Centrins脱磷酸化的蛋白磷酸酶2 cgydF4y2Ba和gydF4y2Ba

文摘gydF4y2Ba

在目前的研究中,我们确定了蛋白质磷酸酶脱去磷酸centrins以前磷酸化蛋白激酶CK2。以下磷酸酶已知存在于视网膜进行测试:PP1, PP2A, PP2B, PP2C PP5,碱性磷酸酶。PP2CgydF4y2Ba和gydF4y2Ba能够脱去磷酸P -gydF4y2Ba-centrin1最有效。PP2CgydF4y2Ba视网膜磷酸酶是不活跃的,其他也有很少或没有影响。类似的结果观察centrins 2和4。Centrin3不是CK2的衬底。结果显示PP2CgydF4y2Ba和gydF4y2Ba发挥重要作用在调节centrins体内的磷酸化状态。gydF4y2Ba

1。介绍gydF4y2Ba

在高度专业化的脊椎动物的感光细胞,centrins组件的纤毛器局部连接纤毛和基底的身体gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba3gydF4y2Ba]。在完全不同的感光细胞,CK2磷酸化centrin1在暗适应和2。自磷酸化纤毛蛋白transducin centrins大大减少了绑定,建议通过纤毛transducin的依赖光易位进一步受CK2磷酸化和磷酸酶参与。gydF4y2Ba

本研究旨在确定蛋白质磷酸酶作为同行的CK2-mediated依赖光的磷酸化centrins在哺乳动物的感光细胞。gydF4y2Ba

2。材料和方法gydF4y2Ba

2.1。磷酸化Centrins和糟糕gydF4y2Ba

GST-centrins (0.2gydF4y2Ba0.6 g)或GST-BAD (gydF4y2Bag)在30 mM Tris-HCl孵化,pH值7.5,5毫米MgCgydF4y2Ba5毫米gydF4y2Ba甘油磷酸盐,0.2gydF4y2Bag CK2 2-mercaptoethanol 0.06%, 1毫米EGTA, 100gydF4y2BaM ATP包括1gydF4y2BaCi (gydF4y2Ba一卷10]ATPgydF4y2BaL 15分钟37°C。非公司ATP是被centri-SEP科勒姆旋转。gydF4y2Ba

2.2。去磷酸化P-Centrins P-BADgydF4y2Ba

磷酸化蛋白和0.16孵化gydF4y2Bag PP1或0.05gydF4y2Bag PP2A或1.3gydF4y2Bag PP2B -0.8或0.08gydF4y2Bag PP2CgydF4y2Ba-1.5或0.08gydF4y2Bag PP2CgydF4y2Ba-0.8或0.08gydF4y2Bag PP2CgydF4y2Ba或0.8gydF4y2Bag PP5或1.5gydF4y2Bag碱性磷酸酶总量的15gydF4y2Ba分别L。孵化项目包含一个10gydF4y2BaL + 5整除完整磷酸化的反应gydF4y2BaL 50 mM Tris-HCl, pH值7.5,1%甘油、0.1% 2-mercaptoethanol,和一个额外的5毫米的跨国公司gydF4y2BaPP1 PP2A和PP2CgydF4y2Ba;或1毫米MgCgydF4y2Ba,0.1毫米CaCgydF4y2Ba,2gydF4y2Bag PP2B钙调蛋白;或1毫米MgCgydF4y2Ba对于PP2CgydF4y2Ba和gydF4y2Ba;或100gydF4y2BaM PP5油酸。碱性磷酸酶检测包含50 mM Tris-HCl, pH值7.9和1毫米MgCgydF4y2Ba。反应停止后30分钟37°C通过添加5gydF4y2BaL样品缓冲(130毫米Tris-HCl, pH值6.8,10% SDS, 2-mercaptoethanol 10%, 20%甘油、0.06%溴酚蓝)。gydF4y2Ba

3所示。结果gydF4y2Ba

3.1。磷酸化的Centrins CK2gydF4y2Ba

可以磷酸化体外纯化重组centrin1 CK2使用ATP作为磷源只在几分钟内(图gydF4y2Ba1(一)gydF4y2Ba)。磷酸化的centrin1 CK2可检测的100年gydF4y2Ba米的CK2-inhibitor TBB(图gydF4y2Ba1 (b)gydF4y2Ba),左)。鸟嘌呤核苷酸发挥着独特的重要作用在视网膜和视觉gydF4y2Ba3gydF4y2Ba]。的确,磷酸化的centrin1 CK2工作同样用三磷酸鸟苷磷酸代替ATP(图源gydF4y2Ba1 (c)gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

(一)gydF4y2Ba

(b)gydF4y2Ba

(c)gydF4y2Ba

(d)gydF4y2Ba

(e)gydF4y2Ba

(f)gydF4y2Ba

(一)gydF4y2Ba
(b)gydF4y2Ba
(c)gydF4y2Ba
(d)gydF4y2Ba
(e)gydF4y2Ba
(f)gydF4y2Ba

图1gydF4y2Ba

2gydF4y2Ba 描述的磷酸化centrins CK2。Centrins (0.2g,gydF4y2Baresp)被CK2磷酸化(0.2gydF4y2Ba使用(g)gydF4y2BaATP为磷源节中描述gydF4y2Ba。(一)——(d)放射自显影图。(一)——(c) Centrin1作为CK2的衬底。(一)时间依赖性。(b)的影响CK2-inhibitor TBB (4、5、6, 7-tetrabromobenzimidazole)。抑制剂是目前磷酸化反应(左)或添加后磷酸化PP2C之前和现在在去磷酸化gydF4y2Ba(右)。(c)和三磷酸鸟苷磷酸化(1CgydF4y2Bai (gydF4y2Ba三磷酸鸟苷和100gydF4y2Ba三磷酸鸟苷)相比,在ATP。(d)的磷酸化centrin亚型(0.2CgydF4y2BaK2 g、职责)。(e) Coomassie蛋白质染色centrin亚型(0.2g,gydF4y2Ba职责)。(f)序列的CK2磷酸化网站centrins 1 - 4。gydF4y2Ba

centrin2 centrin1守恒的(gydF4y2Ba)和centrin4 (gydF4y2Ba)而centrin3 (gydF4y2Ba相反(图)有丝氨酸残渣gydF4y2Ba1 (f)gydF4y2Ba)。像预期的那样从氨基酸序列的身份,centrins 2和4也可以通过CK2磷酸化(图gydF4y2Ba1 (d)gydF4y2Ba)。CK2多种蛋白质磷酸化的丝氨酸残基(审查[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba])。然而,Centrin3 CK2的不是一个衬底(图gydF4y2Ba1 (d)gydF4y2Ba)。Coomassie染色使用并行验证平等蛋白质加载(图gydF4y2Ba1 (e)gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

3.2。识别的磷酸酶水解P-CentrinsgydF4y2Ba

磷酸酶作用于P-centrin1包括PP1、PP2A PP2B PP2CgydF4y2Ba,PP5。未指明的碱性磷酸酶也是考验。的CK2-inhibitor TBB用来防止正在进行磷酸化在孵化与磷酸酶没有影响磷酸酶活动作为PP2C例证gydF4y2Ba(图gydF4y2Ba1 (b)gydF4y2Ba,对吧)。gydF4y2Ba

在这里PP2C 6磷酸酶测试gydF4y2Ba最有效地脱去磷酸P-centrin1(图gydF4y2Ba2(一个)gydF4y2Ba)。所有其他的磷酸酶测试没有或较少影响(图gydF4y2Ba2(一个)gydF4y2Ba)。这意想不到的选择性促使我们运行dephosporylation P-BAD作为额外的控制。为此坏是磷酸化gydF4y2Ba由CK2 [gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。Dephosporylation P-BAD并行运行,与实验处理P-centrin1的假定的去磷酸化。在类比已知对于大多数磷酸化网站在任何蛋白质,我们的体外研究表明,P -gydF4y2Ba紊乱,或多或少会被所有磷酸酶水解测试(图gydF4y2Ba2 (b)gydF4y2Ba)。这是形成鲜明对比的结果磷酸酶作用于P-centrin1(图gydF4y2Ba2(一个)gydF4y2Ba与gydF4y2Ba2 (b)gydF4y2Ba)。这意想不到的result-strongest PP2C P-centrin1的脱磷酸化gydF4y2Ba(图gydF4y2Ba2(一个)gydF4y2Ba)——也观察P-centrins2和4(数据未显示)。gydF4y2Ba

(一)gydF4y2Ba

(b)gydF4y2Ba

(一)gydF4y2Ba
(b)gydF4y2Ba

图2gydF4y2Ba

去磷酸化P-centrin1 P-BAD。(一)P -孵化gydF4y2Ba-centrin1 (0.2gydF4y2Bag)与磷酸酶。(b)的P -孵化gydF4y2Ba太差了(0.6gydF4y2Ba与磷酸酶g)。的量添加磷酸酶去磷酸化反应是相同的(a)和(b) (0.16gydF4y2Ba0.05 g PP1,1。3gPP2A,1。5gPP2B,gydF4y2Bag PP2C,gydF4y2Ba0.8gydF4y2Bag PP5,或1.5gydF4y2Bag碱性磷酸酶)。PP2CgydF4y2Ba是最有效的脱去磷酸P-centrin1 CK2的磷酸化。坏的蛋白质还磷酸化CK2-was运行控制验证磷酸酶的活性。gydF4y2Ba

3.3。描述PP2C P-Centrin1脱磷酸作用的gydF4y2Ba

越来越多的PP2CgydF4y2Ba蛋白质导致增强脱磷酸作用(图gydF4y2Ba3(一个)gydF4y2Ba)。PP2C酶的特点是他们的要求gydF4y2Ba——或者gydF4y2Ba阳离子活动(gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]。符合,脱磷酸作用P-centrin1 PP2CgydF4y2Ba在增加的gydF4y2Ba离子(图gydF4y2Ba3 (b)gydF4y2Ba)。增加了gydF4y2Ba离子浓度减少PP2C P-centrin1的脱磷酸化gydF4y2Ba(图gydF4y2Ba3 (c)gydF4y2Ba)。不饱和长链脂肪酸抑制从植物PP2C活动(gydF4y2Ba7gydF4y2Ba),但激活PP2CgydF4y2Ba和PP2CgydF4y2Ba在脊椎动物gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]。油酸(gydF4y2Ba)是能够刺激的P-centrin1 PP2C脱磷酸化gydF4y2Ba(图gydF4y2Ba3 (d)gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

(一)gydF4y2Ba

(b)gydF4y2Ba

(c)gydF4y2Ba

(d)gydF4y2Ba

(e)gydF4y2Ba

(一)gydF4y2Ba
(b)gydF4y2Ba
(c)gydF4y2Ba
(d)gydF4y2Ba
(e)gydF4y2Ba

图3gydF4y2Ba

描述PP2C P-centrin1脱磷酸作用的。Centrin1 (0.2gydF4y2Ba被CK2磷酸化(0.2 g)gydF4y2Bag)和(gydF4y2BaATP。(一)- 0.08 (d)去磷酸化gPP2CgggydF4y2BaydF4y2BaydF4y2Ba在1毫米的存在gydF4y2Ba除非另有指示。(一)蛋白质的依赖。(b)要求gydF4y2Ba离子的活动。(c)抑制gydF4y2Ba离子。(d)通过油酸刺激。(e)的影响PP2C同功酶,,ggggydF4y2BaydF4y2BaydF4y2BaydF4y2Ba在P -gydF4y2Ba-centrin1。gydF4y2Ba

去磷酸化与PP2C P-centrin1不仅可检测gydF4y2Ba还有PP2C之前如图所示gydF4y2Ba(图gydF4y2Ba3 (e)gydF4y2Ba)。相比之下,P -gydF4y2BaPP2C -centrin1不能水解gydF4y2BaδgydF4y2Ba(图gydF4y2Ba3 (e)gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

4所示。讨论gydF4y2Ba

磷酸化的centrins CK2在暗适应发生在哺乳动物的视网膜的感光细胞。它相互地调节gydF4y2Ba介导的centrins绑定gydF4y2Ba亚基的视觉heterotrimeric蛋白transducin [gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]。如果在感光纤毛CK2不断活跃,在大多数系统研究到目前为止,磷酸酶的身份和监管负责脱磷酸作用CK2-mediated centrin磷酸化centrins的生物学效应可能是至关重要的。gydF4y2Ba

因此,在目前的研究中,我们解决的问题磷酸酶能够脱去磷酸P -gydF4y2Ba-centrin1。所有最丰富的视网膜磷酸酶测试,也就是说,PP1, PP2A, PP2B PP2CgydF4y2Ba和gydF4y2BaPP5,碱性磷酸酶(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]。我们的结果最引人注目:PP2CgydF4y2Ba和gydF4y2Ba最高效地水解P-centrin1;所有其他磷酸酶测试没有或少得多的效果。这个意想不到的发现验证了利用P -gydF4y2Ba太差了,控制(CK2的磷酸化,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。正如所料,P-BAD被那些脱去磷酸磷酸酶去磷酸化形成鲜明对比的P-centrin1 PP2CgydF4y2Ba和gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

许多蛋白质磷酸化在几个不同的网站。知识的可逆磷酸化centrins目前由PKAgydF4y2Ba(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba17gydF4y2Ba],PKC [gydF4y2Ba15gydF4y2Ba],Cdc2 [gydF4y2Ba15gydF4y2Ba],CK2 [gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]。这份报告是第一个关注磷酸酶P-centrins。因为PP2C的意想不到的力量gydF4y2Ba和gydF4y2Ba要脱去磷酸CK2-mediated P-centrin1,我们简要检查是否PP2CgydF4y2Ba和gydF4y2Ba后也会脱去磷酸P-centrin1 PKA磷酸化。事实并非如此(数据没有显示)。因此,我们得出这样的结论:如果有相声和层次两个centrin蛋白质磷酸化网站发现,PP2CgydF4y2Ba和gydF4y2Ba在最决定性的作用。总的来说,PP2C P-centrins的脱磷酸化gydF4y2Ba和gydF4y2Ba应该增加centrins的亲和力gydF4y2Ba最后减少运输的蛋白transducin通过连接纤毛。gydF4y2Ba

引用gydF4y2Ba

1. a . Giessl a . Pulvermuller p .木马et al .,“微分表达式和交互的视觉蛋白transducin centrin亚型在哺乳动物的感光细胞,”gydF4y2Ba《生物化学》杂志上gydF4y2Ba,卷279,不。49岁,51472 - 51481年,2004页。gydF4y2Ba视图:gydF4y2Ba出版商的网站gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
2. a t p . Giessl Pulvermuller, Wolfrum,“Centrins,潜在的监管机构transducin易位的感光细胞,”gydF4y2Ba细胞生物学及相关疾病的外层视网膜gydF4y2BaEd,美国威廉姆斯,122 - 195年,2004页。gydF4y2Ba视图:gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
3. 美国Wolfrum”Centrin感光细胞的哺乳动物的视网膜感觉,“gydF4y2Ba细胞活性和细胞骨架gydF4y2Ba,32卷,不。1,55 - 64、1995页。gydF4y2Ba视图:gydF4y2Ba出版商的网站gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
4. 洛杉矶耳廓,“存在的理由持续活跃的蛋白激酶:CK2的教训,“gydF4y2Ba的化学研究gydF4y2Ba,36卷,不。6,378 - 384年,2003页。gydF4y2Ba视图:gydF4y2Ba出版商的网站gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
5. s . Klumpp a·毛雷尔y朱,d .艾凯莉l . a .耳廓和j . Krieglstein”蛋白激酶CK2在苏氨酸磷酸化坏——117年,“gydF4y2Ba国际神经化学gydF4y2Ba,45卷,不。5,747 - 752年,2004页。gydF4y2Ba视图:gydF4y2Ba出版商的网站gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
6. s . Klumpp d . Selke和j . Hermesmeier蛋白磷酸酶2型c活性生理gydF4y2Ba${\text{毫克gydF4y2Ba}}^{\mathrm{2gydF4y2Ba}+gydF4y2Ba}$:由不饱和脂肪酸刺激。”gydF4y2Ba2月的信gydF4y2Ba,卷437,不。3、229 - 232年,1998页。gydF4y2Ba视图:gydF4y2Ba出版商的网站gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
7. 博杜安大肠,即Meskiene h·赫特,“不饱和脂肪酸抑制MP2C,蛋白磷酸酶2 c参与wound-induced MAP激酶途径规定,“gydF4y2Ba植物杂志gydF4y2Ba,20卷,不。3、343 - 348年,1999页。gydF4y2Ba视图:gydF4y2Ba出版商的网站gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
8. b . Hufnagel m . Dworak m . Soufi et al .,“不饱和脂肪酸分离出人类脂蛋白激活蛋白磷酸酶2型cgydF4y2BaβgydF4y2Ba在内皮细胞和诱导细胞凋亡gydF4y2Ba动脉粥样硬化gydF4y2Ba,卷180,不。2、245 - 254年,2005页。gydF4y2Ba视图:gydF4y2Ba出版商的网站gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
9. a . Pulvermuller a . Giessl m . et al。”Calcium-dependent组装centrin-G-protein复杂的感光细胞,”gydF4y2Ba分子和细胞生物学gydF4y2Ba,22卷,不。7,2194 - 2203年,2002页。gydF4y2Ba视图:gydF4y2Ba出版商的网站gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
10. p .木马Rausch s a Giebetal et al .,“依赖光CK2-mediated centrins的磷酸化调节复杂的视觉蛋白的形成,“gydF4y2BaBiochimica et Biophysica学报gydF4y2Ba,卷1783,不。6,1248 - 1260年,2008页。gydF4y2Ba视图:gydF4y2Ba出版商的网站gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
11. s . Klumpp d . Selke d·菲舍尔a·鲍曼f·穆勒和s . Thanos”蛋白质磷酸酶type-2C同功酶存在于脊椎动物视网膜感觉:净化、特征,在光感受器和本地化,”gydF4y2Ba神经科学研究杂志gydF4y2Ba,51卷,不。3、328 - 338年,1998页。gydF4y2Ba视图:gydF4y2Ba出版商的网站gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
12. j·l·里斯”,视网膜的碱性磷酸酶组织化学定位。”gydF4y2Ba英国眼科学杂志的gydF4y2Ba,38卷,不。1,35-38,1954页。gydF4y2Ba视图:gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
13. d . Selke h .安东,s . Klumpp”丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶1型,2 a和2 c在脊椎动物视网膜感觉,“gydF4y2BaActa AnatomicagydF4y2Ba,卷162,不。2 - 3、151 - 156年,1998页。gydF4y2Ba视图:gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
14. 赵和a . Sancar“人类疯狂感光hCRY2专门与蛋白质的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶5和调节其活动,“gydF4y2Ba光化学与光生物学gydF4y2Ba,卷66,不。5,727 - 731年,1997页。gydF4y2Ba视图:gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
15. w·鲁茨w·l·林格尔d·麦考密克t·m·格林伍德和j·l·索尔兹伯里”期间centrin磷酸化细胞周期及其在中心体作用分离前中心体复制,”gydF4y2Ba《生物化学》杂志上gydF4y2Ba,卷276,不。23日,第20780 - 20774页,2001年。gydF4y2Ba视图:gydF4y2Ba出版商的网站gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
16. s . m . Meyn c . Seda m·坎贝尔et al .,“Ser167磷酸化的生化效应gydF4y2Ba衣藻reinhardtiigydF4y2Bacentrin。”gydF4y2Ba生物化学和生物物理研究通信gydF4y2Ba,卷342,不。1,第348 - 342页,2006。gydF4y2Ba视图:gydF4y2Ba出版商的网站gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
17. w·l·林格尔w·h·鲁茨j . n .炉火n . j . Maihle J.L.索尔兹伯里,“中心体肥大在人类乳腺肿瘤:影响基因组稳定性和细胞极性,”gydF4y2Ba美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国gydF4y2Ba,卷95,不。6,2950 - 2955年,1998页。gydF4y2Ba视图:gydF4y2Ba出版商的网站gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba
18. a . Giessl p .木马Rausch s a . Pulvermuller和Wolfrum,“Centrins,守门的依赖光易位transducin通过感光细胞连接纤毛,”gydF4y2Ba视觉研究gydF4y2Ba,46卷,不。27日,4502 - 4509年,2006页。gydF4y2Ba视图:gydF4y2Ba出版商的网站gydF4y2Ba|gydF4y2Ba谷歌学术搜索gydF4y2Ba

版权gydF4y2Ba

版权©2009 Marie-Christin Thissen等。这是一个开放的分布式下文章gydF4y2Ba知识共享归属许可gydF4y2Ba,它允许无限制的使用、分配和复制在任何媒介,提供最初的工作是正确引用。gydF4y2Ba