文摘
透明质酸(HA)是一种高分子量的线性多糖,细胞外基质的存在作为一个组成部分。幼虫(leptocephali)日本的海鳗(鳗鲡目:康吉myriaster)高水平的透明质酸(HA),被认为有助于控制身体水分。我们孤立的葡糖氨基葡聚糖(笑话)从日本的海鳗leptocephali和测量组织HA含量的变化在蜕变。在蜕变HA含量降低。相比之下,在蜕变中性糖含量增加。我们假设leptocephali利用一个代谢途径,HA转化成葡萄糖在蜕变。葡萄糖是糖原代谢,存储在少年生活史阶段。
1。介绍
硬骨鱼类的物种的数量进行个体发生的转换(变形)幼虫少年形式在他们过渡到一个新的栖息地1,2]。例如,鳗鱼的形态变化(鳗鲡目:蜕变从leptocephali幼鳗)(3]平行变化中看到许多两栖动物在蜕变。幼虫的超级Elopomorpha (Albuliformes鳗鲡目,海鲢目棘背鱼目,囊鳃鳗目)称为leptocephali。这个阶段的特点是一个透明的身体,小脑袋,叶形状(4),和一种惰性的存在凝胶状的物质称为粘多糖(呕吐)。笑话很长,无支链的多糖含有二糖重复单位。石斑鱼的角色是硬骨鱼知之甚少,包括鳗鲡目leptocephali。
玻璃鳗鱼的日本鳗鱼(安圭拉岛粳稻)是在腹腔(储存能量5]。人们认为这种代谢能量存储在浮游生活史阶段。是否在此期间笑料是一个重要的能量来源,我们测量的插科打诨内容日本海鳗leptocephali在蜕变。此外,我们调查了组织分布和透明质酸含量的变化。
2。材料和方法
2.1。动物
我们收集成年leptocephali日本濑户内海,海鳗的日本。leptocephali饲养,油箱没有饲料,一个40 L。幼鳗和正收集个人在整个饲养和不同阶段加工如下面。我们把从成年leptocephali蜕变到幼鳗(幼年期)五个阶段基于川上的描述等。6)(图1)。
2.2。隔离的笑话
我们每个动物的体壁解剖和组织在液氮冻结了。组织被磨成粉用杵和臼。用10毫升冲奶粉冰冷的甲苯,离心机在5000 x g 5分钟,上层清液被移除。我们重复这个过程三次。干渣与3.5毫升蒸馏水混合,煮3分钟。然后我们2毫米CaCl补充道20.1米,Tris-HCl (pH值8.0),和2.3毫克蛋白酶(第十九类型曲霉属真菌突变)(σ,圣路易斯,密苏里州)和孵化24小时的混合物在50°C。这后,我们添加了1毫克蛋白酶和孵化50°C的另一个24小时。此步骤重复了一个额外的时间,然后混合煮。这之后,我们添加了10 U牛pancrease DNase我(σ)和孵化4小时37°C。然后添加三氯乙酸(最终浓度:10%)和孵化混合物在一夜之间在4°C。混合物然后离心机在5000 x g 15分钟,和上层清液透析对自来水运行3天。最终的解决方案是干,残渣溶解在蒸馏水。
我们进行酶处理的笑话如下:约20 - 40g治疗干呕吐样本的体重100浊度降低(TR) U /毫升的透明质酸酶(60°C隔夜)(Seikagaku、东京、日本)或5 U /毫升chondroitinase ABC (Seikagaku) (37°C一夜之间)。醋酸纤维素电泳进行Separax-SP(富士胶片、东京、日本)在下列条件:吡啶甲酸- 0.1米0.47米缓冲(pH值3.0)在50 V。我们使用以下限制标准:硫酸软骨素(C4S),硫酸软骨素C (c6),硫酸肝素(HS),肝素(惠普)、透明质酸(HA)和硫酸角质素(KS-I) (Seikagaku)。
2.3。组织化学的哈
鱼的全身存储在Bouin的解决办法是嵌入在15—石蜡和分段米的间隔。部分被deparaffinized和彩色生物素化的HA结合蛋白(Seikagaku) 1小时在染色后沿,幻灯片在PBS 10分钟洗了三次,然后用碱性磷酸酶染色共轭链霉亲和素(Dako Cytomation,京都,日本)。洗后,部分开发与电视台/ BCIP颜色试剂(罗氏,曼海姆,德国)。控制部分采用200 TRU /毫升透明质酸酶(Seikagaku)和孵化为4小时60°C。
2.4。糖成分分析
我们分析了糖成分后Pfeiler[描述的方法7]。糖醛酸是由咔唑法使用葡萄糖醛酸内酯作为标准(8]。氨基糖(己醣胺)比色法测定的使用N-acetyl-D-glucosamine作为标准(9]。简单的糖(nonhexosamine)浓度测定phenol-sulfuric方法利用葡萄糖作为标准(10]。中性糖的浓度是通过减去糖醛酸含量从简单的糖浓度。
2.5。HA分析
体壁粉的一个示例是干在真空冷冻干燥机然后用1.0毫升的混合actinase E (Kaken制药、东京、日本),和孵化24小时50°C。混合煮10分钟,然后在5000 x g离心10分钟。HA的上层清液被用于测量内容使用分析工具(Seikagaku)。
3所示。结果与讨论
纯化笑料的电泳模式如图所示2。我们观察到一个大乐队和一个小乐队在成年leptocephali和玻璃鳗鱼。主要的乐队是由透明质酸酶分解和chondroitinase ABC(数字2(一个)和2 (b))。小乐队被chondroitinase ABC(图分解2 (b))。日本海鳗的电泳模式一致,主要HA乐队和一个小的硫酸软骨素乐队。
(一)
(b)
HA的分布在日本的海鳗leptocephali图所示3。有空隙结构的加密哈。基于我们的研究结果,哈似乎主要在日本康吉鳗leptocephali插科打诨。哈是一个线性多糖,由D-glucuronic酸(GlcA)和N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc)二糖重复11),这两个来自葡萄糖(GlcA:糖醛酸通路,GlcNAc:看到氨基糖代谢之间的相互关系)(12]。此外,葡萄糖的加入显著增加公顷生产鼠肾细胞(13]。HA分子是稳定的氢键链轴平行,形成加筋螺旋配置,使分子整体扩大线圈结构解决方案(14]。线圈可以被视为一个高度水化球体包含几个数量级的更多的水相对于其分子量(15]。线圈内的水是机械地包围着,而不是化学绑定到多糖。
在蜕变HA含量逐渐减少。减少也与身体含水量的降低(图4)。HA调节水平衡、渗透压和作为离子交换树脂(16]。基于笑料和身体水分含量之间的关系海鲢目(17),人们认为HA身体水分的控制。此外,哈哈可能参与适应海水中浮游的阶段。除了HA含量的减少,这两种糖醛酸,GlcA的指标,和氨基糖,GlcNAc的指标、内容逐渐减少在变形(图4)。相比之下,在变形(图中性糖含量也逐渐增加4)。中性糖类如葡萄糖或糖原在硬骨鱼(主要能源之一18]。鉴于leptocephali没有提要在蜕变,不太可能,中性糖含量的增加是派生的体内。因此,我们假设哈是葡萄糖代谢,随后postmetamorphic糖原储存的少年。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
确认
本研究从环境机构的资金支持,日本,全球COE计划的资助从教育部,文化、体育、科技、日本。