文摘
犬腺病毒2型(CAV2)是一个与一个已知的非人类腺病毒感染人类和犬类细胞的能力。细胞表面受体参与CAV2转导仍然未知。开发增强识别这些将提供有价值的信息和更好地理解CAV2生物学基因传递的工具。CAV2错误分组与Ad5基于知识CAV2可能转换使用汽车。因此,我们评估CAV2 Ad5 (CAV2GFP Ad5G / L)感染模式在不同的狗和人类细胞系来确定不同的取向。我们的研究表明,CAV2能够成功Ad5不感染,感染细胞和CAV2感染不与汽车的表情。CAV2可以感染细胞或最小的表达较低的汽车。我们的数据表明,CAV2受体转导不依赖于汽车,因此,它是至关重要的发现小说CAV2受体。
1。介绍
Vector-mediated基因转移是一个基础生物医学技术,允许调查人员理解、分析和修改基因功能。有效的基因转移可能是由于使用的强大和高效的基因传递容器/向量。运载体是基因治疗的最常用的工具。
腺病毒(广告)nonenveloped二十面体病毒有12个顶点,由纤维蛋白锚定片通基础(1]。纤维和片通基地都参与病毒绑定和被细胞吸收。腺病毒转导细胞内是一个两步的过程(2]。在第一步中,纤维结合受体(s)来锚定病毒的细胞。广告从不同的腺病毒受体纤维包括柯萨奇病毒和腺病毒受体(CAR), CD46、唾液酸,CD80/86,硫酸乙酰肝素,MHC类α2域(1]。在第二步中,一种氨基酸基序,RGD, RGAD或IGDD [3]上片通基地介导病毒粒子进入细胞的内部化使用细胞表面蛋白(α β5,α β3,α β1,α5β1,α3β1)。
人类腺病毒Ad5-based向量是常用的不同,和他们的取向,交付机制,可以很容易地修改和转基因表达(4]。Ad5感染细胞使用汽车和细胞表面蛋白(α β5,α β3)或类我主要组织相容性复合体(mhc I) (5]。与更高的汽车使用Ad5向量时,细胞表达做出最好的目标,但目标细胞与边际汽车表达式需要更高剂量的广告载体,导致病毒毒性(6]。车是表示在许多细胞类型,但不善表达一些神经元亚型(7,8),成纤维细胞(9),巨噬细胞(10),淋巴细胞(11],ameloblast-like细胞[12),和高度恶性细胞,如卵巢癌、结肠癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、和膀胱癌11,13]。在某些情况下,汽车是细胞上表达,但转导效率很低由于缺乏细胞表面蛋白(α β5,α β3)[14,15]。额外的因素可能会限制Ad5转导细胞表面MUC1、屏蔽干扰感染的整合蛋白与病毒相互作用(16]。所有这些因素常常导致基因转移的失败,耦合,在活的有机体内病毒诱导毒性。
犬腺病毒2型(CAV2)是最良好的非人类腺病毒特征类似于Ad5 [17]。然而,三维结构的比较Ad5和CAV2显示明显的差异。CAV2衣壳比Ad5流畅的用更少的片通基地和六邻体的循环。片通基地的RGD循环Ad5参与病毒内化。CAV2片通没有守恒RGD, RGAD, IGDD或KTKK主题(5,18),可能不依赖于细胞表面蛋白内化。有趣的是,第九CAV2蛋白质的糖基不同于Ad5蛋白质第九,与一个状的投影伸出的衣壳19]。
CAV2不感染细胞表达MHC I,唾液酸,贫穷与CD40 /低交互,CD80、CD86和CD46 [2,5]。CAV2向量可以转换Ad5耐火材料细胞,神经元和卵巢癌等(20.,21]。CAV2向量可以接受逆行轴突运输,从而使他们好候选人转导神经元在特定的大脑区域,其他向量所不能达到的17,22,23]。重组Ad5向量编码绿色荧光蛋白,结合CAV2纤维旋钮(Ad5-CGW-CK2)增加神经传导和转基因表达8]。重组Ad5向量(Ad5Luc1-CK),编码荧光素酶基因和纤维旋钮从CAV2领域,增强基因传递CAR-deficient RD,赵,U118MG,嘿,ov - 3,和OV-4细胞,高达30倍5]。CAV2能传感细胞使用重组人或鼠汽车;然而,CAV2也可以转换CAR-deficient细胞(5,18]。感染通过重组Ad5 CAV2旋钮在汽车负,α
β5,α β3整合素阳性,CHO细胞表明CAV2绑定到细胞不依赖于汽车,CAV2可以使用另一个受体。此外,CAV2-based向量可以绑定(24),但不影响汽车负,α
β5,α β3整合素阳性CHO细胞,使其有可能CAV2内化发生通过coreceptor不同α β5,α β3整合蛋白(5]。
为了更好地理解CAV2取向,必须调查CAV2绑定和感染更多种类的细胞。虽然CAV2取向已经研究了一个有限的人类和老鼠的学位(18),它没有被广泛推行犬细胞,它提供了最好的系统理解自然CAV2取向。在本文中,我们报告的感染模式CAV2并使用replication-incompetent Ad5向量表达绿色荧光蛋白(GFP)。感染人类和犬类细胞系被用来直接比较两个腺病毒的取向。CAV2感染模式也比汽车目标细胞的表达水平。
2。材料和方法
2.1。细胞培养
犬乳腺肿瘤细胞株CMT12,组织细胞的细胞系DH82,胚胎肾细胞系FDK MDCK,黑素瘤细胞系CML7 CML10,和骨肉瘤细胞株D17 CF11在DMEM培养(杜尔贝科修改鹰的媒介,康宁公司)与青霉素(100国际单位/毫升,康宁),链霉素(100μg / ml,康宁公司)、两性霉素B (0.5μg / ml,康宁公司),和10%的边后卫(胎牛血清,σ)15]。犬淋巴瘤细胞株17 - 71和OSW和肥大细胞行MPT1培养RPMI(罗斯威尔公园纪念研究所中,康宁)和青霉素(100国际单位/毫升,康宁),链霉素(100μg / ml,康宁公司)、两性霉素B (0.5μg / ml,康宁公司),和10%的边后卫(σ)。
2.2。病毒感染
CAVGFP病毒向量编码绿色荧光蛋白(绿色荧光蛋白)的控制下巨细胞病毒(CMV)即早期催化剂(雷蒙而言Alemany博士的礼物,巴塞罗那,西班牙)和Ad5G / L病毒载体,其中荧光(绿色荧光蛋白)和荧光素酶的控制下巨细胞病毒(CMV)即早期催化剂(大卫·t·克里尔博士的礼物,圣路易斯,密苏里州)被用于感染。CAVGFP Ad5G / L病毒载体被放大并使用中海梯度和脱盐纯化PD-10脱盐列(通用电气医疗集团)25]。病毒粒子数量测量通过测量OD260使用NanoDrop(热)使用以下公式:粒子/毫升= (OD260)×(稀释系数)×(1.1×1012)[14]。病毒感染了100感染的多样性(MOI;100病毒粒子/单元)。2.5×105MDCK细胞CMT12、DH82 FDK, CML7, CML10,镀D17, CF11 12-well盘子一天前病毒感染。2.5×10517 - 71细胞,OSW MPT1细胞系是镀在同一天的感染。细胞被洗1 x PBS(磷酸缓冲盐)和感染了200人μl DMEM / RPMI的边后卫(2%),包含病毒。一小时后感染,400μl DMEM / RPMI(10%的边后卫)添加到细胞中。绿色荧光细胞在48小时监控postinfection用倒置荧光显微镜(evo FL细胞成像系统)。感染都是一式三份。
2.3。流式细胞术
所有贴壁细胞和1 x PBS收获,洗两次。所有的细胞被resuspended流洗缓冲区(1 xpbs + 0.1% BSA;牛血清白蛋白+ EDTA)为GFP的表达和分析流式细胞术(CytoFLEX LX;贝克曼库尔特和LSR-II;BD生物科学)。所有的实验都在一式三份。
2.4。RNA分离、引物设计、定量rt - pcr
融合细胞培养成长为75 - 80%,使用试剂盒和总RNA分离试剂(生命技术)根据制造商的指示。核糖核酸的浓度是由吸光度在260海里。狗和人类守恒的车(基因库加入# NM_001195845.3) (CXADR_C-H_For: CCAGAAGTTTGAGTATCACTACTC;CXADR_C-H_Rev: GATGCATCACCAGATTTGAGATC)和beta-actin (ACTB_C-H_For: GACTACCTCATGAAGATCCTCAC;ACTB_C-H_Rev: TGATGGAGTTGAAGGTAGTTTC)互补脱氧核糖核酸合成和放大进行定量逆转录酶聚合酶链反应(Q-RT-PCR)使用特定的引物。所有qPCR反应在95°C 3分钟,然后40 95°C的周期为30秒和57°C,持续30秒。反应的特异性被融化曲线分析验证。Q-RT-PCR执行使用Bio-Rad iCycler智商多色实时PCR检测系统,并进行了化验使用SsoFast EvaGreen qPCR supermix (Biorad)。PCR产物纯化使用GeneJet凝胶萃取设备(热)根据制造商的指示,和身份证实了测序的扩增子(欧陆坊MWG操纵子)。
比较ΔΔCt mRNA表达分析的方法。每个样本的计算是通过规范ΔCt值beta-actin标准化控制。ΔΔCt值计算使用的均值ΔCt值的样本作为参考控制(26]。最后,每个样本的相对折叠车表达式使用公式计算−2−(∆∆Ct)。
2.5。统计分析
简单线性回归分析在95%置信水平分析的功能关系传染性犬腺病毒2型GFP和人类腺病毒血清型5 g / L由细胞表达绿色荧光蛋白的百分比的流式细胞术相比的相对表达水平的汽车通过各种犬类和人类细胞系。
3所示。结果
3.1。CAVGFP Ad5GL病毒感染
CAV2的感染模式,分析了Ad5使用replication-incompetent向量表达绿色荧光蛋白(GFP), CAVGFP,分别和Ad5G / L。在这两种病毒,GFP表达巨细胞病毒(CMV)启动子的控制下;因此,它将显示类似的启动子转导后活动水平。狗和人类细胞系(表1)感染了CAVGFP Ad5G / L 100莫伊。100我被选为平均病毒感染剂量,确保GFP +细胞将包含大约只有一个病毒。莫伊可能导致较高的感染多种病毒感染细胞,病毒感染并不是线性的。细胞是由荧光显微镜和流式细胞仪(检查数据1- - - - - -4;表1)来确定细胞表达GFP报告基因的数量。的GFP荧光水平CAVGFP nontransduced相比,Ad5G / L-infected细胞细胞。在犬感染模式粘附细胞行(MDCK FDK, CMT12, CML7, CML10, CF11, D17,和DH82) CAVGFP和Ad5G / L感染之间是不同的。所有信徒犬细胞系表达绿色荧光48小时post-CAVGFP感染(数字1(一),1 (b),2(一个),2 (b)在不同的水平)。比例的人口感染范围从最高(MDCK;85.7%)到最低(CMT12;4.34%)postinfections(表1)。
(一)
(b)
(c)
(一)
(b)
(c)
所有的细胞系,当感染Ad5G / L,表达GFP的表达在细胞的比例较低(4.22%;CML10 1.11%;CMT12)除了CF11(45.20%)和D17 (50.60%)。更CF11 D17 Ad5G / L感染后细胞表达绿色荧光蛋白相比CAVGFP感染(CF11;35.90%,D17;45.0%)(表1;图2 (b))。
不依从犬细胞株MPT1感染模式,17 - 71,OSW CAVGFP之间也是不同的,Ad5G / L-infected细胞(图1 (c))。尽管CAVGFP可以感染所有三个细胞系(MPT1)从44.0%到3.70% (OSW) Ad5G / L显示感染细胞的百分比很低(OSW;0.22%,17 - 71;0.89%,MPT1;0.23%)(表1;图2 (c))。
CAVGFP和Ad5G / L的感染模式在人类细胞系(数据也不同3和4;表1)。CAVGFP差感染大多数人类细胞系除了SKOV3 (10.90%)。同样,只有HepG2 Ad5G / L(31.50%)被感染,和其余的人类细胞系感染很差。
CAVGFP和Ad5G / L没有或缺乏感染曹K1细胞(表1;数据3和4)。
3.2。汽车mRNA的相对量化
为了更好地理解CAV2感染机制及其独立的汽车受体信使rna表达的车比较在不同的细胞类型使用Q-RT-PCRΔΔCt方法。汽车mRNA表达几乎所有的细胞进行测试;然而,表达水平不同(图5)。CMT12,犬细胞株FDK D17, MPT1, DH82表示汽车在中度到高的水平。CF11,犬细胞株MDCK CML7 CML10 OSW, 17 - 71表达水平低到几乎不可测的车。人类细胞系生物、SKOV3和LS174显示汽车mRNA表达相对较低而HepG2显示适度的表达式。
以确定是否感染CAV2和Ad5统计与汽车mRNA的表达,一个简单的线性回归分析。CAV2和Ad5没有之间的统计相关性感染的莫伊100车(CAV2和表达值:0.2924;Ad5值:0.7223)。
4所示。讨论
运载体与大包装能力优秀的基因治疗工具,功能滴度高。广告向量是重要的治疗范围广泛的细胞和组织,包括postmitotic细胞,如神经细胞,因此这样是独一无二的(27]。他们可以用作replication-deficient向量,有条件地复制的向量,有条件地目标向量,表达外国抗原和疫苗和基因治疗通过改变一个特定的基因。然而,他们的使用是有限的情况下,与广告感染和缺乏受体细胞是耐火材料,需要绑定向量或内化。Ad-specific细胞表面受体的表达模式取向决定了病毒,因此,可以使用特定的向量转换特定的细胞类型。重要的是识别受体存在于广告耐火材料细胞,利用这些信息来扩大广告矢量取向纤维通过引入相应的绑定主题广告,六邻体,或片通基础生成增强和更有效的广告媒介。
为了充分利用CAV2取向,必须定义其机制。CAV2向量可以转换车低/ -细胞(5],CAV2转导可能增广乘汽车,它是汽车独立18]。缺乏一个RGD域和转导的细胞阻塞αv整合蛋白表明CAV2不利用规范内化途径和内部化使用不同的受体(18]。为了更好地理解CAV2取向,我们分析了感染CAV2模式并使用replication-incompetent Ad5向量表达绿色荧光蛋白(GFP) CAVGFP Ad5GFP,分别。
生成的从我们的实验结果证实,CAV2可能感染细胞表达水平,独立的和CAV2感染Ad5显著不同的模式(数据1- - - - - -4)。CAV2能够感染犬细胞Ad5耐火材料,如FDK MDCK, CML10, OSW, 1771年,MPT1。相比之下,犬骨肉瘤细胞系(CF11和D17)比CAV2感染Ad5更好。在有限数量的人类细胞系测试,对Ad5 CAV2没有展示任何的优势,除了感染水平适度增加卵巢癌细胞系SKOV3。
基于这些发现,汽车在这些细胞计算表达式的值。汽车受体蛋白质表达无法评估犬细胞系由于缺少适当的验证可交叉反应的抗体。因此,我们使用定量rt - pcr检测汽车mRNA表达水平。我们的研究结果证实,许多细胞的转导CAV2较低或最小的汽车表达式,如犬行MDCK CML7 CML10 OSW, 17 - 71和人类SKOV3细胞线。Ad5感染是阻碍由于低水平的汽车表达的许多细胞系测试(MDCK、CML10 OSW, 17 - 71, SKOV3,生物,LS174,和LS180)。CAV2转导细胞(MDCK、CML7 CML10, OSW, 17 - 71,和SKOV3)较低或没有汽车表达式和Ad5无法感染同一细胞表明,作为一种替代方法,未知的受体(国关)是利用CAV2附件细胞。
然而,FDK CMT12、DH82 MPT1连同更高水平更高级别的车在这些细胞相比Ad5 CAV2感染。这种现象可以解释为两个假设。首先,尽管表达汽车,这些细胞不能感染Ad5由于低水平的αν整合蛋白(15]。第二,这些细胞表达小说CAV2受体以及汽车,和这个受体负责感染。另外,汽车可以使用另一个受体缺乏公认的CAV2受体在这些细胞。
CMT12适度汽车表达式和低感染率CAV2和Ad5。根据我们的工作假说,这可以解释为缺乏CAV2受体和所需的整合蛋白Ad5内化。在对比,CF11水平较低的车,但高水平的感染感染CAV2 Ad5和温和的水平,表明较低的表达需要汽车Ad5感染。
D17 HepG2显示,汽车表达水平和高Ad5传导率,预计,根据Ad5-CAR依赖。生物、LS174和LS 180汽车水平较低,因此,低水平的Ad5感染。低水平的细胞系CAV2感染可能也有低水平的CAV2国关,因此不是由CAV2转导。
CAV2感染OSW, 17 - 71, MPT1(数字2和3)。所有这些细胞系不表达整合蛋白(15]。CAV2感染的能力,这些细胞在缺乏整合蛋白和汽车(osw - 17 - 71)和缺乏RGD域CAV2衣壳强烈建议CAV2转导并不依赖于汽车和整合蛋白。
我们的结果表明,CAV2转导不依赖于和不相关汽车表达式在狗和人类细胞系。统计分析证实,汽车的表达并不是与CAVGFP传导有关。因此,本手稿中的数据表明CAV2使用受体或受体除了Ad5受体汽车和整合蛋白附着并内化到靶细胞。
CAV2的人类细胞转导多种独立的汽车和细胞表面整合素表达使它一个主要候选人的探索小说宿主细胞表面受体。CAV2纤维绑定的识别受体(s)和coreceptors病毒衣壳上的网站负责绑定到这些受体将允许这些交互被利用来提高基于广告基因转移载体。这些小说受体的发现将解决当前基因转移技术的差距和有助于发展中增强广告向量比目前治疗更多的疾病。
5。结论
CAV2转导细胞不依赖于汽车。CAV2受体(s)和对应的衣壳组件(s)负责病毒附件和内化,还未知。据我们所知,这是第一个报告演示CAV2感染各种犬的细胞系。我们建议CAV2比Ad5取向是不同的,它是必要的去探索在未来更好的基因治疗。
数据可用性
所有的数据和材料,支持本研究的结果都包含在这个手稿。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
麦迪逊d .印第安人草屋,p . Kretzschmar,特里萨·希金斯的贡献同样这项工作。
确认
这个项目由奥本大学校内的赠款项目。