体外比较内部核糖体进入位点的活动从啮齿动物Hepacivirus和Pegivirus Pseudoparticles建设

文摘

(5′UTR) 5′端非翻译区的啮齿动物hepacivirus (RHV)和pegivirus (RPgV)包含序列同源性丙肝病毒类型III内部核糖体进入位点(IRES)。利用monocistronic表达载体的RNA聚合酶转录启动子驱动,我们展示特异性IRES翻译和地区内IRES所需的全部功能。关注RHV,我们进一步与RHV准型慢病毒,显示细胞表面表达的膜蛋白和小鼠肝细胞的转导我们然后构建完整的RHV RPgV经由与报告基因。使用复制子体系,我们表明,RHV NS3-4A蛋白酶裂解线粒体抗病毒信号蛋白的记者。然而,liver-derived细胞不容易支持完整的病毒生命周期。

1。介绍

丙型肝炎病毒(HCV)感染全世界超过7100万人(1),可导致肝功能衰竭和肝细胞癌和提供了一个主要的全球卫生负担。同时引入新的直接的抗病毒药物(DAAs)改善了治疗反应率和预示着治疗丙肝的新时代2),按实际使用量付费的成本和可用性以及耐药和慢性/不可逆的肝损伤由于后期出现症状和延迟治疗的丙肝病毒感染后仍然是一个问题(3]。丙肝病毒的小动物模型将允许测试的疫苗有可能解决这些问题。

丙肝病毒被发现在20年前人类4),但很长一段时间,研究人员未能识别动物病毒同系物。这一切都改变了使用高通量测序深处,阐明了该病毒的进化起源。第一丙肝病毒同系物在2011年被发现在狗5),是紧接着同系物的发现在啮齿动物6,7,马8,9),灵长类动物(10,牛11,12),然后,第一个相同的物种,鲨鱼(13]。

啮齿动物丙肝病毒同系化合物被称为啮齿动物hepaciviruses (RHV),首次发现在鹿鼠(拉布拉多白足鼠),一个物种携带汉坦病毒,沙漠woodrats (Neotoma 5种),有刺的口袋里老鼠(Chaetodipus hispidus)[7]。同年RHV欧洲银行中描述田鼠(myod glareolus)和南非four-striped老鼠(Rhabdomys pumilio)[6]。这是一个成功的发现RHV从挪威大鼠(鼠形)在纽约14]。

后来发现RHV (RHV-rn1)从挪威大鼠被用于制造一个小hepaciviral感染动物模型,利用反向遗传学的方法。在此系统中,研究人员发现其hepatotropic复制近交远系繁殖和老鼠菌株(15]。模拟丙肝病毒感染,他们也显示,持续感染导致渐进的肝损伤和丙肝病毒的抗病毒药物sofosbuvir RHV-rn1抑制复制。该模型可用于研究HCV持久性机制,免疫和发病机理。

RHV-rn1尽管老鼠一般的主机,它也表明,这种病毒能够建立一个持续感染免疫力低下小鼠缺乏I型干扰素和适应性免疫16]。然而,在几周内清除病毒免疫活性的老鼠。因为这只老鼠模型结果在急性感染,一个完全免疫活性的慢性感染的小鼠模型和下游可以建立肝损伤仍然是需要的。此外,基因敲除小鼠的可用性将援助丙肝病毒相关的肝损伤的发病机制的研究。

虽然这些研究可能导致未来的疫苗,也存在人畜共患丙肝病毒感染人类来源的可能性(17]。RHV的基因组编码的多蛋白将被裂解成10蛋白质,与丙肝病毒,但显示了66 - 77%的氨基酸差异的丙肝病毒结构基因(7,18];因此,病毒之间的取向和致病性也可能不同。特别是5′非翻译区(utr) RHV丙肝病毒高度发散从相应的地区,有一个大区别不同的啮齿动物演化支(RHV, RHV1, RHV2、RHV3 RHV-rn1)。

mir - 122的高级表达肝细胞允许丙肝病毒,包含两个mir - 122 5′UTR目标序列,复制和丙肝病毒hepatotropism原因之一(19]。同样,RHV (NC_021153)发现mir - 122等鹿鼠包含一个目标序列的5′UTR [7]表明肝细胞特异性和进一步有200元没有同源序列其他hepaciviruses 5′utr。RHV-1 (KC411777)) 5′UTR包含结构元素的典型pegi和HCV-like忿怒和包含一个mir - 122目标区域,而RHV-1和RHV-2 (KC411784)在结构上是相同的,只包含几个核苷酸交往,与RHV-3 (KC411807)和RHV-rn1更类似于典型HCV-like IRES结构(6,15)(图1)。

随着RHV,啮齿动物pegivirus (RPgV)也发现white-throated木头老鼠(Neotoma albigula)[7]。Pegiviruses家族是一个新的属黄病毒,包括人类GBV-A GBV-C / HGV / HPgV-1 GBV-D和HPgV-2病毒。这些pegiviruses被认为是不致病的,对于HPgV甚至被报道是有益与艾滋病毒合并感染或埃博拉病毒20.- - - - - -22]。然而,有两个pegiviruses马发现的。第一,泰勒变异病毒(TDAV),怀疑是病原体的急性肝脏疾病的爆发发生在一个马场(23]。第二,马pegivirus (EPgV),就像人类pegiviruses,被认为是不致病的(24]。

病毒RNA结构扮演重要角色在翻译和复制。具体来说,包含IRES的5′UTR cap-independent的方式促进蛋白质合成的起始。IRES的序列和结构不同,这些差异有助于取向;本研究的重点是评估这些差异在5′utr RHV和RPgV影响翻译和建立反向遗传学系统利用RNA聚合酶启动子和终结者在DNA转染系统(25,26)以允许快速和容易的突变和筛选。

2。材料和方法

细胞。Hepa1-6写明ATCC®(crl - 1830™), mef IRF3^{- / -}写明ATCC®, NIH 3 t3 (crl - 1658™), BHK-21(写明ATCC®CCL-10™), HEK 293 t(写明ATCC®crl - 11268™),嗯- 7.5 - rfp -小牛从查尔斯M大米博士HepG2写明ATCC®(hb - 8065™)和维洛细胞(写明ATCC®ccl - 81™)分部在DMEM培养(Sigma-Aldrich) penicillin-streptomycin的边后卫10%和1%。质粒构建。Monocistronic记者质粒含有病毒5′UTR pUC19构造。首先,pUC19消化EcoR1和HIndIII(内),然后最小RNA聚合酶(RNA聚合酶I)启动子和《终结者》(由捻合成生物科学)插入到消化在融合质粒的克隆(豆类Bio);这个质粒被任命为波里(图S1A)。质粒的波里与PpuMI线性化。病毒5′和3”UTR(由捻合成生物科学)(HCV IRES取自pFR_HCV_xb (Addgene))沿着mCitrine被克隆到线性波里通过在融合克隆(豆类Bio)(图印地)。删除和添加monocistronic记者质粒是由PCR和在融合克隆(豆类生物)。质粒含有病毒结构基因被克隆在融合建于pUC19(豆类Bio)使用hepacivirus CE1E2地区通过扭转生物科学(合成),以及一个CMV启动子和使用BGH聚(图就是S1C)。国旗标签和原癌基因标记序列插入到这个质粒PCR和在融合克隆(豆类Bio);这个质粒被任命为电脑^MycE1E2^国旗。衣壳基因从电脑中删除^MycE1E2^国旗通过PCR和在融合克隆质粒pE1E2(豆类Bio)产生的^国旗。构建质粒含有长篇RHV1 RPgV病毒基因组,各自monocistronic向量(pOLI.IRES.Cirtine) PCR线性化和基因片段,1.5 - 2 kb(由捻合成生物科学),覆盖全身的病毒编码区被克隆在通过在融合克隆(豆类Bio)取代mCitrine。质粒被命名为波里。RHV1和波里。RPGV(图S1D)。构建质粒,记者mScarlet-BSD(由捻合成生物科学)被克隆到质粒含有完整的病毒之间NS5A NS5B,同时复制的乳沟序列在融合克隆(豆类生物)。这些质粒pOLI.RHV1命名。某人和pOLI.RPgV。某人(图S1E)。转染。转染都使用Lipofectamine®肝与加上™试剂(热费希尔科学)Opti-MEM (Gibco)根据制造商的规格。免疫印迹。细胞细胞溶解在缓冲区里帕(150 mm氯化钠,50毫米三羟甲基氨基甲烷/盐酸液pH值7.6,1%诺乃清洁剂P40、0.5%钠脱氧胆酸盐,和5毫米EDTA)补充完整™蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏)15分钟在冰上。溶菌产物是运行在12% sds - page和转移到PVDF膜(Bio-Rad)。膜在PBS孵化1小时5%脱脂奶粉,然后沾随后初级和二级抗体1小时在PBS 1%脱脂奶粉。Immunocomplexes检测使用一个奥德赛®Fc成像系统(LI-COR生物科学)。细胞免疫荧光。细胞生长在玻璃盖玻片,用PBS之前固定在甲醛(3.7% 在PBS)在室温下10分钟,permeabilized 5分钟与PBS Triton x - 100 0.1%,和阻止3% BSA在PBS 30分钟。主要和次要包含1% BSA抗体在PBS稀释,和细胞与主要抗体染色1小时,洗3 x与PBS,然后用二次抗体染色1小时,其次是染色为0.1µ在PBS g / ml DAPI延长5分钟和应用的黄金不变色试剂(表达载体)。细胞外。细胞生长在玻璃盖玻片,孵化与PBS含有4%的边后卫(胎牛血清)30分钟。初级和二级抗体在PBS稀释包含4%的边后卫,细胞染色主要抗体1小时,洗3 x与PBS,然后用二次抗体染色1小时。细胞被沾染了麦胚凝集素,Alexa萤石™594共轭按照生产厂家的协议。细胞被固定在甲醛在PBS 3.7% (w / v) 10分钟在室温下,permeabilized 5分钟与PBS Triton x - 100 0.1%, 0.1和染色µ在PBS g / ml DAPI 5分钟紧随其后的应用延长黄金不变色试剂(表达载体)。使用共焦显微镜图像获得(徕卡指定类型)和ImageJ Z-stacks和分析。抗体。老鼠anti-DYKDDDDK(克隆L5, Biolegend),鼠标anti-c-myc(克隆9 e11, Biolegend),鼠标反β肌动蛋白(克隆2 f1 1, Biolegend),鼠标J2 anti-dsRNA IgG2a (Sciscons),山羊anti-rat免疫球蛋白(H + L) Alexa萤石488(表达载体),IRDye®800 cw山羊anti-rat免疫球蛋白,和IRDye®680驴anti-mouse免疫球蛋白(LI-COR生物科学)。流式细胞术。单个细胞悬浮液生成和保存在流式细胞仪缓冲区(2% FCS, 5毫米EDTA在PBS)。细胞分析使用一个不负责任的人流式细胞分析仪(贝克曼库尔特)和FlowJo软件和封闭的可行的细胞使用现场/死亡可以解决的近红外线死细胞染色工具包(表达载体)。慢病毒。盘子被播种在DMEM HEK 293 t和3% FCS然后转染pLKO-gfp (Addgene) pCMV∆R8.2 (Addgene),要么pMD2。G (Addgene)或pE1E2比1:1:0.1,分别使用lipofectamine LTK(热费希尔科学)和Opti-mem (Gibco)。在转染后6小时,媒体所取代,72 h转染后,上层的收获,通过0.45µm过滤器。

2.1。RNA结构预测

RNA序列二级结构预测RNA折叠和可视化进行了使用武力有向图布局(Forna);两者都是托管在ViennaRNA Web服务(http://rna.tbi.univie.ac.at/forna/)。

2.2。RNA提取和互补脱氧核糖核酸的一代

细胞从24-well板洗在PBS和resuspended试剂盒(美国Sigma-Aldrich)和RNA被异丙醇沉淀分离,用70%乙醇洗净,resuspended DEPC-water。RNA是DNAse治疗(表达载体,佩斯利,英国),并使用100 ng纯化RNA进行rt - pcr。rt - pcr,高容量应用生物系统的互补脱氧核糖核酸档案箱(ABI棱镜,沃灵顿、英国)是根据制造商的规格使用。

2.3。定量实时PCR为选定的基因

定量实时PCR进行使用光周期计480实时PCR系统(罗氏诊断)和480年LightCycler探测器主反应(罗氏诊断)混合后,制造商的协议。LightCycler 480执行数据分析软件(罗氏诊断)。寡核苷酸序列相应用作定量实时PCR引物和探针设计根据普遍调查的指导图书馆从罗氏应用科学。热循环始于HotStarTaq激活在10分钟95°C。此后,45构成的放大的周期运行10 s在95°C, 30年代60°C, 20年代的72°C。消极的控制只包含试剂和系列稀释cDNA是包含在每次运行。每个样品测量一式三份,所使用的平均浓度。LightCycler分析,表达的次黄嘌呤phosphoribosyltransferase基因(产生HPRT)是用于规范化。样品的相对表达比较循环阈值计算的方法(ΔΔCT),然后设置样品与HCV IRES转染作为基准。

资源库加入数字。NC_021153 RHV (Hepacivirus E);KC411777 RHV1 (Hepacivirus J);KC411784 RHV2 (Hepacivirus F);KC411807 RHV3 (Hepacivirus I);KX905133.1 RHV-rn1 (Hepacivirus G);RPgV NC_021154。

3所示。结果

3.1。RHV和RPgV ires在啮齿动物细胞功能

测试病毒IRES推动翻译,monocistronic质粒载体构建包含最小的RNA聚合酶启动子在前面的全身病毒5′UTR后跟一个荧光制造商,病毒3′UTR, RNA聚合酶I终结者(图2(a))。HCV IRES是作为一个积极的控制以及控制质粒含有炒病毒5′UTR序列。包含RHV我们构建质粒,RHV1、RHV2 RHV3, RHV-rn1, RPgV 5′UTR从以前公布的序列。

这些质粒转染小鼠肝细胞细胞系Hepa1-6,丙肝病毒和RPgV IRES驾驶最高水平的翻译在转染后72小时平均荧光强度(MFI),其次是RHV1和RHV2 MFI的22日和14日,分别。RHV3和RHV-rn1 IRES翻译水平仅略高于背景和RHV不是功能在Hepa1-6(图2(b))。进一步评估的RNA转录水平mCitrine在细胞内,我们的存在对转染细胞。没有统计丙肝病毒之间的转录水平的差异,RHV, RHV1, RHV2, RHV3, RHV-rn1 RPgV,控制质粒含有炒病毒5′UTR序列。其他控制质粒包含RHV1 5′UTR但没有波尔我启动子并产生容易检测水平的RNA(图S2)。

进一步评估IRES功能在小鼠细胞中,我们测试了两个小鼠胚胎成纤维细胞细胞系,mef和NIH 3 t3。转染质粒的mef显示RHV1开车的最高水平的翻译的MFI 9 RHV2紧随其后的MFI 5(图3 (c))。丙肝病毒、RHV RHv3、RHV-rn1 RPgV仅略高于负控制生成的信号。在NIH3T3 RPgV开翻译的最高水平的MFI 17其次是丙肝病毒的MFI 7;,RH1 RHV2功能,但在低水平,和RHV RHV3, RHV-rn1没有功能(图3 (d))。

病毒源自不同的啮齿动物;因此,小仓鼠肾细胞系测试来评估如果ires功能在这个细胞系。与前面的细胞系,RPgV IRES推动高水平的翻译;RHV1和RHV2能够推动高水平其次是丙肝病毒;RHV, RHV3, RHV-rn1没有功能(图2(e))。

3.2。RHV和RPgV ires显示不同的功能在人类细胞系

在人类肝细胞细胞系,表达高水平的mir122 Huh7.5, RPgV IRES驱动最高水平的翻译丙肝病毒和RHV2紧随其后。RHV-rn1开车低水平的翻译,与小鼠细胞一样,RHV RHV3并没有带来任何信号(图2(f))。另一个人类肝细胞细胞系,HepG2不表达mir122,也用来测试IRES的功能:在这些细胞,其次是RPgV和RHV2丙肝病毒把最高水平,而从RHV表达式,RHV1, RHV3或RHV-rn1背景水平(图2(g))。

调查如果ires nonhepatocyte细胞功能,我们使用HEK 293 t和州立细胞系。HEK 293 t, HCV IRES显示最高水平的翻译RPgV IRES和RHV2紧随其后,而RHV, RHV1, RHV3, RHV-rn1(图的最低水平2(h))。在维洛细胞,RPgV产生高水平的翻译,对丙肝病毒的两倍;RHV2是唯一的其他IRES在这些细胞功能虽然在一个非常低的水平相比RPgV(图2(我))。

3.3。删除废除RHV1和RPgV IRES的功能

进一步评估RHV1 IRES的结构性需求的完整功能,我们制作了几种不同的结构。第一个包含一个额外的20个核苷酸的病毒序列起始密码子的下游。转染到Hepa1-6细胞时,这种构造并没有导致不同水平的翻译相比,构造包含5′UTR。两个删除构造;在RHVΔI, 5′三杆循环(Ia / b / c)被删除(图3(一个))。这个删除IRES功能下降了90%。Va、Vb茎环从RHV1ΔII删除,再次导致功能下降了90%小鼠肝细胞细胞系Hepa1-6(图3 (c))。

RPgV IRES,我们还增加了一个额外的20个核苷酸的病毒序列的下游起始密码子。这没有影响翻译的水平相比,构造包含5′UTR。进一步评估驾驶所需的顺序翻译,三个构念是用删除,RPgVΔI和RPgVΔII删除IRES的5′RPgVΔI有前两个茎环(Ia / b)和RPgVΔII三杆循环删除(Ia / b和2)(图3 (b))。RPgVΔIII茎环有两个内部删除(IIId / e)。5′删除RPGV没有影响翻译的水平。然而,内部删除RPgVΔIII导致减少53%(图的翻译3 (d))。

3.4。表达E1E2

先前的研究检查丙肝病毒E1和E2的亚细胞定位用细胞转染质粒表达E1和E2蛋白(27]。这些研究得出结论,丙肝病毒结构蛋白表达在细胞表面,基于免疫荧光检测。为了检查RHV的定位结构蛋白表达系统,我们克隆的结构区域(capsid-E1-E2) RHV包含CMV启动子的质粒;然后我们原癌基因标记添加到5′末端的衣壳蛋白和旗帜的5′末端标记后的E2蛋白E1E2乳沟序列(图4(一))。

HEK与向量pE1E2转染293 t细胞^国旗或电脑^MycE1E2^国旗sds - page和48小时后细胞溶解。E2蛋白中检测出细胞转染和表达载体使用anti-Flag标记抗体(图4(一)),衣壳中检测出细胞转染的电脑^MycE1E2^国旗使用一个anti-c-Myc抗体表达载体。蛋白质检测是预测的大小,表明转译后的乳沟是完整的。

为了确定RHV糖蛋白表达从这些向量也表现出一个细胞内colocalization,我们检查了转染细胞的免疫荧光衣壳和E2的表情;都证明colocalize(图4 (b))。我们也评估如果包膜蛋白表达在细胞表面。染色与anti-flag抗体检测E2确实显示点状的细胞膜染色,当结合麦芽凝集素染色细胞膜,它显示colocalization标记抗体(图4 (c))。这表明surface-expressed E2的比例。

来确定surface-localized E1E2可以调解的病毒进入,我们生产绿色荧光蛋白编码慢病毒载体与RHV准型,RHV1, RHV2,和RHV3 E1E2蛋白质,使转染HEK 293 t细胞与pE1E2慢病毒骨干和包装质粒,和72 h后收集和过滤上清液。然后我们测试如果E1E2-pseudotyped entry-competent慢病毒载体。上层清液从cotransfected细胞应用于Hepa1-6细胞,GFP记者表达72 h后化验。RHV1 E1E2-pseudotyped慢病毒载体催生了少量的GFP阳性细胞,相比VSVG准型慢病毒。慢病毒载体与RHV准型,RHV2, RHV3或缺乏包膜糖蛋白未能产生任何GFP阳性细胞(图4 (d))。这表明只有RHV1准型慢病毒载体可以调解病毒进入Hepa1-6细胞导致记者基因表达。这些数据还表明,surface-expressed RHV1 E1E2形成功能。

4所示。讨论

五个啮齿动物hepacivirus ires我们测试显示不同级别的驱动能力翻译使用monocistronic向量在不同的细胞系。而使用monocistronic向量,利用RNA聚合酶I,避免潜在的readthrough相比bicistronic向量;它的缺点是我们不能直接比较细胞由于他们之间表达水平差异对转染的易感性。然而,RHV、RHV3 RHV-rn1 ires要么没有功能或开车表达式在非常低的水平。这是作为一个惊喜RHV-rn1病毒已经复制在小鼠和大鼠。

RHV1和RHV2推动高水平的翻译在小鼠肝细胞,mef和BHK-21细胞。在人类肝细胞,RHV2 IRES优于RHV1的兴趣,因为他们是相似的序列,因此可能会有一个类似的结构。RHV1的情况,删除预测初始三杆循环废除IRES函数,说明完整的5′UTR序列需要保持高水平的表达。也不像丙肝病毒,之前的研究表明,将夫人nt的核心蛋白质编码序列是必不可少的一个有效IRES活动(28),额外的核苷酸RHV1没有增加核心蛋白的转录水平。

RPgV 5′UTR几乎没有显著的相似性与任何已知pegivirus但是推动高水平的表达在所有细胞类型测试。通过删除特定区域,我们能够表明最初的126元5′UTR并不有助于IRES函数和茎环IIId / e维持高水平的表达至关重要。这将是未来意义的确认的预测结构RPgV RHV1 IRES的潜在使用RNA的形状。

RHV1结构基因(C、E1和E2)表达质粒被证明是裂解,产生蛋白质的正确的大小。此外,RHV1 E1E2支持使用时肝细胞的转导pseudotype慢病毒载体。需要进行进一步的研究,来发现特定条目受体,最初阻塞的研究和丙肝病毒进入受体转导的敏感性和测试替代细胞系,但这个最初的实验暗示RHV1 hepatotropic潜在的老鼠。

代病毒pseudotypes是使用最广泛的受体功能的分析方法,允许附件,渗透和脱壳研究。本研究奠定了基础使用RHV1 pseudotype粒子用于评估这些重要部分病毒复制周期,也可以用来研究细胞趋向性的小鼠模型和抗原性功能E1和E2糖蛋白。

我们的努力使一个RHV和RPgV复制能力模型在体外迄今为止不能结实。使用完整的病毒结构,我们测试了人类肝癌细胞系(哈- 7.5)包含一个小牛乳沟丙肝病毒NS3-4A乳沟的记者,记者的RFP把原子核(29日]。易位与全身RHV1 RFP的观察,证实了以前的发现RHV1 NS3-4A蛋白酶能裂开人类小牛(30.];然而,细胞的数量随着时间的推移和RFP易位没有增加(图S3.A)。

我们进一步测试完整的病毒结构包含m-Scarlet和BSD之间插入NS4A-B Hepa1-6和BHK-21, mScarlet表达在细胞,但细胞的数量表达mScarlet没有增加加班,未能产生克隆选择与BSD复制时,即使表达Sec14L2和ApoE必不可少的高水平的丙肝病毒复制(31日,32)(图S3.B)。进一步细胞系可以测试以及未来淘汰了先天免疫反应实验。

总之,这项研究表明,RHV1/2和RPgV包含ires能够驾驶的高水平的蛋白质合成。RHV1结构基因是细胞蛋白酶和可以用来pseudotype劈裂的慢病毒载体转导小鼠肝细胞的能力。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

信息披露

本文在预印本之前可用bioRxiv (doi:https://doi.org/10.1101/761379)。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

学生设计和计划的所有实验。党卫军,某人和公里进行实验和分析的结果。SS和某人写的手稿。CF手稿编辑,收购资金。

补充材料

(1)质粒中施工方法的说明。(2)补充分析的RNA转录水平由病毒5′utr。(3)小牛乳沟和dsRNA长篇经由分析。(补充材料)

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