一个Antithrombin-Heparin复杂的增加纤维蛋白凝块的抗凝活性

文摘

凝血包含fibrin-bound凝血酶,促凝血的活动导致凝块扩展的主要来源,进一步激活凝血。绑定到纤维蛋白时,凝血酶不受抑制的抗凝血酶(在)+肝素但中和在和肝素共价链接(ATH)。在这里,我们报告这个令人惊讶的发现,而不是产生一种惰性复杂,thrombin-ATH形成凝块转换成抗凝剂表面,有效地促进抑制凝血酶在周围环境。

1。介绍

血栓凝血通路的刺激,结果导致的凝血酶裂解纤维蛋白原形成纤维蛋白。在这个过程中,凝血酶变成纳入发展的纤维蛋白凝块,变成一个病灶为激活凝血剂因素和纤维蛋白吸积(1]。从历史上看,血栓形成预防肝素已经通过管理,由抗凝血酶催化的凝血酶抑制(在)2]。矛盾的是,使用肝素可以导致保护fibrin-bound凝血酶与共价反应肝素形成纤维蛋白肝素钠凝血酶三元复杂(3]。增加肝素浓度降低循环凝血活性但clot-associated重新出现凝血酶活动一旦停止(肝素治疗3,4]。我们开发了一个强大的nondissociable共价复杂的和肝素(ATH) [5肝素)这样的吸引力一部分纤维蛋白凝血酶会因此中和通过附加在[凝血酶6]。调查有纤维蛋白单体和凝血酶ATH交互显示仍然附着形成的共价thrombin-ATH复杂的纤维蛋白通过肝素链(6]。我们感到好奇确定肝素fibrin-bound thrombin-ATH仍然可以与外生液相凝固蛋白质。因此,目前的工作是为了确定肝素链thrombin-ATH复合物中绑定到纤维蛋白单体和纤维蛋白凝块表面能够催化免费的抑制,流体相,凝血酶体内补充道。

2。材料和方法

2.1。纤维蛋白单体制备

可溶性纤维蛋白单体制备了从人类纤维蛋白原(酶研究实验室),去除污染后130年孵化15毫升的纤连蛋白米纤维蛋白原与5毫升的明胶琼脂糖(σ)30分钟。纯化纤维蛋白原(100米)是孵化与人类凝血酶(酶研究,最后2 nM) 37^°C为4小时,其次是在2000 g离心5分钟。纤维蛋白聚合物颗粒是放置在透析管12000 - 14000兆瓦截止和透析4^°C与H₂O,其次是对0.02醋酸透析直到纤维蛋白溶解。纤维蛋白单体浓度在280 nm,由吸光度的浓度为10毫克/毫升= 14.0的吸光度。

2.2。复杂的制备

共价antithrombin-heparin复杂(ATH)是由加热1152毫克的抗凝血酶(在;亲和力生物制品有限公司)+ 64克肝素(σ)900毫升40 PBS为14天^°c .孵化后,NaBH₃CN是添加到最后一个0.05米的浓度,在37个解决方案进一步孵化^°C 5小时。自由被通过使反应混合物(NH 2.5₄)₂所以₄,装载1000毫升列丁基琼脂糖(Amersham)与2.5米(NH洗珠子₄)₂所以₄磷酸和淋洗复杂0.02 pH值7.0。洗脱液透析与0.01 M Tris-HCl pH值8.0缓冲和绑定到900毫升的DEAE琼脂糖(Amersham),其次是与0.2生理盐水洗涤缓冲和洗脱纯化ATH 2.0 M氯化钠的缓冲区。ATH pressure-dialyzed与PBS。最后纯化ATH产品拥有< 5%非结合的起始材料,包含> 95%的活跃与凝血酶。先前的研究已经证实:肝素钠摩尔比率是1:1 (5]。

2.3。Sepharose-AT色谱法

肝素的高亲和性(哈)是由加载4毫克的肝素(2毫升的0.15 M氯化钠0.01米磷酸pH值7.3缓冲)在10毫升列sepharose-AT准备在和CNBr-activated琼脂糖(Amersham),根据制造商。列是用0.5 M氯化钠在缓冲区和筛选了2 M氯化钠在缓冲区。恢复哈是透析对H₂O和冻干。

2.4。纤维蛋白单体,凝血酶抑制

,3.24L (37米纤维蛋白单体,2.54L (59M GPRP-NH₂(σ),1.34.6 L的1米三,L 0.02 Tris-HCl 0.15 M氯化钠0.6%聚乙二醇8000 pH值7.4 (TSP), 2.06L(1毫克/毫升牛白蛋白(球蛋白免费;在TSPσ),1.2L的1.08M凝血酶在23日涨跌互现^°C microfuge管。2分钟后,2.06L的0.125在+ 0.125米M肝素或0.125M ATH添加。还有两分钟孵化后,TSP过剩的解决方案(12.9M, 1L)、凝血酶(1.08米,12快速连续加入了L)。2分钟的反应之后,剩余的凝血酶活动是由混合0.879.2 L的反应混合物L s - 2238的0.62毫米衬底(diaPharma西切斯特,哦,美国)在TSP,紧随其后的是中和后10分钟20L 50%的醋酸和吸光度测量在405海里。抑制凝血酶的催化能力,在计算百分比减少凝血酶活性相对于没有+肝素或ATH实验。

2.5。纤维蛋白凝块及凝血酶抑制

0.5毫升的等离子体的体积和9L 1 M CaCl₂在microfuge管包含6毫米的塑料循环(费舍尔)。1小时后37^°C、凝块(循环)被移除和浸洗6次的1毫升解0.02米Tris-HCl 0.15 M氯化钠pH值7.4 (TBS)。在一夜之间存储4^°C在TBS,凝块被放置在TBS 20分钟23^°在37 C和1小时^°C,其次是6 TBS清洗和存储在一夜之间在4^°在TBS C。凝块被放置在新鲜TBS为1小时20分钟,然后孵化37^°1毫升的TSP, 0.1 C在+ 0.1米M肝素;TSP, 0.1在+ 0.1米米哈;或茶匙,0.1长沙。洗后简要6 * 1毫升的TSP和一次20分钟在TSP 23^°C,催化活性的凝块决心在37^°C 0.5毫升0.043的一个解决方案0.2 M凝血酶+ 0.5毫升米,前混合使用。上下凝块浸泡在凝血酶(每秒一次)+ 1分钟的解决方案。清除血栓后,12L的凝血酶+ 67.2解决方案是与反应的0.71 mM s - 2238 L TSPfor 10分钟23^°与20 C,中和L 50%的醋酸和吸光度确定活动是在405海里。结果计算百分之一没有在凝血酶的凝血酶活动的解决方案。没有血栓抑制确定相对于反应。减法的凝血酶活性百分比迷失在凝块孵化没有肝素化合物给净催化活性。

2.6。统计分析

数据被判定为正态分布方差的意味着没有扭曲和应用Anderson-Darling正常测试并没有透露任何nonGaussian分布。t测试(2尾随,nonpaired)被用于纤维蛋白单体研究(n≥6),有两个主要实验小组。因为有多个组纤维蛋白凝块实验,进行单向方差分析(n≥4P= 04),其次是图基对比ATH后续测试和其他实验组肝素。一个α水平的0.05是整个分析使用。数据表示为平均值±标准平均误差(SEM)。

3所示。结果与讨论

最初的实验,以确保对纤维蛋白凝血酶被ATH,中和抑制表面没有保护额外免费凝血酶不受流体相的攻击。显色试验结果表明,纤维蛋白thrombin-ATH没有影响可溶性凝血酶功能活动。尽管所有凝血酶对纤维蛋白ATH的反应能力,迅速补充凝血酶的失活发生在外生的存在。仔细研究证实,而纤维蛋白,thrombin-ATH在纤维蛋白显著抑制多余的凝血酶的催化(P与共价= .007),而类似的测试(图+肝素混合物显示没有影响1)。

我们接下来检查表面抗凝能力ATH的生理系统。凝块从recalcified等离子体处理缓冲区或少量的注意。孵化的凝血酶+解决方案与ATH-neutralized凝块显示强烈的抑制酶活性相对于在+ +肝素或肝素与高亲和力(哈)P值分别为0.026和0.023(图2)。此外,微不足道的影响可溶性凝血酶+在观察血栓治疗肝素+或者+哈(95%的置信区间-19.1和-10.2、职责)。因此,我们已经表明,不仅ATH灭活凝凝血活性,但表面产生凝块还含有肝素抗凝活性明显降低,保持周围环境。这一发现是与肝素相比,肝素吸收在促凝血的血块是无效的在影响凝血酶/反应(图2)。此外,缺乏增强凝血酶反应的哈(图2)证实,浓缩的高亲和性结合位点的肝素链clot-bound ATH [5)是不负责ATH的优越的催化性质。

一个模型(图3通过肝素)显示thrombin-ATH复杂,共价固定纤维蛋白,这是在通过传入的凝血酶的催化反应+常规肝素模板连接(7]。这种机制是一致的数据显示,ATH导致受伤血管内血栓的大小减少,凝块相比增长发生在+肝素(8]。我们的研究结果有影响,可能会改变治疗模式。通过“涂层”fibrin-thrombi ATH,临床医生可以使用凝块作为安抚受损血管hyperthrombotic活动平台。

4所示。结论

共价键的肝素促进纤维蛋白clot-bound结构的形成与肝素具有强大的半个thrombin-inhibitory催化活性。凝块表面转化为功能性抗凝血剂可能会选择性地完成因为ATH肝素链是静电纤维蛋白所吸引凝血酶(6]。体内实验将证实的效用实际上血栓治疗模式。

缩写

:	抗凝血酶,
重点注意:	共价antithrombin-heparin复杂,
H:	肝素钠,
哈:	肝素抗凝血酶亲和力高,
茶匙:	tris-saline-polyethylene乙二醇缓冲区,
TBS:	tris-buffered盐水,
扫描电镜:	平均数标准误差。

确认

作者欣然承认裴瑞兹Nethnapha本手稿的准备工作。这项工作是支持心脏和中风基金会的补助金安大略(批准号T5414)。安东尼·陈是一个职业侦探加拿大心脏与中风基金会。

引用

1. s . Meddahi l·巴拉,h . Fessi和m . m . Samama”药物调制与人类相关的凝血酶生成人类纯化抗凝血酶凝块的单独或在低分子量肝素和依诺肝素,”血液凝固和纤维蛋白溶解,11卷,不。1,51-59,2000页。视图:谷歌学术搜索
2. r . m . Maaroufi m . Jozefowicz j . Tapon-Bretaudiere, a m。费舍尔:“凝血酶抑制机制通过抗凝血酶和肝素辅因子II在肝素的存在,”生物材料,18卷,不。3、203 - 211年,1997页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. d·l·贝克尔j . c . Fredenburgh a·r·斯塔福德和j·韦茨,”Exosites 1和2是必不可少的保护从heparin-catalyzed fibrin-bound凝血酶抑制抗凝血酶和肝素辅因子二世”生物化学杂志,卷274,不。10日,6226 - 6233年,1999页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. h . van Aken c .预示h .大流士et al .,“抗凝:现在和未来的,”临床研究和应用血栓/止血,7卷,不。3、195 - 204年,2001页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. a . Chan l·贝瑞h . O 'Brodovich et al .,“共价antithrombin-heparin与高抗凝活性复合物:静脉注射,皮下,气管内的政府,”生物化学杂志,卷272,不。35岁,22111 - 22117年,1997页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. l·r·贝瑞·d·l·贝克尔,a . k . c . Chan“fibrin-bound抑制凝血酶的共价antithrombin-heparin复杂,“生物化学杂志,卷132,不。2、167 - 176年,2002页。视图:谷歌学术搜索
7. w·李·d·j·d·约翰逊,c . t . Esmon和j·a·亨廷顿“antithrombin-thrombin-heparin三元结构复杂的揭示了肝素的抗血栓形成的机制,”《自然结构和分子生物》上,11卷,不。9日,第862 - 857页,2004年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. A·k·c·陈,l·贝瑞,p . Klement et al .,“小说antithrombin-heparin共价复杂:兔子,血栓和出血的研究”血液凝固和纤维蛋白溶解,9卷,不。7,587 - 595年,1998页。视图:谷歌学术搜索

版权

版权©2008年莱斯利·j·史密斯等。这是一个开放的分布式下文章知识共享归属许可,它允许无限制的使用、分配和复制在任何媒介,提供最初的工作是正确引用。