抑制白色念珠菌由Fluvastatin依赖pH值

文摘

降胆固醇药物fluvastatin (FS)有一个对致病性酵母菌的生长抑制作用白色念珠菌这是依赖于介质的pH值。在阴道的pH值较低,FS在高浓度抑制在低增长和,在中间浓度(1 - 10毫米),它没有抑制作用。检查常见的抗真菌药物氟康唑的影响结合FS演示了药物的相互作用在低浓度范围内。测定细胞内压力和FS的活动目标酶β-还原酶证实我们的假设,在中间剂量范围调整甾醇生物合成途径可以弥补FS的作用。我们得出结论,pH值依赖的FS在酵母细胞膜可能会使FS联合疗法治疗阴道一个有吸引力的可能性白念珠菌感染。

1。介绍

Fluvastatin规定(FS)是一个广泛的β-还原酶抑制剂,甾醇生物合成过程中关键酶(1]。由fluvastatin抑制甾醇合成具有抗真菌作用的机会性真菌病原体白色念珠菌在高浓度时;FS是协同的抗真菌作用与其他抗真菌药物的作用[2,3]。然而,结合药物治疗白念珠菌FS是结合常用唑药物似乎不切实际由于高浓度的抑制作用所需的FS生理pH值(2,3]。

FS站从他汀类家庭的其他成员,它是一个完全与终端羧酸合成分子集团。因为它的pKa 5.5, FS是电离的生理pH值7.4。FS吸收进入细胞是依赖博士卸货质子化了的FS肠道酸性pH值的形式都是更容易,带电分子出席血清pH值(4]。

本研究表明,FS行动进行酵母也同样依赖于介质的pH值。建立如果是特别感兴趣的一个更有效的吸收FS在低pH值会导致合作的FS唑药物容易实现的他汀类药物浓度较低。

2。材料和方法

2.1。评估酵母生长

白念珠菌从我们收集的临床分离株5)是生长在合成培养基(6]pH-adjusted 0.1钠磷酸盐缓冲剂。酵母的增长被修改化验微量滴定肉汤稀释法(6]。固定的文化酵母在新鲜培养基稀释1/20 000,200整除L表示药物的浓度和孵化了40小时在96 -微量滴定板。增长估计通过记录光学密度为620海里(OD620)标。最小抑制浓度(麦克风)确定的药物剂量,OD620减少了50%控制(7]。

2.2。评估CDR1表达式

应激反应基因的表达CDR1被监控记录荧光的白念珠菌记者应变CaSA1的表达绿色荧光蛋白的控制CDR1启动子(8]。

2.3。测定β-还原酶的活动

十OD600单位的文化白念珠菌在合成培养基上菌株ATCC10231收获在日志中期阶段的增长,用水洗了两次,并于300年暂停KPO L(100毫米₄缓冲区在pH7.0补充酵母蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。在300年的L(酸洗玻璃珠,细胞破裂在Beadbeater仪器(美国俄克拉荷马州Biospec,巴特尔斯维尔)。后把细胞碎片从玻璃珠浮在表面的,β-还原酶粗提物的活动是由氧化后NADPH在340海里。分析包含β- 0.3毫米,0.2毫米NADPH, 40毫米二硫苏糖醇,10L在100毫米KPO原油溶解产物₄在pH7.0缓冲区。活动规范化提取的蛋白质浓度。3个独立实验的平均值和标准差计算(9]。

2.4。定量聚合酶链反应

的表达UPC2(10)是由定量逆转录酶聚合酶链反应化验(qPCR)。总RNA分离酵母主纯粹的RNA设备(威斯康星州麦迪逊生物技术中心)根据制造商的指示。使用qTaq qPCR进行DNA聚合酶工具包(Clontech,加州山景城)50 ng /模板的浓度l .以下引物被使用:PMA1控制(1)TCCAACCTTTCGATCCTGTC和TTCCCAGTGACCTTCACCTC;16 s RNA(控制2)ATGGCCGTTCTTAGTTGGTG和GCCAAGGGTTATACTCGCTG;UPC2CAGCACTTTTGGACAAGCAA和GCTCCACCTGCGTACTCTTC。平均值和标准错误给出了三个独立的实验。

3所示。结果与讨论

3.1。抑制白念珠菌增长FS取决于环境pH值

FS的对经济增长的影响白念珠菌在四个不同的临床检查隔离从我们收集。一个典型的剂量反应曲线如图1(一)。在pH值为7.0 FS,它展示一个简单的剂量/响应相关性,这种情况在pH值4.5是不同的。可以观察到生长抑制在低(0.5 - -1.0米)、高(10米)的浓度,但不是在1到10的中间浓度范围6这次研究他汀类药物的m (Mevastatin Fluvastatin,阿托伐他汀、洛伐他汀,普伐他汀,辛伐他汀),FS是唯一药物表现出非线性的剂量反应。

FS的低剂量growth-inhibitory作用在低pH值可以被理解之前的演示了pH值依赖FS吸收的生物膜(4]。我们建议的质子化了的卸货FS分子具有更好的访问酵母胞浆比带电分子,从而可以在低浓度抑制增长。

剩细胞的形态是由光学显微镜检查的。没有变化在细胞形状或大小在FS(数据未显示)。

低剂量/ FS可以利用低pH值的抑制作用来进行宣传白念珠菌一种常见的抗真菌药物的作用,氟康唑(图1 (b))。一种唑药物被选为分析因为唑类和他汀类药物抑制主要真菌细胞膜脂质麦角固醇的合成。虽然他汀类药物抑制早期步骤,减少类固醇前体hydroxymethylglutaryl-CoA(β)的脱甲基唑类抑制后酶一步,14羊毛甾醇(11]。

8个临床分离株的氟康唑的敏感性白念珠菌在存在和化验没有0.5毫米FS。在所有压力测试,添加FS降低氟康唑的麦克风至少四倍。

为了验证观察FS-mediated增加和减少耐氟康唑,棋盘分析(3在pH值4.5)进行。然而FS的低剂量的敏化效果不符合严格的标准合作提出的白色和同事(12]。

3.2。CDR1-Fluorescence和β-活动镜子FS行动

为了更好地理解生物影响的非线性FS剂量反应曲线如图1(一),我们评估了细胞内的应力水平和β-还原酶FS-treated活动白念珠菌。药物的表达式导出泵Cdr1p增加后暴露在各种各样的压力因素,被认为是一个有用的细胞内压力的记者8]。FS-induced变化CDR1基因表达是一个镜像的药物的生长抑制作用(图2(一个))。在1到10的中间浓度范围M, FS不诱导耐药机制。可以观察到类似的相关性在FS-inducedβ-还原酶活性的变化。而低剂量的FS抑制白念珠菌β-还原酶,中间剂量抑制酶显著减少(图2 (b))。归纳主要类固醇合成的监管机构UPC2(10由qPCR],可检测FS含量较低(1.53 + / 0.28−0.5因素米),这表明FS确实有生理作用在这个范围。然而,UPC2感应不显著增加与升级FS浓度(1.69因素在20 + /−0.24米),因此不能解释中间浓度的适应性反应。

我们提出以下的解释我们的观察在低pH值,卸货FS分子进入细胞的扩散膜。细胞内,FS被去质子化困在细胞内的pH值越高,导致胞内积累与随后的麦角固醇的生物合成的抑制作用。如果超出一定程度的抑制,细胞可能通过诱导活性的类固醇合成途径(10,13),显然是由一个UPC2独立的机制。这将导致足够的麦角固醇产量和降低细胞内的压力在FS。显然,还需要进一步的研究来完全解释FS阻力在中间浓度范围。

4所示。结论

FS行动的pH值的数据依赖白念珠菌给洞察他汀类药物治疗的影响酵母菌感染。FS治疗高胆固醇血症,患者的血清浓度FS可分为2 - 4的中间范围米(14]。没有抑制真菌的抑菌作用FS可以预期在这个范围内,随着FS在生理pH值的有效浓度12.5m .然而,低pH值的阴道pH值(3.8 - 4.5)低剂量的FS足以减少白念珠菌生存。这是一个吸引人的假设FS可以单独使用或结合提高真菌唑类间隙的阴道。

承认

本研究从爱荷华州科学基金会提供资助。

引用

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