实验性脑出血在小鼠体内后，组蛋白去乙酰化酶抑制剂与scriptaid缓解神经功能障碍

摘要

目标。为了研究与scriptaid的小鼠减少脑出血（ICH）后脑损伤中的作用。方法。一个脑出血模型通过注射自体血液注入小鼠右侧基底节区构成。The animals were administered 3.5 mg/kg of Scriptaid intraperitoneally after ICH. The hematoma volume and hemoglobin level were measured to examine hematoma resolution. A behavior test and brain edema and white matter injury examinations indicated brain injury after ICH.结果。Scriptaid treatment promoted hematoma resolution and reduced the hematoma volume 7 d after ICH compared with the vehicle group ( )。Scriptaid治疗也可减轻同侧基底神经节脑水含量( )及皮质( ) 3 d after ICH. In addition, Scriptaid improved neurological function recovery and alleviated white matter injury 35 d after ICH.结论。与scriptaid可以ICH后防止脑损伤，并可以考虑ICH新的药物治疗方法。

1.介绍

脑内出血（ICH）是具有高发病率和死亡率冲程的致命子类型，占10％-15％的中风[1]。脑损伤ICH后的机制已经在过去几十年中，包括原发性和继发性脑损伤取得了很大的理解。原发性脑损伤，主要是由于从淤血的质量效果和机械破坏。继发性脑损伤要复杂得多，并且主要是由于血肿和有毒血液成分[生理反应2- - - - - -4]。不幸的是，没有有效的药物治疗可在患者脑出血，以改善功能的结果。

神经炎症在ICH后继发性脑损伤中起关键作用，与脑损伤和ICH后恢复有关[5]。首先，作为在中枢神经系统（CNS）驻留的免疫细胞，活化的小胶质释放许多炎症的因素。然后，全身性免疫细胞浸润和产生细胞因子，趋化因子，细胞外蛋白酶和活性氧物质（ROS）和诱导严重的炎症反应[6- - - - - -9]后ICH。当小胶质细胞/巨噬细胞被激活时，它们通过所谓的小神经胶质细胞/巨噬细胞极化过程切换到两种表型（M1和M2表型）10]。许多先前的研究已经表明，小胶质细胞/噬极化是一种中枢神经系统损伤过程中的动态和调节小胶质细胞/巨噬细胞极化改善创伤性脑损伤（TBI）和缺血性和出血性卒中[后炎性损伤11- - - - - -13]。最近的研究还表明，激活小神经胶质细胞/巨噬细胞增强血肿分辨率和改善功能的结果在ICH [大鼠模型14,15]。此外，血 - 脑屏障（BBB）的破坏，这有助于血肿周围水肿的发展，是继发性损伤的ICH [后的重要原因3.,16]。

Histone deacetylases (HDACs) are a class of enzymes that remove acetyl groups (O = C − CH_3.)从一个ε-N-乙酰基赖氨酸氨基上的组蛋白酸，由此允许组蛋白更紧密地包裹DNA。组蛋白脱乙酰酶抑制剂（HDACis）已被广泛用于治疗癫痫症的，神经变性疾病，和癌症[17- - - - - -19]。最近，人们对HDACs在调节炎症和免疫反应中的作用有了更深入的了解。HDACis在炎症和感染性疾病的治疗应用也有很多报道[20,21]。此外，已经努力开发创伤性脑损伤和中风的治疗HDACis。例如，HDACis抑制免疫激活，缓解脑外伤性脑损伤和缺血性中风的动物模型[22- - - - - -25]。与scriptaid是一个新的组蛋白脱乙酰酶抑制剂，及最近的研究表明，与scriptaid调制小胶质细胞/巨噬细胞极化和防止创伤性脑损伤[25,26]。然而，很少有研究调查与scriptaid的应用在治疗脑出血。因此，本研究探讨脑损伤的小鼠脑出血模型的改良与scriptaid的效果。

2.材料和方法

2.1。动物和ICH模型的构建

C57BL/6 male mice (8–10 weeks, 20–26 g) were purchased from the Chinese Academy of Sciences at Shanghai. All animals were provided free access to food and water, and all experiments were approved by the Animal Ethics Committee of Fudan University. Moreover, all experiments were performed and reported according to the ARRIVE guidelines (http://www.nc3rs.org.uk/arrive)。先前已建立ICH模式[27,28]。简单地说，动物腹膜内用4％水合氯醛麻醉。从股动脉导管获得的pH，氧分压的分析血₂柏高₂和血糖。The core body temperature was maintained at 36.0 ± 1.0°C with a feedback-controlled heating pad. The physiological information is shown in Table1。将小鼠放置在小鼠立体定位架和30 μl of nonanticoagulated autologous blood obtained from the femoral artery of the mouse or saline was injected straight into the right basal ganglia (0.2 mm anterior, 3.5 mm ventral, and 2.5 mm lateral to the bregma) at a rate of 2 μl/min带微输液泵。在血液完全注入后，针头在原地停留了10分钟，然后轻轻地取出。用骨蜡填充毛刺孔，缝合皮肤切口。

2.2。实验小组

将动物分为sham、ICH + vehicle、ICH + Scriptaid (3.5 mg/kg)三组。脑出血或假手术、Scriptaid或vehicle治疗、神经行为测试或牺牲血肿测量、脑水含量评估和免疫染色的动物分组使用抽签箱随机进行。所有主要结果研究，包括神经行为测试、血肿体积、脑含水量和免疫组化，均由对分组分配和实验条件不知情的研究人员进行。如前所述[25，在脑出血后2小时、26小时和50小时分别给动物腹腔注射Scriptaid 3.5 mg/kg。ICH +溶剂型组用等量和浓度的二甲亚砜盐水稀释，在同一时间处理。然后对动物进行行为检测，在ICH后第1、3、7、35天对动物实施安乐死，进行血肿测定、脑含水量计算和免疫组化分析。

2.3。血肿测量

如前所述[29], the brains were removed after perfusion and sliced into 1 mm-thick sections. ImageJ (version 1.49, NIH) was used to measure the ICH volumes. Additionally, the hemoglobin levels in the brain tissues were measured to quantify the hematoma size [15]。脑出血后，对侧半球和同侧皮层被拆除，剩下的脑组织溶解在德拉布坎的试剂。然后，将匀浆的收集上清液并用分光光度计测量。血肿体积（微升）使用标准曲线进行计算。

2.4。行为测试

行为测试包括转角转弯测试和挂线测试，前面已经介绍过[25,26,三十]。进行性能测试之前，所有的动物进行行为训练了三天动物异常被排除在外。以如下方式进行的转角拐测试。让小鼠进行成具有30°角的角部。由小鼠所作的匝的方向（左或右）的记录。每次鼠标重复此过程20次。计算右转弯的百分比。The wire hanging apparatus was a stainless steel bar (50 cm length, 2 mm diameter) resting on two vertical supports and elevated 37 cm above a flat surface. Mice were placed on the middle of the bar and were observed for 30 seconds in 4 trials. The amount of time spent hanging was recorded and scored according to the following system: 0, fell off; 1, hung onto the bar with two forepaws; 2, hung onto the bar with added attempt to climb onto the bar; 3, hung onto the bar with two forepaws and one or two hind paws; 4, hung onto the bar with all four paws and with tail wrapped around the bar; and 5, escaped to one of the supports. All behavior tests were performed and evaluated by a blinded observer.

2.5。脑含水量

如以前报道进行脑含水量的测量[31]。处死、斩首后，取出小鼠大脑，分为同侧皮层、同侧基底神经节、对侧皮层、对侧基底神经节、小脑五个部分。大脑各部分用电子天平称量，获得湿重，然后在100℃重力烘箱中干燥24小时，获得干重。脑含水量计算公式如下:脑含水量 。

2.6。免疫组织化学染色

用生理盐水和4%多聚甲醛(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)灌注，用20%和30%蔗糖梯度脱水PBS后，取脑。然后，样本大脑被分割成25个μ在冷冻切片机上进行m厚切片并进行免疫组织化学处理。免疫组织化学染色如前所述[12]。The primary antibodies included rabbit anti-MBP (myelin basic protein) (Abcam, 1 : 500 dilution, Cambridge, MA, USA) and mouse antinonphosphorylated neurofilaments (SMI-32, 1 : 500 dilution, Abcam). Alexa Flour conjugated antibodies (Invitrogen, Grand Island, NY, USA, 1 : 1000) were used as the secondary antibodies. The slides were covered with Fluoroshield with DAPI (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Double labeling was analyzed using an epifluorescence microscope.

2.7。统计分析

All data in this study are presented as the mean ± standard error of the mean (SEM) and have been analyzed using the SPSS 19.0 software. Student’st-test用于分析组间差异，而多组间差异用单因素ANOVA分析。两因素方差分析来评估组间和时间点之间进行性能测试的差异。差异被认为是显著时 。

3.结果

3.1。Scriptaid提高了脑出血后血肿的分辨率

血肿占位效应是脑出血后的脑损伤的重要因素。The hematoma morphology and size at 1, 3, and 7 d post-ICH are demonstrated in Figure1(一)并显示血肿吸收过程(图)1 (b))。此外，血红蛋白水平间接证明了血肿量动态变化（图1 (c))。Compared with the vehicle group, Scriptaid treatment improved hematoma absorption at 7 d post-ICH (Figure1 (d))。Scriptaid治疗减少了44%的血肿体积(3.29±0.41 mm)^3.in the vehicle group versus 1.85 ± 0.32 mm^3.在与scriptaid基; )1 (e))。血红蛋白水平下降了44.4%(3.73±0.77)μ相比于2.08±0.68)，尽管差异不显著(图)1 (f))。

3.2。与scriptaid改善神经功能障碍性脑出血

与scriptaid治疗脑出血后改善双方感觉功能。In the corner turn test, Scriptaid administration reduced the corner turn score significantly at 1 and 3 d post-ICH (Figure2(一个), )。此外，挂丝试验显示，Scriptaid治疗组在ich后1和3 d时的运动障碍较vehicle组有所改善(图)2 (b), )。

3.3。与scriptaid减少脑含水量脑出血后3天

Scriptaid treatment reduced brain edema in the ipsilateral basal ganglia (brain water content 81.53 ± 1.68 versus 77.31 ± 2.52 in the vehicle-treated controls, ) and ipsilateral cortex (brain water content 81.43 ± 1.72 versus 76.74 ± 1.34 in the vehicle-treated controls, )在3d post-ICH。然而，Scriptaid治疗组与vehicle组对侧基底神经节和皮层的脑水含量无显著差异(图)3.)。

3.4。白质与scriptaid授予的长期保存后ICH

White matter injury was evaluated by double immunofluorescent staining for MBP and SMI-32 in the ipsilateral striatum and corpus callosum at 35 d post-ICH (vehicle and Scriptaid groups) or after sham surgery (sham group) (Figures图4（a）和图4（b）)。在假手术组，SMI-32免疫反应性和高MBP表达在同侧纹状体和胼胝体，这表明没有白质损伤患者很少观察到。Scriptaid failed to alleviate MBP expression at 35 d post-ICH in the ipsilateral striatum and corpus callosum compared with those in the vehicle group (Figures图4（c）和图4（e）)。However, Scriptaid treatment reduced SMI-32 expression at 35 d post-ICH, which demonstrated alleviation of white matter injury. The relative ratio of the ipsilateral versus contralateral SMI-32 immunostaining intensity was lower in the Scriptaid group than in the vehicle group (1.83 ± 0.14 versus 2.64 ± 0.34 in the striatum, ;1。三十 ± 0.09 versus 1.62 ± 0.10 in the corpus callosum, ;数据图4（d）和图4（f）)。

4.讨论

尽管许多研究已经描述了ICH的发病机制并试图找到治疗方法，但目前对ICH尚无有效的药物治疗。HDACis已被证明在脑外伤和中风的动物模型中具有神经保护作用[22- - - - - -25]。作为一种新的组蛋白脱乙酰酶抑制剂，与scriptaid证明，以防止在小鼠模型TBI白质损伤。然而，与scriptaid在ICH的神经保护作用仍然是未知的。在本研究中，我们发现，与scriptaid改善脑出血后血肿分辨率，减轻脑水肿。In addition, Scriptaid treatment had an effect on preserving white matter integrity at 35 d post-ICH and promoting neurological behavioral functions, thereby facilitating long-term functional recovery after ICH.

ICH致继发性脑损伤主要是由毒性血液成分和血肿代谢产物引起的直接毒性和炎症所致。因此，血肿清除是ICH治疗的一个重要靶点，因为这一过程可以减轻肿块效应，减轻炎症反应，促进神经功能的恢复[14,15,29]。在我们的研究中，与scriptaid通过可能与小胶质细胞/巨噬细胞极化调制机制改善血肿分辨率。作为一种新的组蛋白脱乙酰酶抑制剂，与scriptaid可移小神经胶质细胞/巨噬细胞的极化朝向M2表型和减轻炎症[25]。小胶质细胞/巨噬细胞发挥血肿清除一个显著的作用。最近的研究表明，小神经胶质细胞激活/巨噬细胞促进ICH [后血肿吸收和神经学结局14,15,28,32]。然而，这与scriptaid处理改善血肿分辨率的具体机制仍不清楚，需要进一步研究。In mouse TBI models, 3.5 mg/kg is the optimal dose of Scriptaid for TBI treatment [26]。虽然在TBI和ICH之间的脑损伤存在的机制有许多差异，这两个条件包括血肿和脑水肿。Therefore, we also chose 3.5 mg/kg for the treatment of ICH in our study.

血肿周围脑水肿可在数天ICH和峰值的时间内发生[33,34]。脑出血后的脑水肿可提高颅内压，并诱发脑疝。水肿形成ICH后有几个阶段，包括早期阶段（涉及血肿周围凝块回缩和血清蛋白的积累），第二阶段（涉及凝血酶）和第三相（涉及红血球成分）[3.,33]。在本研究中，Scriptaid治疗可减少脑出血后3d血肿周围脑组织水肿。因此，Scriptaid可改善血肿清除并降低肿块效应，而HDACis可减少炎症，从而保护小鼠和大鼠ICH模型的血脑屏障不受破坏[23,24]。白质损伤是脑出血的不良后果的另一个重要原因。近日，显著的进步已经在ICH [后增加白质损伤的作用的认识取得35,36]。Scriptaid已被描述可以预防小鼠脑外伤模型的白质损伤，与目前的研究结果一致[25]。我们的数据还显示，与scriptaid在小鼠脑出血模型降低白质损伤。此外，脑出血后减少白色物质可以改善神经行为功能，如感觉功能。

虽然这项研究是一种新型的评价集中在保护我的脑损伤Scriptaid,仍有一些局限性:(1)没有提供信息关于Scriptaid的抗炎作用和(2)没有数据表明小胶质细胞/巨噬细胞极化之间的关系,我后血肿的决议。因此，我们将进一步研究Scriptaid在ICH中保护脑损伤的机制。

总之，我们的数据表明，与scriptaid治疗通过提高分辨率血肿，减轻脑水肿，并在小鼠脑出血模型减轻脑白质损伤防止脑损伤。因此，组蛋白脱乙酰酶抑制剂与scriptaid可以被认为是ICH新的医疗治疗方法。

数据可用性

用来支持这项研究的结果数据已存入figshare库（https://figshare.com/s/ff7cca2d39bb5fa3839b)。

的利益冲突

作者宣称，他们没有利益冲突。

致谢

这项研究是由赠款来自国家973个项目（2014CB541604-LFZ），中国国家自然科学基金委员会（NSFC）（81500987和81771237），和上海的科学技术委员会（上海市科委）（15140902300）的支持。

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