文摘
本研究的目的是评估甲肝病毒(HAV)和E型肝炎病毒(HEV)污染的贻贝(Mytilus galloprovincialis)从Cherrat河口(摩洛哥大西洋沿岸),摩洛哥。总共52个样品(n= 12贻贝/每个)收集在四个地点在河口,月刊,2019年3月至2020年3月。甲型肝炎和戊肝病毒检测到实时逆转录聚合酶链反应(rt - pcr)方法根据ISO / TS 15216。甲型肝炎中检测出46.15%的样本分析。相反,戊肝病毒没有检测到任何样品。此外,甲型肝炎检出率明显与季节性降雨的变化有关。这种定性研究甲肝病毒和戊肝病毒污染突出研究野生的贻贝样本地区的利益。甲型肝炎病毒出现在贻贝代表一个潜在的健康风险,病毒污染的贻贝监测是必要的,以保护消费者。海洋贝类Cherrat河口污染必须被监控,因为贝类所扮演的角色是甲型肝炎水库和/或车辆接触甲型肝炎病毒的传播。
1。介绍
贝类是全球水产食品的重要组成部分1]。这个术语描述了甲壳类和软体动物。软体动物分为头足类动物,腹足类、双壳类。商业上重要的双壳类软体动物贻贝、牡蛎、蛤,扇贝(2]。贻贝生物饲料的过滤水的水生环境(3]。因此,他们可以集中微生物污染物(3- - - - - -5),包括肠病毒(6- - - - - -8]。此外,蚌类可以住在沙/砾石沉积物肠病毒大量存在的表层在接触水9,10和几个月还是会有传染性11,12]。感染在大多数情况下,不同病毒株已发现有牵连的贝类,建议在原来的环境污染废水(13- - - - - -17]。的确,海岸附近的活动对贝类的质量产生重大影响(18]。沿海水域的污染会导致污染的双壳类软体动物(4),他们的消费(生的或未煮熟的)与人类病毒性疾病(19,20.]。重要的是,肠病毒通常是确定引起的肠道疾病暴发期间食用贝类满足细菌学的标准(16,21- - - - - -24]。
双壳类软体动物可以传播肠道疾病的主要向量(25甲型肝炎病毒(HAV)造成的),(26],诺瓦克病毒[27),E型肝炎病毒(HEV) (28),腺病毒、轮状病毒、肠道病毒和astrovirus [29日- - - - - -32]。这些病毒会导致肠胃炎和病毒性肝炎(33]。病毒性肝炎肠的起源是由甲肝病毒和戊肝病毒,两种病毒遇到传染病的,甚至是病态的,恶劣的卫生条件的国家(34]。
甲型肝炎是28 - 30 nm直径,nonenveloped 7.5 kb单链,线性,积极意义RNA病毒,属机密Hepatovirus在引起家庭(35]。这种病毒分为6个基因型(I-VI)的基因型》可以感染人类36]。甲型肝炎引起一种自限性疾病,无严重的并发症在大多数情况下,不会导致慢性感染或慢性肝脏感染。然而,重型肝炎和死亡已报告(37]。甲型肝炎全球存在,seroprevalence率取决于卫生条件(38]。在发展中国家(即。,Asia, Africa, Latin, and Central America), HAV infection is highly endemic, and infected people are often asymptomatic [36]。
戊肝病毒是无包膜,7.2 kb单链,积极意义RNA病毒属Orthohepevirus和Hepeviridae家庭(39- - - - - -41]。每年,全世界∼2000万人感染戊肝病毒(7,42),主要是在发展中国家(43]。戊肝病毒引起自限性急性肝炎;然而,肝外表现(神经和肾损害)和慢性感染,特别是在免疫功能低下的患者,器官移植受者,正在增加,因此代表了一个重要的临床问题42]。此外,孕妇可以开发暴发性肝衰竭,死亡率高达30% (44]。虽然戊肝病毒只有一个血清型,但它显示了伟大的遗传多样性与四个主要基因型(从1到4)Orthohepevirus一物种(39,40,45]。基因型1和2已经完全孤立在人类和主要在亚洲,非洲,中美洲(41,46,47]。他们主要涉及人类传染病由于消费HEV-contaminated水或食物在卫生条件较差的国家,39]。
摩洛哥实行了国家环境保护和可持续发展战略(48]。在这一战略的框架下,旱谷Cherrat是归类为一个优先级的生物和生态利益因其生态、社会和经济重要性和强大的压力由人类剥削导致重要的改变。在这个战略,保护计划已经到位陪这个网站发展的合理使用资源(包括贝类)和生态旅游49]。在这种背景下,本文提出了第一个环境和病毒学研究Cherrat河口(摩洛哥)Casa-Settat地区监控病毒污染的贻贝和每年的相关危险因素。
研究目标如下:(我)确定甲肝病毒和戊肝病毒污染率的贻贝收获不同站点Cherrat河口(2)研究季节性因素之间的相关性和贻贝甲肝病毒和戊肝病毒的污染速度
2。材料和方法
2.1。研究区域
Cherrat河口(49°33′52.71°N-7°07′23.33°W)位于摩洛哥大西洋沿岸的省苏莱曼(Casa-Settat地区),53公里以北卡萨布兰卡。之间的过渡区Cherrat海滩和旱谷Cherrat,生物和生态利益的网站(49]。海滩被列为A类沐浴水(50]:不到100/100毫升粪大肠杆菌群(大肠杆菌)和enterococci(粪链球菌),根据相关的国家标准(NM 03.7.200),转置欧洲指令(76/160 / EEC)和指令/环境规划署,适用于卫生监测海洋水洗澡。
这个区域的水质受到流域径流的影响,城市污水管理故障和溢出附近的排水系统。
贻贝收集四个地点(年代1,年代2,年代3,年代在Cherrat河口(图4)1):(我)年代1,年代2,位于正确的岩石边Cherrat河口(100米)的距离一步(2)年代3和年代4,位于落基左边Cherrat河口(100米)的距离一步
这些网站对应一个过度开发野生蚌收割面积。这些贻贝在本地出售在一个非正式的和当地居民的传统方式,没有任何卫生控制。
2.2。贻贝集合
自然增长的贻贝(Mytilus galloprovincialis)收集每月四个网站Cherrat河口在13个月的时间内(从2019年3月至2020年3月)。总共52个样品(n= 12贻贝收集/样本)。所有样品都运到实验室冷藏盒后24小时内收集。
2.3。样品处理和RNA提取
贻贝样品处理后,ISO / TS 15216 - 1:2017(微生物的食物chain-horizontal方法测定甲型肝炎和诺瓦克病毒使用实时RT-PCR-part 1:方法量化)协议甲肝病毒检测在食品样本。
贻贝是快速冲洗,低低地,解剖。肝胰腺切除,合并的最终的重量为每个样本(2±0.2)g。消化组织混合10μ门戈L (CeeramTOOLS®)作为核酸提取的控制。其次是与蛋白酶孵化K解决方案(2.0±0.2毫升)(37±1.0)°C用颤抖的在320 rpm(60±5)分钟消化的组织和第二个孵化(60±2.0)°C(15±1)分钟恒温水槽。然后,样本离心机在室温下(5.0±0.5)分钟,和上层清液收集在清洁管。
从500年病毒RNA提取μL的上层清液使用Nucleospin RNA病毒工具包(Macherey Nagel德国)根据制造商的指示和筛选了100年μL(洗脱缓冲。
2.4。rt - pcr分析
2.4.1。甲型肝炎病毒检测
卢娜®通用探针一步RT-qPCR工具包(新英格兰生物学实验室)是用于甲肝病毒和门戈MCO应变实时rt - pcr的检测。简单地说,4μL的RNA样品在21放大μL包含1 x反应混合的混合反应,10μL卢娜普遍调查的一步反应混合(2 x), 0.5 pmol /μ0.9 L的底漆,pmol /μ反向引物,0.25 L pmol /μ1.25 L的探针,μL(卢娜热启动®RT酶混合(20 x)。引物和探针和相应的引用表中列出1。
放大协议如下:逆转录反应10分钟55°C,在95°C初始变性1分钟,其次是45变性的周期在95°C 10 s,和扩展为1分钟60°C。
从每个样本中提取病毒RNA在重复使用4放大μL稀释10倍稀释样本评价抑制剂的存在,使用门戈分析根据制造商的指示,通过比较稀释,稀释的Ct值RNA样本。< 3.3 Ct值差异表明抑制剂的存在。
每次运行,门戈标准曲线生成使用10倍连续稀释。萃取效率是评价通过比较的Ct值门戈RNA从样本中提取标准曲线。结果≥1%被认为是有效的。样品被认为是积极的Ct值≤33时至少两个复制,没有证据显示放大的消极的控制。
RNA提取175年甲型肝炎HM应变作为积极的控制。两个消极的控制被包含在rt - PCR系列:消极控制PCR混合物提取和消极控制放大与PCR (nuclease-free水混合物)。
2.4.2。戊肝病毒检测
从Primerdesign genesig实时PCR检测工具™有限公司由oasig冻干一步RT-qPCR MasterMix用于戊肝病毒检测(基于ORF2衣壳蛋白基因的检测)。5μL的RNA样品在20放大μL包含1 x反应混合的混合反应,10μL (oasig™冻干一步2 x RT-qPCR大师混合,1μL(底漆/亨德拉病毒探针组合,1μL内部提取控制底漆/探针混合,和3μL核糖核酸酶/ DNase-free水。引物已经描述的制造商genesig®先进设备手册。放大协议如下:逆转录55°C 10分钟,酶激活在95°C 2分钟,其次是50周期放大与变性在95°C的10年代。
每个样本都在重复放大(稀释和1/10稀释)。两个消极的控制被包含在每个rt - PCR运行:消极控制PCR混合物提取和消极控制放大(核糖核酸酶/ DNase-free水用PCR混合物)。应该有一个积极的控制Cq 16 - 23之间。
五个标准(从2×104拷贝数/μ数字/ L 2副本μL)被稀释的积极准备控制(2×105拷贝数/μL)进行定量分析。没有PCR抑制剂进行了测试使用内部RNA提取RT-qPCR工具包的控制权。简单地说,4μ内部控制RNA提取L添加到每个RNA样本,和Ct值与Ct值的负面包含内部控制的控制。发现内部控制通过维克通道和Cq值28±3。
所有的rt - PCR测试来检测甲肝病毒和戊肝病毒进行一个AriaMx(安捷伦科技,圣克拉拉,CA) 96孔板实时PCR仪。Fluorogenic数据收集60°C 60年代通过厘清和维克频道,使用安捷伦咏叹调软件1.71 v。
2.5。统计分析
斯皮尔曼等级相关分析是用于关联的结果阳性样品池月和pluviometry。这些相关性进行累计前一个月的雨(从Bouregreg获得和Chaouia液压盆地机构)假设每个贻贝收获区域主要是受雨水影响前。所有统计分析使用统计软件包SPSS 17.0统计。统计学意义是由一个决定值< 0.05。
3所示。结果
在这项研究中,所有的样品提供有效的结果与可接受的萃取效率(> 10%)。戊肝病毒中没有检测到任何收集野生贻贝样品。52个样品分析中,24人HAV-positive (46.15%)。在网站甲肝病毒污染率最低年代1 (3/13;23.07%),而网站年代2,年代3,年代4(分别为46.15%、61.54%和53.85%)(表2)。
确切概率法显示,污染率显著差异在干旱时期(5月至9月)和多雨期(10月至4月)( )。之间有显著的正相关关系正样本的数量和平均降雨量是观察到的。
4所示。讨论
贝类积累人类病原体,如人类肠道病毒(例如,轮状病毒在贻贝(52,53),肠病毒(32,54),甲型肝炎病毒(26,55],诺瓦克病毒(27,56,57在牡蛎])。
在这项研究中,只有甲型肝炎,但不是戊肝病毒,在收集到的贻贝样品被发现。污染率的差异这四个网站可以解释他们的不同位置和电流或其他水文变量的影响。然而,需要更多的研究来测试这些假设。我们的结果与先前的研究协议(58- - - - - -60]报道甲型肝炎在贻贝收集当地市场,文化的农场,在环境监测。
甲肝病毒出现在贻贝Cherrat河口是由强烈的环境中的持久性病毒(61年)或连续供应的病毒从流域径流的旱谷Cherrat,城市污水,从污水系统故障,溢出,不符合标准(50]。这可以诱导扩散污染和影响河口环境中贻贝自然发展(62年]。
关于戊肝病毒,一些研究贝类没有检测戊肝病毒在贻贝在法国销售63年)、意大利(64年),丹麦,65年)和泰国(66年]。另一方面,一些研究报道在贻贝戊肝病毒存在自然野生地区种植和商用在苏格兰28)、西班牙(7,67年,68年),意大利(4,69年]。同样,有证据表明戊肝病毒循环在摩洛哥人口(70年]。没有检测Cherrat河口是由环境中的戊肝病毒颗粒排放的数量太低被发现或病毒可能很短的持久性在人类浪费。需要更多的人类排泄物持久性亨德拉病毒工作更好地评估这一点。
5。结论
我们的研究显示,甲型肝炎病毒污染率的贻贝Cherrat河口非常高,与季节性变化显著相关。因此,更新现有的立法,包括病毒危害监测双壳类软体动物收获地区主管部门是一个紧迫的问题。此外,非法收集贻贝从这个区域必须更好地控制由于对公共卫生的威胁引起的病毒污染的风险。监控肠病毒双壳类软体动物的存在可能导致病毒的预防食物中毒和促进公共健康。
数据可用性
支持本研究使用的数据都包含在这篇文章。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
作者要感谢病毒学、肿瘤学、和生物技术实验室团队成员在学院科学和技术,Mohammedia,哈桑二世大学卡萨布兰卡,卡萨布兰卡的区域研究和分析实验室的成员为他们所有的努力支持他们的所有阶段的工作研究。