酶,提供必要的NADPH的化合物的合成脂肪酸。的研究对酶水平和分子水平上进行的。然而,据我们所知,任何酶活性之间的相关性和6 pgd基因表达模式与不同生理阶段尚未被报道。这份报告,我们试图强调如果任何酶活性之间的相关性和绵羊的6 pgd基因的表达存在,在对不同的牛奶产量。根据确定酶的活动和组织特点,牛奶产量较低的母羊具有更大的(6 pgd活动和脂肪细胞比高产的母羊。虽然6 pgd表达式模式低价格高产奶量比母羊母羊牛奶产量高,这种差异不存在统计学意义。因此,6 pgd基因表达模式之后,并不是那么快速和巨大的/相当大的变化观察各自的酶活性,表明其他机制,如翻译后调控可能参与调节各自的基因。

1。介绍

6-Phosphogluconate脱氢酶(6 pgd)是一个氧化羧化酶,它催化6-Phosphogluconate脱羧基还原成核酮糖5-phosphate辅酶ii的存在。这个反应是一个组件的己糖mono-phosphate分流和戊糖磷酸途径。

酶的功能重要性是公认的提供NADPH脂肪合成和核糖核酸合成(1]。在农场动物,脂肪合成影响生产者的经济回报2]。过多的脂肪沉积负面影响肉品质、分级的尸体,和高产奶量的动物,他们的健康状况和未来的表现。

原核和真核6 pgd是大约470个氨基酸的蛋白质序列高度保守。近40种不同的氨基酸序列6 pgd人类(包括已报告3,鼠标4),大鼠(5),和猪6]。的蛋白质为单体独立行动。每个包含一个大的,主要是α螺旋,域和一个较小的beta-alpha-beta域,包含一个混合平行和反平行的β6-stranded表。辅酶ii势必在小穴中域,衬底绑定在一个相邻的口袋里(7,8]。

在反刍动物,广泛的研究报告只绵羊和互补。通关卡和沃克(9)是第一个确定的蛋白质序列6 pgd报告466个氨基酸的隔离和表征。然而,这种由于错位的肽序列信息是不正确的结果在蛋白质的决心。萨默斯et al。10]修正氨基酸序列基于隔离的cDNA克隆编码6 pgd基因绵羊。因此,孤立的cDNA编码一种蛋白质482 aa 52 kDa的分子质量。蛋白质序列的保护是非常高的,因为它有着相似的蛋白质编码的50%以上大肠杆菌6 pgd基因和超过80%的相似性与哺乳动物(人类、老鼠、猪)。

众所周知,在乳制品反刍动物重大变化发生在哺乳期间一些组织如脂肪组织的新陈代谢,作为有机体的homeorhetic控制的一部分。在许多情况下,动物无法摄入足够的能量在哺乳期间,利用身体储备。在过去的几十年很多研究了酶水平显示6 pgd的反应活动对不同的刺激2,11- - - - - -16),然而,涉及任何研究分子水平(即。信使rna成绩单)。首次在此,我们报告的影响不同绵羊的牛奶产量希俄斯岛母羊繁殖的脂肪细胞的特点,6 pgd的酶活性和表达基因。

2。材料和方法

2.1。动物治疗

实验进行的农业大学试验站的雅典。20希俄斯岛母羊繁殖年龄在2 - 4岁,平均(东南部)生活的重量55.41.8公斤是随机选择和分为两组根据他们的牛奶产量在断奶后产后)(40±3天。A组和B组包括动物高(每个动物拥有1700公斤/天,)和较低的牛奶产量(每只动物拥有1100公斤/天,),分别。

母羊挤奶机器,随意喂食每天两次,7点和16小时的苜蓿干草和集中在颗粒饲料,旨在满足他们维护和哺乳需求。水是免费提供的。牛奶样本收集和脂肪含量决定根据嘉宝的方法。牛奶的能量估计乔丹的净能量按照下列方程(17]:地点:(乔丹),M =产奶量(公斤/天), 。

每周的皮下脂肪组织样品从尾地区,活检。前一天抽样母羊禁食(24小时),在水中自由访问,和抽样母羊的日子是麻醉使用Zoletin 50 15至20毫克/公斤体重。一个样品(4 - 5 g)从脂肪组织立即被冻结测定酶活性和脂质提取。第二个示例1 (0.5 g)是放在Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲(,测量脂肪细胞大小和数量),而第三个样本(2.5 - -3.0 g)立即被冻结在液体并存储在为进一步的RNA提取。

2.2。生化参数

从每个样本200脂肪细胞的直径测量如Rodbell所述18]。意思是脂肪细胞体积()的200个细胞,脂肪细胞数量/ g脂肪组织计算平均直径()和标准差()。化学脂肪组织的脂肪含量是决定被Folch et al。19]。

酶测定方法描述Rogdakis [20.使用了)。每个脂肪细胞酶活性被表示为单位。

2.3。RNA隔离和反转录

尾巴皮下脂肪组织被活检样本。绵羊的脂肪组织的总RNA提取使用“Rneasy脂质组织工具包”(试剂盒猫没有。74804)。为合成第一链cDNA两步rt - pcr过程后使用1 ug的总RNA,筛选了预处理的DNase我和Omniscript逆转录酶(试剂盒)根据制造商的建议。

2.4。半定量rt - pcr分析

从羊脂肪组织总RNA是孤立的如上所述,用作半定量rt - pcr分析模板。进行分析,Ambion QuantumRNA 18 s Kit采用内部标准,导致产品324个基点。6 pgd基因扩增的引物FP7:之下-GGCCTACCACCTGATGAAGGACG -和RP8:-GCCAAATTCAGTTGCTGCCTGTC -使用产品导致378个基点。多重PCR条件是:3分钟30周期每个紧随其后30秒,30秒,30秒,最后一个扩展2分钟(聚合酶,新英格兰生物学实验室)。相对记录数量决定使用接穗图像软件诉4.0.3.2 (http://www.scioncorp.com/)。每个样品测定4次。

2.5。统计分析

最小二乘法程序是用于统计分析(21]。固定效应模型被用来描述每个观察关于脂肪细胞的数量和规模,酶活性和转录水平的6 pgd受到牛奶产量的影响。

3所示。结果

表1显示了平均每日净能源(乔丹),牛奶脂肪含量(%),牛奶产量(公斤)。集团拥有更高的牛奶产量(2.083±0.108千克)和更高的净能量牛奶(8.545±0.454 Mj,)比B组(0.715±0.073公斤,3.012±0.289 Mj,分别)。有关的大小观察脂肪细胞,脂肪细胞的平均直径的母羊是74.033.14然而,母羊集团拥有统计(比B组(64.38)小脂肪细胞4.49和83.672.94、职责)。

一个几乎两倍大的号码(每克脂肪组织)的脂肪细胞,观察母羊的A组与b组的平均数量的尾部脂肪组织的脂肪细胞群母羊脂肪组织,而B组拥有脂肪细胞/ g脂肪组织。

确定平均酶活性显著()更大的母羊B组相比,A组中观察到(364.8049.73 nmol NADPH *分钟¹/ 10⁶脂肪细胞和76.8013.50 nmol NADPH *分钟¹/ 10⁶脂肪细胞,职责)。关于6 pgd在哺乳期间两组基因表达(图1)增加转录表达在母羊的母羊B组相比,A组(0.693±0.060和0.595±0.085,职责)。然而,这种差异没有统计学意义。此外,6 pgd表达并不遵循急性酶活性的变化和牛奶能级有关两组(图2)。

4所示。讨论

在哺乳期,乳房是最高的组织的代谢活动。在这项研究中,尾部脂肪组织的代谢适应希俄斯岛母羊在牛奶生产是特别感兴趣的。

因素如基因型、饲料可用性、身体条件、数量和重量的羊羔出生时,环境刺激和他们的相互作用可能影响每日牛奶产量。根据Chilliard et al。22),身体脂肪的动员取决于初始体重,已经观察到在绵羊和奶牛。因为没有分化的观察体重在研究过程中,参数的可比性检验组之间是保证。

关于脂肪细胞的数量在这项研究中,观察到母羊的A组大约增长2倍的观察脂肪细胞数量/ g脂肪组织在B组的母羊。的观察范围值关于脂肪细胞实验中观察到的数量明显高于先前研究人员记录的值(11,23,24]。生产力的差异可能是由于不同品种的母羊(肉类型品种)和弗农的羊羔在实验中et al。23和特拉弗斯等。24没有断奶。

比较大小的尾部脂肪组织的脂肪细胞母羊是观察脂肪细胞平均母羊牛奶产量高的小得多的比母羊牛奶产量较低。这个结果预计由于高产的母羊有更大的能源需求比母羊牛奶产量较低,因此,脂解作用的途径更密集的尾部脂肪组织为了掩护乳房的能源需求25]。很明显,母羊的尾部脂肪组织分解代谢的活动组在本研究更高能量增加数量和牛奶。这个观察是一致的观察弗农et al。23]。

多样化的脂肪生成的脱氢酶活性等6 pgd动物之间不同的牛奶生产力表明脂肪生成的依赖母羊在哺乳期的总能量牛奶。在我们的研究中,6 pgd的活动减少的能源生产的牛奶是增加(图2)。这个观察预计,随着母羊B组由于低牛奶产量较低能量需求为了满足能源需求的乳房。在A组中,大大减少6 pgd活动观察(图2)。在这种情况下,代谢途径的liposynthesis是有限的,因此减少脂肪生成的酶的活动为了能源用于维护身体的内稳态。

如图26 pgd活动尾部脂肪组织减少牛奶的增加能量。然而,6 pgd的值的差异基因表达两组之间没有统计学意义,尽管减少观察表达的增加牛奶产量。6 pgd基因的数量这一事实记录两组之间没有显著变化表明,哺乳期间6 pgd在脂肪组织的控制可能发生在翻译和/或翻译后水平,作为重要的先前的作者指出脂肪生成的基因在哺乳期间,如ACC (24,26]。此外,在低收益率母羊集团似乎越来越6 pgd基因的转录。这个问题,可能是由于其他机制参与的可能性超过规定的翻译为例,SNP的存在,这可能促进转录率(B组)或影响转录事件后(a组)。

总之,牛奶产量水平显著影响尾皮下脂肪组织的代谢作用。在母羊牛奶产量高,脂肪生成的途径是通过减少脂肪细胞的大小有限,减少6 pgd的活动。在母羊牛奶产量较低这一限制较弱时,当这些动物有较低的能量需求相比,母羊牛奶产量高。6 pgd基因的数量变化记录在尾部脂肪组织并不类似6 pgd的变化活动或者牛奶产量水平。6 pgd在尾部脂肪组织表达乳品生产可能会通过post-transcription和/或翻译机制控制。然而,进一步的研究应以发现任何潜在的基因表达之间的关系,6 pgd活动和牛奶产量在羊。

缩写

aa:	氨基酸
英国石油公司:	碱基对
ACC:	乙酰辅酶A羧化酶
BW:	体重
互补脱氧核糖核酸:	DNA互补的RNA
核苷酸:	三磷酸脱氧核苷酸
6 pgd:	6-phosphogluconate脱氢酶
kDa:	Kilodalton
MDH:	苹果酸脱氢酶
辅酶ii:	烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸
NADPH:	还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸
聚合酶链反应:	聚合酶链反应
RT:	反转录。

承认

实验是农业大学的生命伦理委员会批准的雅典。

引用

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