神经保护的影响骨髓间充质干细胞对双边颈总动脉闭塞的脑缺血大鼠模型

文摘

细胞疗法是最先进的治疗脑缺血的现在。这里,我们将讨论的神经保护效应骨髓间充质干细胞(bmsc)静脉注射后大鼠海马细胞这些细胞在缺血再灌注模型。成年雄性Wistar鼠被分成5组:控制、虚假的(手术没有颈总动脉堵塞),缺血(颈总动脉阻塞再灌注前30分钟),车(7天后缺血PBS通过尾静脉注射),和治疗(注射BMSC到尾静脉缺血后7天)。我们进行了神经肌肉和vestibulomotor功能测试来评估行为的功能,最后,大脑受到苏木精和伊红()),anti-Brdu免疫组织化学,和TUNEL染色。缺血组严重的细胞凋亡。综合治疗组有较低的死亡率也在功能恢复有显著提高()。缺血再灌注对30分钟引起海马的损伤和广泛的神经元死亡,尤其是在CA1和CA3区域,导致几个功能和神经赤字。总之,静脉注射的bmsc可以显著减少凋亡神经元的数量,显著提高功能恢复,这可能是一种有益的缺血性损伤的治疗方法。

1。介绍

在世界范围内,脑缺血是长期残疾的主要原因之一,发病率和死亡(1,2]。脑缺血后再灌注诱发神经炎症和过度生产活性氧(ROS) (3,4]。在生理条件下稳态平衡由内源性氧自由基的形成及其去除食腐动物存在(5]。脑缺血期间,减少葡萄糖和氧气输送到大脑导致损伤脂质自由基的生成,DNA和蛋白质,除了炎症和血脑屏障(BBB)的分解,导致细胞死亡(6- - - - - -8]。

脑缺血可导致感觉、运动、认知、和空间学习障碍根据缺血性事件的位置(9- - - - - -11]。运动障碍与脑缺血导致残疾,影响生活质量12]。海马体是大脑的第一个区域影响脑缺血神经退行性疾病和伤害。海马的CA1区锥体神经元是最敏感的神经元缺氧和随后的死亡在缺血条件下(13- - - - - -15]。

在动物模型中,已经证明,缺血损伤机制,包括会引起线粒体功能障碍和氧化应激。保护细胞免受脑缺血的路上,分子伴侣’或压力蛋白质和一些凋亡BCL2细胞凋亡调控蛋白家族的成员可以保护线粒体功能,减少氧化应激(16- - - - - -18]。

目前,只有少数有效的临床治疗方法存在脑缺血导致完整功能恢复(19]。最近,干细胞治疗提供了一种治疗工具的组织修复和功能恢复神经系统疾病和脑缺血20.- - - - - -22]。干细胞有能力无限的自我更新和产生分化细胞从各种细胞谱系23- - - - - -25]。他们被分类根据来源胚胎、胎儿,或成体干细胞。胚胎干细胞(ESCs)限制可用性和移植后形成畸胎瘤。由于道德问题,他们的应用程序是有限的(26,27]。干细胞、骨髓间充质干细胞(bmsc)有更大的潜在的用于神经系统疾病的治疗。这些细胞可以很容易地从患者获得没有道德或免疫问题,可以在体外条件下大量生产(28,29日]。

几项研究已经表明,bmsc可以迁移到大脑的损伤部位,分化成神经元和胶质细胞(30.]。先前的研究主要集中在分子和脑缺血的组织学方面,而不是行为的后果。然而,行为任务是合适的工具为研究脑缺血的后果。本研究调查的组织病理学和行为影响静脉注射bmsc移植大鼠实验性脑缺血再灌注模型。

2。方法和材料

2.1。动物

成年雄性Wistar鼠(得到了),重250 - 300克的动物屋Urmia大学医学院医学科学,Urmia,伊朗。动物是维持在21±1°C (%湿度)在12 h光/ 12 h黑暗周期提供水和食物随意。动物保健和动物使用的通用协议批准Urmia大学动物伦理社会的医学科学。

2.2。实验设计

我们随机将大鼠分为5组()如下:控制(完整)的动物接受没有缺血或治疗;(2)虚假的动物没有堵塞进行了手术的颈总动脉;(3)缺血的双边颈总动脉被封锁为了诱导缺血30分钟;(4)车辆的老鼠收到30μL磷酸盐(PBS)注入他们的尾静脉缺血后7天;(5)治疗的动物收到bmsc (1×10⁶在一个30μL悬挂)注入他们的尾静脉缺血后7天。

2.3。实验性脑缺血再灌注模型

我们使用一个修改方法Jingtao et al。31日脑缺血再灌注诱导。动物与氯胺酮麻醉(80毫克/公斤,Daroopakhsh、伊朗)和甲苯噻嗪(10毫克/公斤,Daroopakhsh、伊朗)。老鼠被放置在仰卧位操作表和变暖毛毯覆盖着。每个动物的体温控制在手术过程中温度控制单元。

与Betadine剃须和准备后,中线切口,暴露颈总动脉。解剖胸锁乳突肌和胸骨舌骨的肌肉之间是平行于气管。每个颈总动脉被释放从其外膜鞘,小心地分离迷走神经。诱导的缺血,颈总动脉闭塞使用微动脉瘤夹30分钟再灌注紧随其后。皮肤缝合是用丝绸做的缝合。

2.4。隔离和文化的骨髓间充质干细胞(bmsc)

骨髓被隔离在无菌条件下从8-week-old男性雄性sd大鼠中(重量:250 - 300 g)所详细描述的阿齐兹et al。32]。短暂的老鼠过量戊巴比妥之后,他们的胫骨和股骨切除。两端的骨骼被削减和骨髓是吸气5毫升DMEM (Sigma-Aldrich)和25针。结果悬挂在800转离心5分钟,上层的移除。随后,骨髓细胞悬浮在10毫升10%胎牛血清的DMEM补充的边后卫,2毫升谷氨酰胺,100 U /毫升青霉素(Sigma-Aldrich),和100 U /毫升链霉素(Sigma-Aldrich)。

48小时后,不依从bmsc被替换中移除。当达到80% confluency,细胞分离和收获后5分钟接触0.25%胰蛋白酶/ 1毫米EDTA(美国Sigma-Aldrich) 37°C。细胞随后一段分为四个进一步孵化的亚文化。的不同阶段培养骨髓间充质干细胞(bmsc)如图1。

2.5。标记bmsc和细胞移植的过程

这些细胞被标记为3μg / mL溴脱氧尿苷(Brdu)解决方案添加到孵化中移植前72 h (33]。

2.6。细胞移植过程

8组动物5(治疗)与氯胺酮麻醉(80毫克/公斤)和甲苯噻嗪(10毫克/公斤)在缺血后7天。大约1.0×10⁶通过3 bmsc悬浮在30岁μL PBS被静脉注射给予大鼠的尾静脉在5分钟内。汽车集团只收到1毫升的注入PBS尾静脉注入。免疫抑制剂并没有用于任何动物在这个研究。

2.7。免疫组织化学分析

在缺血后12天,老鼠深深与戊巴比妥钠麻醉(100毫克/公斤,IP),然后用4%多聚甲醛灌注transcardially 0.1磷酸盐缓冲剂(pH值7.3)。经颅灌注后,动物的大脑被移除和后缀在4%多聚甲醛一周。接下来,我们加工的组织和一系列相邻的5μ米厚的部分被削减的石蜡块冠状平面。免疫组织化学染色法是用来检测海马的bmsc移植的分布,如下:deparaffinization样本的二甲苯(默克公司、德国),水化分级酒精系列(100、96、80,70%),孵化50%甲酰胺(默克公司、德国),孵化2 x标准柠檬酸钠(SSC,默克公司、德国)2 h在65°C,孵化2 N盐酸(默克公司、德国)30分钟在37°C,冲洗在0.1 N硼酸(默克公司、德国、pH值8.5)10分钟,其次是PBS洗,孵化用鼠标anti-Brdu抗体(σ,德国)一夜之间在4°C,冲洗在PBS(3 * 10分钟),孵化与二次抗体结合辣根过氧化物酶(山羊anti-mouse免疫球蛋白)(σ,德国)2 h,孵化和四氯化diaminobenzidine水合物(轻拍,σ,德国)5分钟,之后,幻灯片和苏木精复染色,光学显微镜下安装,检查。

2.8。终端原位dUTP结束标记(TUNEL)

细胞凋亡是由终端原位dUTP结束标记(TUNEL)检测到凋亡细胞的DNA片段。TUNEL染色进行原位检测细胞死亡工具包(罗氏分子化学、猫。号码11684817910)。简而言之,在二甲苯脱蜡、水化的部分(σ,德国)和一系列评分的100%,90%,80%,70%乙醇。内源性过氧化物酶活性被孵化H为0.3%₂O₂在甲醇为30分钟。透化作用的组织,部分被孵化20μg / mL蛋白酶K(罗氏公司、德国)在10毫米三羟甲基氨基甲烷HCl液pH值(7.5)在室温下10分钟。然后,部分在50孵化μL (TUNEL解决方案(原位细胞死亡检测装备,罗氏,德国)1 h在37°C。与转换器POD孵化后,合1 h在37°C,部分与民建联孵化(σ,德国)发色体在37°C。细胞与苏木精复染色(σ,德国)20年代。部分脱水在一系列评分的70%,80%,90%,100%乙醇和在二甲苯清除了15分钟。之后越来越多的部分是由光学显微镜检查。

2.9。细胞计数和凋亡指数的决心

我们统计凋亡细胞的数量通过随机选择20微观领域在海马CA1和CA3区。凋亡锥体神经元数40 x放大后的平均数凋亡细胞在CA1和CA3区域进行了计算。细胞的总数在每个字段数和平均数计算。我们确定每组凋亡指数如下:

2.10。组织病理学评价

的5 -μ米准备部分被用于组织病理学评估。苏木精和伊红染色部分(圆))研究了在光学显微镜(400 x)为了评估的存在如嗜酸性坏死和神经赤字和三角形状的神经元,浓缩和致密的原子核,液泡化。

2.11。行为检查

在三天前手术,动物进行日常培训评估神经肌肉和vestibulomotor功能。每个老鼠的总分计算。根据这些测试中,得分越高的动物有更多的赤字。

2.12。神经肌肉功能

这个测试包括6个单项成绩:前肢弯曲,扭转,抗侧推,盘旋,后肢放置和倒角板扣人心弦。单项成绩和评分方法进行了描述,亚历克西斯et al。34]。

前肢弯曲,一个正常的老鼠将延长两前肢向表面时持有的尾巴上面平面而梗塞的动物将flex麻痹前肢。弯曲的程度不同从轻微的手腕弯曲和肩膀绑架整个前肢的严重弯曲。躯干扭转在正常大鼠涉及整个身体的延伸向表面时持有的尾巴上面一个平面上。受感染的老鼠显示旋转行为(身体旋转)是不同的从轻微扭动身体的严重肢体动作使头部和后肢附近的前肢。向受伤和麻痹通常会发生扭曲。在侧推测试正常的动物举行肩膀后面,推到左边或者右边。正常的老鼠显示等于阻力而梗塞的老鼠当推向侧方会显示没有阻力或弱阻力。在盘旋,正常老鼠通常不会圆门。然而梗塞的老鼠经常向侧方圈。正常大鼠后肢位置测试期间将立即返回其后肢的表面被移除; however infarcted rats show a delay in placement or no placement of the hind limb. In the inverted angle board test, the normal rat can be trained to turn 180 degrees and move to the top of the angled board. Infarcted rats cannot turn and move up the board.

2.13。Vestibulomotor函数(梁的平衡)

这个测试评估皮质电动机赤字。执行的测试及其评分法根据亚历克西斯et al。34)和Petullo et al。35]。短暂,动物被定位在一束3/4英寸宽度,10英寸的长度是暂停1英尺以上表。正常的动物应保持稳定的姿态与所有四肢上的60年代的梁。

2.14。统计分析

使用SPSS 17.0软件进行统计分析。统计不同群体之间的差异进行评估与单向方差分析(方差分析)其次是图基测试多个成对考试。的值被认为是具有统计学意义。根据Kolmogorov-Smirnov测试的结果,行为评估缺乏正态分布的数据。因此,非参数克鲁斯卡尔-沃利斯和Mann-Whitney测试被用于统计分析。

3所示。结果

3.1。免疫组织化学结果

通过bmsc移植到老鼠。前三天移植,细胞与Brdu标记(σ,德国)。transcardial灌注后,我们准备5μ为了检测bmsc m石蜡部分。部分是沾anti-Brdu抗体(σ,德国)免疫组织化学显示设备指令。免疫组织化学结果证实移植细胞的存在和生存能力的区域病变(海马)。在受伤部位植入bmsc幸存(海马)。光学显微镜(图2)表明,静脉注射移植Brdu-positive bmsc存活和迁移到受伤的网站(海马的CA1, CA3区)。

3.2。TUNEL染色

我们使用TUNEL染色法测定凋亡细胞的数量在海马的CA1和CA3区域(图3)。TUNEL阳性细胞的平均数量如下:(控制),(虚假的),(缺血),(车辆),(治疗)。TUNEL阳性(凋亡)细胞的百分比如下:控制(15.44%)、缺血(43.37%),治疗(23.61%)、虚假的(17.92%),和车辆(43.29%)。对照组和缺血组最高最低数量的凋亡细胞。治疗组比缺血组凋亡细胞较少。

一个显著差异存在于TUNEL阳性细胞的数量之间的控制和缺血组(,图4)。有统计上的显著差异TUNEL阳性细胞数量之间的局部缺血和治疗组(,图4)。

3.3。凋亡指数测定

凋亡指数已经确定为每组(1)。

在结果中,凋亡指数(缺血)是43.37%,43.29%(车辆)、23.61%(治疗),17.92%(假的),15.44%(控制)。治疗组的凋亡指数低于缺血组(图5)。

3.4。组织病理学评价

组织病理学评估显示,对照组神经元和神经组织是完整的,有正常的形态(图6(a))。这些细胞在大脑组织完整性和规则的结构。锥体细胞圆形细胞核,著名的核仁,明显的细胞质。缺血组有很多锥体细胞固缩的原子核,缺乏细胞核、细胞质和深染细胞对照组相比(图6(b))。BMSC治疗组中,我们观察到相当数量的减少细胞固缩的原子核,缺乏细胞核、细胞质和深染相比缺血组(图6(c))。

3.5。行为检查

3.5.1。影响骨髓间充质干细胞(bmsc)神经肌肉功能

6子的神经肌肉功能测试包括:前肢弯曲,扭转,抗侧推,盘旋,后肢放置和倒角板扣人心弦。这些测试的细节部分2.12。在这项研究中,我们有分级神经肌肉功能的严重程度和度根据表1。神经肌肉功能测试评估神经肌肉皮质赤字。动物得分越高赤字,这意味着更高的分数表明贫穷的结果和更低的分数表明良好的结果。

在结果中,有一个显著增加()在缺血神经肌肉功能测试得分(6.56)和车辆(6.43)组相比控制(0.0)组。综合治疗组有明显改善(3.12)在神经肌肉功能与缺血和车辆组()(图7)。

3.5.2。影响骨髓间充质干细胞(bmsc) Vestibulomotor函数

vestibulomotor功能测试评估运动皮质的赤字。短暂的动物被一束3/4英寸宽度,10英寸的长度是暂停1英尺以上表。正常的动物应保持稳定的姿态与所有四肢上的60年代的梁。的严重程度和度vestibulomotor函数是分级表2。动物有更高的分数更多的赤字;换句话说,更高的分数表明贫穷的结果和更低的分数表明良好的结果。

在这项研究中有一个显著增加vestibulomotor得分函数的局部缺血(3.25)和车辆(3.00)组()与控制(0.0)。治疗组有明显改善(1.12)在vestibulomotor函数与缺血组(,图8)。

4所示。讨论

bmsc的这项研究表明,静脉移植缺血再灌注损伤后一周减少锥体神经元的凋亡水平在海马的CA1和CA3区域和提高功能恢复。根据领域的类似研究脑缺血,治疗过程(尤其是干细胞)缺血诱导后7天开始。研究人员认为,在脑缺血后的第一个星期,有一个收集的毒素和谷氨酸神经递质和自由基受伤的大脑区域和7天后这些毒素被删除,该地区准备接受任何新的治疗(干细胞生长因子、神经营养因子等)(36,37]。

结果显示,bmsc的静脉移植缺血再灌注损伤后一周减少锥体神经元的凋亡水平在海马的CA1和CA3区域和提高功能恢复。此外,bmsc文化(图的结果1),与Brdu标记免疫组织化学显示Brdu-positive bmsc存活和迁移到损伤部位(海马)(图2)。此外,TUNEL染色的结果测定凋亡细胞缺血性损伤后(图3)表明,TUNEL阳性细胞的平均数量在缺血组和对照组最高最低TUNEL阳性细胞数和数量有显著差异之间的凋亡细胞缺血和对照组(,图4)。凋亡指数降低缺血组相比,治疗组(图5)。最后,这些结果表明,bmsc注射后缺血再灌注导致海马细胞的生存和减少这些细胞的凋亡。

上述结果表明缺血再灌注模型的双边颈总动脉闭塞了30分钟,然后reperfused是一个有效的实验模型。大多数的凋亡细胞缺血组的观察,证实该模型可以导致最多的海马细胞凋亡细胞。显著减少观察凋亡细胞的数量相比治疗组缺血组。此外,统计上的显著差异存在于凋亡细胞的数量之间的治疗和缺血组()。

在组织病理学评估结果很明显,对照组神经元形态正常,圆核、杰出的核仁,和清晰的细胞质,而缺血组有很多锥体细胞固缩的原子核,缺乏核仁,胞浆浓染的。BMSC治疗组明显降低了细胞的数量与致密的原子核,缺乏细胞核、细胞质和深染相比缺血组(数字6(一)-6(c))。这些发现表明政府的bmsc缺血再灌注后减少凋亡细胞的数量。

行为的结果考试评估中的感觉运动功能三个方面,神经肌肉,vestibulomotor,和复杂的神经运动的,显示在神经肌肉功能评分减少BMSC相比治疗组缺血组。这个结果表明显著改善()在治疗组神经肌肉功能。此外,vestibulomotor函数和复杂的神经运动的函数的结果显示,这些测试的分数降低治疗组与缺血组相比。这些结果指出显著改善()vestibulomotor治疗组的功能和复杂的神经运动的功能。最后,它可以在行为检查bmsc的静脉注射后缺血再灌注显著提高功能恢复。

许多研究人员相信bmsc分泌大量生长因子(38),神经营养因子(39)和脑利钠肽,减少神经元凋亡[40]。另一方面,一些科学家解释,bmsc多功能细胞能分化成神经元和神经胶质细胞在体外(41和体内42];因此这些神经元和胶质细胞可以替代受损细胞(43),受损组织再生,促进功能恢复。

马哈茂德等人研究了创伤性脑损伤的实验模型。他们注射bmsc静脉注射和报道,这些细胞迁移到动物的大脑和提高功能恢复(44]。他们测量神经生长因子(神经生长因子)、脑衍生神经营养因子(BDNF)和纤维母细胞生长因子β(bFGF),得出的结论是,这些因素可能会提高功能恢复(45]。Crigler等人报道,注入bmsc分泌神经营养因子,生长因子,细胞因子,导致细胞增殖,生存和分化46]。陈等人证明bmsc分泌神经生长因子、脑源性神经营养因子、神经胶质细胞衍生神经营养因子(GDNF),生成3 (NT3)、bFGF,血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)和睫状神经营养因子(据)47]。

尼凯斯等人bmsc移植实验的肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)模型。他们的研究表明,神经生长因子表达bmsc, FGF2和胰岛素样生长因子(IGF)。他们得出结论,bmsc生长因子的表达导致大脑神经元生存(48]。Joghataei等人养殖bmsc和雪旺细胞(SCs),然后将它们移植到脊髓损伤的实验模型。发现他们的研究表明,这些细胞促进功能恢复,导致轴突再生的受伤的动物。他们建议bmsc, SCs分泌神经营养因子导致功能恢复在这些动物49]。穆尼奥斯等人报道,领导的bmsc移植神经发生在海马细胞增加50]。陈等人开发了一个实验性中风模型通过阻塞大脑中动脉。静脉注射后bmsc,他们评估水平的神经发生,细胞凋亡和bFGF的表达。他们的研究结果表明,bmsc增加神经发生和bFGF的表达和细胞凋亡的减少51]。

所有的上述结果同意当前研究的结果。我们表明,静脉注射的bmsc实验模型的缺血再灌注导致海马细胞生存,这些细胞凋亡的减少和改善功能恢复。有人提议post-ischemia-reperfusion注入bmsc表达神经营养和生长因子,防止神经细胞凋亡,导致神经元和神经胶质细胞生存,导致增强行为复苏。这些因素提供了一个合适的环境,促进轴突生长和导致运动的复苏。bmsc可改善血管化通过VEGF的表达导致受损神经组织修复(52]。

我们的研究结果表明,政府的bmsc缺血再灌注后一周可以减少大鼠的海马细胞凋亡模型。这导致了改善运动功能和它可能是用作人类脑缺血的一种有用的治疗方法。bmsc具有许多优势相比其他细胞常用于细胞疗法;他们可以很容易地分离和培养和移植是安全的没有免疫反应。的确,需要进一步的研究的发展在人类身上这种方法用于治疗中风。

5。结论

在这项研究中,通过静脉注射的结果综合在缺血再灌注的动物模型显示相当大的减少海马细胞凋亡的神经元生存和功能恢复。这可能是一个有益的缺血性损伤的治疗方法。有人提议post-ischemia-reperfusion注入bmsc表达神经营养和生长因子,防止神经细胞凋亡,导致神经元和神经胶质细胞生存,导致增强行为复苏。这些因素提供了一个合适的环境,促进轴突生长和导致运动的复苏。

缩写

伴着:	骨髓间充质干细胞
Brdu:	溴脱氧尿苷
ROS:	活性氧
PBS:	磷酸盐
TUNEL:	终端原位dUTP结束标签
神经生长因子:	神经生长因子
脑源性神经营养因子:	脑衍生神经营养因子
bFGF:	纤维母细胞生长因子β
GDNF:	神经胶质细胞衍生神经营养因子
NT3:	生成3
VEGF:	血管内皮生长因子
HGF:	肝细胞生长因子
据:	睫状神经营养因子
肌萎缩性侧索硬化症:	肌萎缩性脊髓侧索硬化症。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

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