异黄酮变弱震颤麻痹的Caspase-1和Caspase-3水平细胞模型

文摘

大豆异黄酮的研究调查了影响变弱的caspase-1和caspase-3水平细胞模型震颤麻痹。受试者PC12细胞。他们被随机分为六组:控制,边际产量⁺(250μmol / L)、异黄酮(10μ米)、异黄酮(10μ米)+ MPP⁺(250μmol / L), Z-YVAD-CHO (10 nM) + MPP⁺组和Z-DEVD-CHO (10 nM) + MPP⁺组。细胞生存能力是衡量MTT方法;酪氨酸羟化酶的含量测定,免疫细胞化学的方法avidinbiotin过氧化物酶复杂;细胞凋亡率被流式细胞仪测量。结果表明,在MPP细胞生存能力⁺组低于所有其他五组。异黄酮之间没有差别在细胞生存能力+ MPP⁺和对照组。TH阳性细胞光密度的异黄酮组高于控制,异黄酮+ MPP⁺和MPP⁺只有团体。异黄酮+ MPP的细胞凋亡率⁺组和对照组和Z-YVAD-CHO + MPP⁺和Z-DEVD-CHO + MPP⁺组相似,低于边际产量⁺组。细胞凋亡率最低的是发现只异黄酮组。

1。介绍

从大豆异黄酮成分之一。研究[1- - - - - -3)表明异黄酮有雌激素的影响,有许多潜在的临床意义与作用机理,特别是在治疗和预防糖尿病、心血管疾病、癌症、骨质疏松症、神经保护。我们之前的研究(4]表明,雌激素有保护作用的细胞模型帕金森病,但雌激素可能带来一些副作用,限制了其临床使用,因此许多研究人员正在寻找更好的替代雌激素,它不仅具有雌激素的作用,但也没有副作用;幸运的是研究人员发现植物雌激素(1]。异黄酮是一种植物雌激素具有同样的效果。在这项研究中,我们使用帕金森病细胞模型研究异黄酮是否具有保护作用,并探讨了机制。越来越多的证据表明,细胞凋亡是神经元变性的基本机制5]。1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP的活跃的代谢的结果⁺注射),MPTP药物可能诱导PC12细胞凋亡的5,6]。有许多研究表明[7,8]MPP⁺可以诱导细胞凋亡通过半胱天冬酶(9]。在这项研究中,我们观察到震颤麻痹的异黄酮对细胞的影响模型和caspase-1和caspase-3如何发挥作用的过程中损伤引起的边际产量⁺在PC12细胞中,为了研究异黄酮帕金森疾病的保护机制。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

PC12细胞培养在37°C RPMI 1640媒体补充10% FCS, 2毫米谷酰胺,青霉素100单位/毫升,100μ链霉素的g / mL湿润房间空气中大气中5%的二氧化碳。把分散的细胞被镀上collagen-coated 96 -孔板的密度3×10⁴细胞/好,培养在不同时间和药物治疗方案的组合。

培养细胞被分为六组:控制(车辆),边际产量⁺(250μmol / L),异黄酮(10μ米)+ MPP⁺(250μmol / L)组,异黄酮(10μ米)组,Z-YVAD-CHO(10毫米)+ MPP⁺组和Z-DEVD-CHO(10毫米)+ MPP⁺组。(Z-YVAD-CHO caspase-1的抑制剂;的抑制剂是Z-DEVD-CHO caspase-3)。使用方法由克里斯蒂Chinopiulos维拉Adam-Vizi,正如我们报道在我们以前的工作(6),在MPP PC12细胞⁺250年组处理μMPP mol / L⁺、诱导细胞凋亡与帕金森病。异黄酮组细胞培养与异黄酮浓度10μM。

2.2。噻唑基溴化四唑蓝(MTT)测定细胞的生存能力

与MPP PC12细胞治疗后⁺解决方案(5毫克/毫升,σ)和不同剂量的大豆异黄酮(0,5μ10米,μ50米,μ米)。在37°C孵化4 h,甲瓒cuystal于100年解散μl二甲亚砜(DMSO)和MTT还原为570 nm使用dg - 3022 - ELISA板读者。控制值是100%,与实验值被降低的比例在减少肝癌。细胞生存能力和代谢物被A570评估。

2.3。免疫细胞化学的酪氨酸羟化酶(TH)

这是执行评估的水平在PC12细胞儿茶酚胺的生物合成。部分是孵化0.3% Triton x - 100在PBS 1 h在室温下,然后用山羊孵化anti-rat TH单克隆抗体(1:250稀释0.01更易与L磷酸缓冲盐,PH值7.4),添加在一夜之间在4°C。幻灯片被孵化与生物素化的兔抗体免疫球蛋白和SABC-reagent 30分钟在37°C。随后,细胞处理50 ul的3′-diaminobenzidine (DAB)解决方案(σ)。细胞与苏木精染色,用乙醇脱水。在显微镜下,细胞与深棕色的颜色被认为是积极的表达酪氨酸羟化酶(TH),而浅紫色被认为是消极的。

2.4。免疫印迹Caspase-1和Caspase-3

细胞收获机械刮到4°C PBS溶液,然后添加细胞裂解缓冲进入细胞离心液在12000 g 5分钟。然后获得上的蛋白质。蛋白质浓度测定BioRad蛋白质分析。每口井的30毫克的蛋白质被加载到8% sds - page凝胶。蛋白质提取是电泳和转移到PVDF膜。膜被封锁在5%牛奶没有脂肪和孵化主要抗体caspase-1(1: 2000年,σ)和caspase-3(1: 2000年,σ)和β肌动蛋白(σ1:2000)。膜被洗在TBS + 0.1% Tween-20和孵化HRP-conjugated二级抗体,紧随其后的是另一个洗。膜被开发与ECL试剂和暴露在电影。

2.5。通过流式细胞仪检测凋亡细胞

内皮细胞的凋亡率是衡量DNA流式细胞术和DNA电泳(表2)。膜联蛋白V绑定是评估使用二元流式细胞术,和细胞染色评估与异硫氰酸荧光素(FITC)贴上膜联蛋白V(绿色荧光),同时与染料排除propidium碘(PI)红色荧光(负)。在每一组中,总细胞和幸存的细胞也算在五和平均值。

2.6。统计分析

数据表示为±SD方法。统计分析的数据为多个比较是由方差分析。比较单一,学生的以及使用。分类数据与卡方检验进行了分析。被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。细胞生存能力

如图1我(10、细胞生存能力μ米)组高于其他人,所以我们选择我(10μ米)的有效剂量。

如表所示1在MPP,细胞生存能力⁺组低于控制()、异黄酮+ MPP⁺(),Z-YVAD-CHO + MPP⁺,Z-DEVD-CHO + MPP⁺组()。没有显著差异异黄酮+ MPP之间的细胞生存能力⁺和对照组()。

3.2。细胞凋亡和TH阳性PC12细胞的平均吸收能力

TH阳性细胞染色棕色。TH阳性细胞的清白的细胞核大而圆,用一个空的外观(图2)。细胞治疗与异黄酮大于细胞控制或边际产量⁺组,和大多数isoflavone-treated细胞神经炎(图2)。一些非常小而圆在MPP细胞被发现⁺组(图2)。

在TH阳性细胞光密度异黄酮组高于控制(与,)、异黄酮+ MPP⁺(,),和边际产量⁺只有集团(,)。没有控制和异黄酮+ MPP之间的显著差异⁺集团()。

异黄酮+ MPP的细胞凋亡率⁺组和对照组(33.6%)(31.3%)和Z-YVAD-CHO + MPP⁺(34.2%)和Z-DEVD-CHO + MPP⁺组(35.6%)相似(、表1),低于边际产量⁺组(63.5%)(、表1)。细胞凋亡率最低的是中异黄酮组(11.5%,、表1)。

3.3。Caspase-1和Caspase-3蛋白质水平

蛋白质的水平在MPP caspase-1和caspase-3更高⁺组比控制()、异黄酮+ MPP⁺(),Z-YVAD-CHO + MPP⁺,Z-DEVD-CHO + MPP⁺组()。异黄酮+ MPP没有显著区别⁺和对照组()。

4所示。讨论

的损失中产生多巴胺的神经细胞物质的中脑是帕金森病的主要病理特征10]。一项研究发现,中脑神经元的损失呈正相关caspase-3阳性神经元PD患者的解剖(当使用免疫组织化学方法11]。caspase-1和caspase-3升高的水平的多巴胺能神经元退行性的物质紧凑的部分(12]。subchronic PD小鼠模型的注射由MPTP药物,caspase-3的激活在头两天达到高峰,但多巴胺神经元的损失并不明显,直到第七天(12]。

先前的研究表明细胞凋亡蛋白酶激活多巴胺能神经元的早期信号在细胞凋亡的过程。在这项研究中,我们添加了边际产量⁺PC12细胞和诱导细胞凋亡模型类似于PD神经元损伤。我们已经观察到的影响异黄酮和caspase-1 caspase-3抑制剂对PC12细胞凋亡。没有统计上的显著差异在细胞生存能力,细胞凋亡率,以及异黄酮+ MPP之间TH光密度⁺(),Z-YVAD-CHO + MPP⁺,Z-DEVD-CHO + MPP⁺组(MPP)和对照组细胞,但是⁺组低于其他组,和异黄酮组高于其他组。在MPP Caspase-1 caspase-3蛋白质水平更高⁺组比所有其他组,和异黄酮组低于所有其他组织。边际产量没有显著区别⁺+异黄酮组和半胱天冬酶抑制剂+ MPP⁺集团和MPP⁺组细胞活性,光密度,细胞凋亡率,caspase-1 caspase-3蛋白质水平。半胱天冬酶抑制剂组的细胞活性和TH光学密度明显升高,但凋亡率显著降低。这正好与之前的研究结果13]。的β蛋白酶家族的哺乳动物及ced-3生产控制线虫细胞凋亡基因是高度保守的。家族蛋白质有半胱氨酸酶和天冬氨酸特定的酶,也叫半胱氨酸吸入特定蛋白酶半胱天冬酶。大量研究表明,细胞凋亡蛋白酶介导神经元细胞凋亡的神经退行性疾病,但酶可以节省神经元的死亡过程,细胞凋亡刺激过程。Caspase-1 14和caspase-3是两个半胱天冬酶家族成员,它与细胞凋亡有密切的关系(14]。Caspase-3 ced-3相关的半胱氨酸蛋白酶,异质二聚体,由28 kD酶原酶解,构成17和12 kD子单元。这是早期的关键酶激活和下游直接介导细胞凋亡的影响。Caspase-3被称为“细胞凋亡高管”最直接的基因在调节细胞凋亡。MPP⁺可以激活细胞凋亡级联反应,线粒体膜电位降低,加速肿瘤坏死因子(TNF)记录,并激活caspase-3线粒体膜开孔,提高其渗透性,最终导致多巴胺能神经元的凋亡。所以我们初步提出异黄酮和半胱天冬酶抑制剂可以防止细胞死亡和异黄酮可能扮演的角色类似于半胱天冬酶抑制剂在保护和直接抑制细胞凋亡高管”活动,有效地抵抗细胞凋亡的发生(15]。结果可能是由于异黄酮镇压MPP的事实⁺全身在PC12细胞凋亡。细胞凋亡的抑制与压制caspase-1和caspase-3相关联。

最近的研究表明,(8,16]半胱天冬酶抑制剂不仅可以抑制细胞死亡,也节省轴突损失和减少3 h假货。半胱天冬酶抑制剂可能使神经元不朽,但它不是有效的功能恢复。但由于合成半胱天冬酶抑制剂不能通过血脑屏障,所以限制其临床应用。但众多研究表明异黄酮可以通过改变细胞生存,保护神经轴突延伸,增强神经递质传递,反映出明显的优势(12,13]。植物性雌激素的广泛应用和安全提供良好的前景雌激素在PD的临床治疗。我们必须指出,有很长一段路要进一步研究效应和机制。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

Jian-xin徐、Hai-ping歌和Qing-Xia布鲁里溃疡的贡献同样这项工作。

承认

本研究支持,在一定程度上,得到了国家自然科学基金(NNSF),中国。

引用

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