肝X受体受体激动剂抑制磷脂调节基因CTP: Phosphoethanolamine Cytidylyltransferase-Pcyt2

文摘

代谢脉冲追踪实验证明25-hydroxycholesterol (25-OH)的内源激活肝X受体(LXR),显著降低磷脂酰乙醇胺的生物合成通过CDP-ethanolamine(肯尼迪)通路的一步催化CTP: phosphoethanolamine cytidylyltransferase (Pcyt2)。在小鼠胚胎成纤维细胞C3H10T1/2 LXR合成兴奋剂TO901317降低Pcyt2 promoter-luciferase活动浓度的方式。此外,25-OH和TO901317鼠标Pcyt2信使rna和蛋白质含量减少了35 - 60%。oxysterols的抑制效应和TO901317 Pcyt2启动子功能,mRNA和蛋白表达在人类乳腺癌细胞MCF-7守恒。这些研究确定Pcyt2基因作为一种新颖的目标即LXR受体激动剂可能间接调节炎症反应和动脉粥样硬化。

1。介绍

磷脂酰乙醇胺(PE)是一个重要的膜磷脂与角色在多种细胞过程包括细胞信号,膜融合,细胞分裂,自噬和凋亡1,2]。尽管PE可以合成磷脂酰丝氨酸羧在线粒体中,大部分的体育是新创的内质网从乙醇胺和二酰基甘油通过CDP-ethanolamine(肯尼迪)途径1]。新创肯尼迪通路的分子和代谢方面的作用主要监管酶Pcyt2最近审查(2]。

肝X受体(LXRs) oxysterol-activated核受体,控制胆固醇体内平衡通过修改相关基因的表达在胆固醇吸收和射流从外围组织3]。LXRs也调节基因在脂肪生成必不可少,葡萄糖代谢和炎症4]。监管LXRs对磷脂的影响基因是相对未知的。我们最初的表征表明,早期生长反应蛋白1和核因子κB (NFκB)可能是重要的监管人类Pcyt2基因(2,5]。在这里,我们报告,oxysterols 25-hydroxycholesterol (25-OH)和22 r-hydroxycholesterol (22 r-oh)和LXR合成兴奋剂TO901713下调CDP-ethanolamine通路和基因表达抑制Pcyt2守恒在老鼠和人类细胞间接机制。

2。实验程序

电池维护和治疗
小鼠胚胎成纤维细胞C3H10T1/2和人类乳腺癌细胞MCF-7生长在标准条件下(6,7)无血清培养系统40-48小时媒体补充25-OH (10 ng /μL), 22 r-oh (10 ng /μL),或TO901713(0-20μM)和细胞生长在无血清的媒体没有受体激动剂被用作控制。

¹⁴C-ethanolamine放射性标记和体育质量
C3H10T1/2细胞(10⁶细胞/ 60 mm-dish)治疗与25-OH 40小时,pulse-labeled 1小时¹⁴C-ethanolamine(0.5μCi /盘),追逐250μM“冷”乙醇胺和收集在不同的时间点(0、0.5、1、2和4个小时)。Bligh-Dyer放射性标记化合物提取的方法,并分析了薄层色谱(6]。总PE质量测量使用荧光探针1,6-diphenylhexatriene正如我们前面描述的(6]。

Pcyt2 promoter-luciferase记者化验
瞬时转染进行按照最初的描述(7]。5小时的转染细胞孵化转染媒体,然后培养LXR受体激动剂的存在与否对额外的48小时或15个小时。荧光素酶记者进行了化验使用双荧光素酶系统(美国WI Promega, Medison)。

Pcyt2 mRNA表达
总RNA分离试剂盒试剂(表达载体,伯灵顿,加拿大)。单链DNA进行PCR反应300 ng使用Pcyt2特定的引物,远期底漆F6 (ggagatgtcctctgagtaccg)和反向引物R7 (ggcaccagccacatagatgac)。引物产生大小不同的两个片段,Pcyt2α223个基点和170个基点Pcyt2β[8]。

免疫印迹
细胞匀浆是由免疫印迹分析使用anti-Pcyt2α和anti-Pcyt抗体产生在我们的实验室6]。

统计分析
所有测量数据都表示为±s.d至少有三个独立的实验。数据分析方差分析(GraphPad Prism 3.0)和微(美国马里兰州接穗形象,弗雷德里克)。

3所示。结果

CDP-ethanolamine(肯尼迪)通路由25-OH表达下调。
老鼠胚胎干细胞C3H10T1/2处理10 ng /μL 25-OH oxysterol 40小时,放射性标记¹⁴C-ethanolamine和追逐过多的标记乙醇胺为0,0.5,1,2,4小时。如图1(一),¹⁴C-ethanolamine消失是相似的两种条件下,乙醇胺激酶一步证明(phosphoethanolamine形成)不影响治疗。的形成¹⁴C-phosphoethanolamine减少从8847年dpm在时刻0小时3246 dpm在未经处理的细胞在4小时的追逐后25-OH细胞治疗¹⁴C-phosphoethanolamine非常缓慢(图消失了1 (b)),表明这一步催化Pcyt2 oxysterol抑制的治疗。因此,Pcyt2产品¹⁴C-CDP-ethanoalmine仍不断低25-OH细胞治疗,和之间的区别¹⁴C-CDP-ethanoalmine 25-OH治疗和控制细胞达到64%的追逐(图1 (c))。消失的利率¹⁴C-CDP-ethanoalmine另一方面相似,表明肯尼迪通路中的最后一步(磷酸转移酶步骤)不是oxysterol治疗(图的影响1 (c))。25-OH细胞治疗的慢CDP-ethanolamine的形成是伴随着率显著降低¹⁴C-PE合成(图1 (d))。在同等条件下总PE下降了32%的细胞治疗25-OH(没有显示)。综上所述,这些数据表明,首次通过肯尼迪PE从头合成途径成为表达下调的25-OH CDP-ethanolamine形成的步骤,由Pcyt2催化。

(一)

(b)

(c)

(d)

(一)
(b)
(c)
(d)

图1

^{14 14 14 14 *} P 抑制由25-hydroxycholesterol CDP-ethanolamine通路。老鼠细胞C3H10T1/2处理10 ng /μL 25-OH(三角形),“脉冲”C-Etn 1小时和“追赶”与过多的未标记的乙醇胺。C-ethanolamine (A),C-phosphoethanolamine (B)C-CDP-ethanolamine产品(C)测定水阶段和放射性标记PE (E)量化有机相。未经处理的细胞生长在无血清媒体(开放广场)被用作控制。数据显示从三个独立的实验中进行复制;()表明治疗之间的差别< . 05。

LXR受体表达下调鼠标Pcyt2启动子和基因表达
建立机制对Pcyt2 25-OH影响,我们执行luciferase-reporter化验使用前面鼠标Pcyt2启动子特征(−559 / + 29 bp) [7]。如图2(一个)25-OH启动子活性降低40% (P < . 05)浓度的10 ng /μL 48小时后治疗。测试是否Pcyt2的抑制作用是通过激活LXR, C3H10T1/2细胞也处理的具体LXR兴奋剂TO901317, TO901317的抑制作用在鼠标Pcyt2发起人摄入量有关在-20年0.02μM(图2(一个))。子函数的减少伴随着大幅减少的表达Pcyt2α和-β成绩单(图2 (b))。使用特定抗体使得Pcyt2总在我们的实验室Pcyt2α蛋白质,总Pcyt2我们进一步证实和α形式的48小时治疗显著降低25-OH和1μM TO901317(图2 (c))。这些数据表明25-OH和特定LXR配体TO901317也有类似的抑制对Pcyt2基因表达的影响。当我们测量的影响25-OH和TO901317 Pcyt2基因表达后15小时的治疗,降低对启动子活动的影响和Pcyt2蛋白质数量是一样重要的48小时内治疗(数据未显示)。

(一)

(b)

(c)

(一)
(b)
(c)

图2

^* P ^{* *} P ^{* * *} P 左面板 右面板 左面板) 右面板 Downregulation鼠标25-hydroxycholesterol和LXR-specific受体激动剂TO901317 Pcyt2基因。(一)C3H10T1/2细胞培养在25-OH (10 ng /μL)或TO901317 (20 nM-20μM) 48小时。显示promoter-luciferase记者从四个独立的实验活动在重复执行。数值代表意味着±s.d,with significant differences indicated as ()< . 05,()< . 01和()<措施。(b) Pcyt2 mrna(α和β)决定在25-OH ()和1μM TO901317 ()细胞治疗。(c):免疫印迹显示25-OH (和1μM TO901317 ()治疗C3H10T1/2细胞总数减少和αPcyt2蛋白质。

LXR受体激动剂人类Pcyt2启动子和基因表达下调
LXR受体激动剂的效果在Pcyt2基因也在人类细胞进行测试。人类乳腺癌细胞MCF-7瞬变与人类Pcyt2启动子荧光素酶转染记者(−590 / + 56 bp) [7)和处理TO901317(1μM) 25-OH (10 ng /μL)或22 r-oh (10 ng /μL)。如图3(一个),TO901317人工Pcyt2子活动减少了76% (P< . 05),oxysterols 25-OH 22 r-oh荧光素酶活性下降,分别为52% (P< . 05)和63% (P< . 05)。同意对启动子活性的影响,TO901317, 25-OH和22 r-oh也能够大大减少总Pcyt2和Pcyt2α治疗细胞中蛋白质含量相对于未经处理的MCF-7细胞(数字3 (b))。

(一)

(b)

(一)
(b)

图3

^* P ^{* *} P ^{* * *} P LXR受体激动剂减弱人类Pcyt2基因的表达。(一)人类乳腺癌细胞MCF-7转染与人类Pcyt2 promoter-luciferase记者构造和处理TO901317(1μM) 25-OH (10 ng /μL)或22 (R) -哦(10 ng /μL) 48小时。为治疗和治疗细胞进行荧光素酶的活动。美国南达科他州±显示手段至少在四个独立重复实验和显著差异被表示为()< . 05,()< . 01,()<措施。(b)总额的衰减和αPcyt2蛋白质各种治疗后(一个)。

4所示。讨论

在这个报告中,我们首次证明自然oxysterols和LXR合成受体激动剂T0901317 PE从头合成的抑制剂CDP-ethanolamine形成的步骤通过下调Pcyt2基因在转录水平。最近,它已经表明,oxysterols也可以抑制磷脂酰胆碱(PC)新创合成通过阻断相关酶的磷酸化,CTP:胆碱磷酸cytidylyltransferase-Pcyt1,肯尼迪的胆碱的分支路径(9]。oxysterols和LXR受体激动剂抑制PE和PC表明他们是重要的监管机构膜的生物起源的两种主要的磷脂。

LXRs是著名的能力调节胆固醇流出ABCA1 [3)建立,降低高密度脂蛋白磷脂(PC和PE)可以提高ABCA1-mediated流出,减少SR-BI-mediated流出(10]。因此,减少的PE为同一物质合成和LXR电脑合成的减少可能会导致降低磷脂对血清脂蛋白(PE和PC)可用性,从而有利于ABCA1-mediated胆固醇流出SR-B1-mediated胆固醇流出。此外,减少细胞电脑和体育,由于抑制Pcyt2 Pcyt1,也可以限制ApoA1或高密度脂蛋白胆固醇流出的程度自运输的磷脂和胆固醇有关。

LXRs及其配体的促炎基因的负调控因子包括COX1/2和前列腺素E synthase-1 (PGES-1) [4,11]。PE和PE-plasmalogens花生四烯酸的主要来源,主要基质的前列腺素类炎症介质(12,13]。COX1 COX2和花生四烯酸释放PE和PC转化为前列腺素H2,这是一个唯一底物的一系列其他前列腺素。基于我们的研究结果,LXR受体激动剂的抗炎效果似乎抑制磷脂(PE和PC)合成降低花生四烯酸水库池,除了已知的影响通过COX1/2和下游基因抑制花生四烯酸的利用率。

消炎LXR大多是间接介导的transactivation NFκB等其他转录因子和Ap1 (c-Fos / c-Jun) (3,14]。老鼠和人类的全面分析Pcyt2启动子序列并没有透露任何守恒LXR响应元素(7),这表明观察LXR受体激动剂的抑制作用Pcyt2转录也间接的。我们已经证实人类Pcyt2可能受NFκB [5),但鼠标形式不是一个NFκB目标(7)和LXR受体激动剂抑制小鼠和人类的推动者。老鼠和人类Pcyt2推动者另一方面分享几个公认的Ap1 [7)和糖皮质激素受体(GR)响应元素(数据未显示),它可能参与了LXR抑制作用。它建立了LXR兴奋剂T0901317明显抑制GR基因及其下游目标参与肝葡萄糖代谢,因此改善糖尿病综合症在db / db老鼠15]。

总之,我们建立了oxysterols和LXR特定受体激动剂T0901317减少Pcyt2使用一种间接机制启动子和基因表达在老鼠和人类细胞是守恒的。因为LXR受体激动剂抑制PE合成可能导致胆固醇体内平衡和炎症的影响,抑制了PE的从头合成通过抑制Pcyt2发展这种疗法可能是另一种选择。

引用

1. e·p·肯尼迪和s . b . Weiss”的作用胞嘧啶核苷的生物合成辅酶磷脂,”生物化学杂志》222卷,没有。1,第214 - 193页,1956。视图:谷歌学术搜索
2. m . Bakovic m·d·富勒顿诉米歇尔,“磷脂乙醇胺生物合成的代谢和分子方面:CTP的作用:phosphoethanolamine cytidylyltransferase (Pcyt2),“生物化学和细胞生物学,85卷,没有。3、283 - 300年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. r . Geyeregger m . Zeyda, t . m . Stulnig“肝X受体在心血管和代谢疾病,“细胞和分子生命科学,63卷,没有。5,524 - 539年,2006页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. s b·约瑟夫·a . Castrillo b·a·拉·d·j·Mangelsdorf,积累和p . Tontonoz“互惠的炎症和脂类代谢的调节肝X受体,“自然医学,9卷,没有。2、213 - 219年,2003页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. c·m·约翰逊,z .元,m . Bakovic”表征的转录因子和cis-acting元素调节人类CTP: phosphoethanolamine cytidylyltransferase (Pcyt2),“Biochimica et Biophysica学报,1735卷,没有。3、230 - 235年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. m·d·富勒顿、f . Hakimuddin和m . Bakovic”发育和代谢的影响破坏鼠标CTP: phosphoethanolamine cytidylyltransferase基因(Pcyt2),“分子和细胞生物学、27卷,没有。9日,第3336 - 3327页,2007年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. a . Poloumienko象牙海岸,a . t . t . Quee l .朱和m . Bakovic“老鼠和人类的基因组组织和微分拼接Pcyt2基因,”基因,325卷,第155 - 145页,2004年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. a .领带和m . Bakovic可变剪接的CTP: phosphoethanolamine cytidylyltransferase产生两种亚型在催化属性不同,“脂质研究期刊》的研究,48卷,没有。10日,2172 - 2181年,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. m . Agassandian j .周洛杉矶Tephly, a·j·瑞安,a·b·卡特和r·k·Mallampalli”Oxysterols抑制磷脂酰胆碱合成通过ERK对接和磷酸化的CTP:胆碱磷酸cytidylyltransferase,”生物化学杂志》,280卷,没有。22日,第21587 - 21577页,2005年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. p·g .燕西M.-A。Kawashiri, r·摩尔et al。”体内高密度脂蛋白磷脂的调制反对影响SR-BI ABCA1-mediated胆固醇流出,“脂质研究期刊》的研究,45卷,没有。2、337 - 346年,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. y Ninomiya、t . Yasuda m .川o . Yuge y冈崎,“肝X受体配体的抑制lipopolysaccharide-induced表达微粒体前列腺素E synthase-1和减少前列腺素${\text{E}}_2$生产在小鼠腹腔巨噬细胞,”《类固醇生物化学和分子生物学,103卷,没有。1,44-50,2007页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. d·a·福特和r·w·格罗斯”Plasmenylethanolamine是花生四烯酸的主要存储仓库在兔血管平滑肌和迅速水解后血管紧张素ⅱ刺激,“美国国家科学院学报》上的美利坚合众国,86卷,没有。10日,3479 - 3483年,1989页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. 盛田昭夫,h . k .录像t . Dohi e . Yasugi和m .大岛渚”磷脂营业额在肠道粘膜发炎:花生四烯酸acid-rich磷脂/ plasmenyl-ethanolamine粘膜炎症性肠病,“胃肠病学杂志》上,34卷,没有。1,46-53,1999页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. d . Ogawa j·f·斯通,y的中国人et al .,“肝X受体受体激动剂抑制细胞因子诱导的骨桥蛋白表达在巨噬细胞通过干扰激活蛋白1信号通路,“循环研究,96卷,没有。7,pp. e59-e67, 2005年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. c . y . Liu, y王et al .,“肝X受体激动剂T0901317抑制肝细胞糖皮质激素受体表达的可能导致糖尿病综合症的改进db / db老鼠,“内分泌学,卷147,没有。11日,第5068 - 5061页,2006年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

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