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研究文章|开放存取
Epstein-Barr病毒(EBV-)不朽的淋巴母细胞样细胞系(LCLs)表达高水平的CD23而低水平的CD27以支持其生长
胡怡雅，1 瘦山姆苏，2 塾-的Khuan周，3 和 仙杨经文刁
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1马来西亚雪兰莪州大鲁尔伊山苏邦贾亚47500号，班达尔苏威市，日兰大学，卫生与医学科学学院，医学科学系
2生物科学，双威大学科学与技术学院，惹UNIVERSITI，双威镇，47500梳邦再也，雪兰莪DARUL日Ehsan，马来西亚的学系
3双威医疗中心，惹泻湖SELATAN，双威镇，47500梳邦再也，雪兰莪DARUL伊赫桑，马来西亚
摘要
EB病毒（EBV）是世界上常见的人类疱疹病毒类型之一。EB病毒是已知的世界上感染的成年人的95％以上。所述病毒主要感染B淋巴细胞和永生化可能和改造细胞进入轴承EBV淋巴母细胞系（的LCL）。有限的研究都集中在表征永生了LCL的表面标志物的表达。这项研究表明，从16个类风湿性关节炎（RA）患者和使用B95-8狨猴来源的EBV健康志愿者的15周的LCL产生。LCL一代的成功率为88.23％。所有CD19 +的LCL细胞表面上表达CD23（16.94-58.9％）和CD27（15.74-80.89％）。我们的数据表明两种不同的LCL的类别（快和生长缓慢的）（p<0.05)，以加倍时间计算。与快速增长的lcl相比，生长缓慢的lcl CD23水平较低(35.28%)，而快速增长的lcl CD23水平较低(42.39%)。相比之下，生长缓慢的lcl在单独CD27和CD23+CD27+组合中均表现出较高的百分比。总之，这些发现可能提示细胞CD23和CD27表达与生成的LCLs增殖率的相关性。CD23的增加表达可能参与了EBV对b细胞的永生化和EBV转化的LCLs的生长和维持，而CD27的表达可能对LCL的增殖有抑制作用。这些推测需要进一步的调查。
1.介绍
爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV）已感染全球95%以上的成年人[1]。EBV主要目标和感染的B细胞，随后上皮细胞，以及在较小程度上，CD4 T细胞[2]。感染性病毒体产生在B细胞和上皮细胞的裂解复制以下。裂解周期后，EBV潜伏如下，并在被感染的B细胞为个人的余生挖墙角[2]。EBV主要引起传染性单核细胞，并将其还与两个淋巴和上皮恶性肿瘤，例如伯基特淋巴瘤，霍奇金氏淋巴瘤，鼻咽癌，胃癌[相关联3]。
EBV感染B细胞，使B细胞永生化，形成长期生长的lcl，持续表达病毒[4]。该方法已在实验室中被用于永生化某些人类血液来源的B细胞，其可以是稍后用作各种研究，包括大规模药物文库筛选，疫苗研究中，和高通量生物学研究的培养模型[五，6]. 其中，由B95-8细胞系产生的EBV是B细胞永生化过程中最常见、最有效的EBV来源。在过去的几十年中，研究人员一直致力于改进永生化方法及其效率[7]。最近，已经显示，与小的修改，可从外周血的小体积中产生的LCL低至为0.1mL [4]。这一发现是下一个的情况，其中样品体积是有限的特别有用的。
以往的研究表明，免疫细胞尤其是B细胞及其亚群在RA发病中起着关键作用[8，9]。尽管EBV成功地使b细胞长生不老，但对LCLs的特征及其与亲代b细胞的比较研究却很少。在本研究中，我们证明了EBV能够有效地使RA患者外周血中的b细胞永生并形成LCLs。然后我们检测了包括CD23和CD27在内的几个b细胞亚群标记在LCLs及其亲代b细胞中的表达水平。这些b细胞亚群以前被认为与RA患者的临床表现有关。例如，在RA患者中检测到表达CD23的b细胞升高，单克隆抗体可以阻断它们[10]。类似地，增加的CD27的量+免疫球蛋白-也容易在患者活动性RA检测到的记忆B细胞〔11]. 另一方面，胡和同事证明CD27+B细胞与RA疾病活性负相关，并且发现在患者[待受损12]。
在这项研究中，我们试图评估从来自RA患者来源的PBMC和的LCL CD23和/或B细胞的CD27的表达水平。我们还调查了关于的LCL的细胞生长和CD23 CD27的表达水平。
2。材料和方法
2.1。患者样本
16例类风湿关节炎患者外周血5mL（表1）从双威医疗中心，马来西亚收集，在011/2017年/ ER的道德核准代码。将PBMC用Ficoll-Paque上（GE Healthcare）上的方法分离。简言之，在EDTA管中收集血液稀释1至1用无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）和层叠到在新的离心管的Ficoll-Paque上的解决方案。将管在400×g离心在室温下用低加速和“制动断开” 40分钟。收集这是等离子体的顶层，并在-80存储℃之前等分。使用3毫升巴斯德吸管收集含有PBMC的血沉棕黄层，并转移到新的离心管中。将细胞用PBS，接着在含有10％胎牛血清（FBS），在10％DMSO冷冻保存之前和保存在液氮贮罐RPMI培养基中洗涤两次。的5毫升血从健康志愿者作为对照捐赠。将PBMC和血浆的处理，并如上述那样存储。诊断，血液取样，冷冻保存的PBMC，和EBV永生化的日期显示在补充材料（购这里）。
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抗CCP：抗环瓜氨酸肽抗体；CRP：C反应蛋白；DAS28：疾病活动度评分28；ESR：血沉；RF：类风湿因子。 |
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2.2。血液检测和疾病活动性计算
从风湿病门诊检索RA患者的血液检测结果（抗CCP、RF、ESR、CRP）、软关节计数（TJC）、肿胀关节计数（SJC）和患者整体评估（PtGA）评分。用公式（0.56）计算DAS28-CRP作为疾病活动性测量指标SQRT（TJC28）+ 0.28SQRT（SJC28）+ 0.36ln (c反应蛋白+ 1)+ 0.014PtGA+0.96）[13]。疾病活性分为缓解（<2.6），低（2.6 - 3.1），中度（3.2 - 5.1）和高（> 5.1）。
2.3条。EBV永生化
B95-8狨猴来源的EBV上清液从艾伦秀绷邱博士，分子病理学单位，医学研究院（IMR），马来西亚惠赠。使用浓缩的上清液EBV如前所述从患者的末梢血B细胞永生化物[14]。在补充材料的表显示了PBMC的分离和冷冻保存，建立的LCL，并储存在液氮贮罐冻存PBMC中的持续时间的日期。简言之，将冷冻保存的先前PBMC的小瓶解冻，并测定细胞数。将细胞调节到2×106/mL，使用刚解冻的EBV上清液，在37°C，5%的CO下孵育过夜2放在一个T25的长颈瓶里。次日，将转化培养基(RPMI 1640 + 20% FBS + 200ng/ml环孢素)加入烧瓶中。在显微镜下观察感染ebv的细胞，寻找成簇的rosette样转化LCLs。用3-6代LCLs进行流式细胞术分析和细胞增殖实验。
2.4。流式细胞仪分析
用单克隆抗体在FACSCalibur流式细胞仪（Becton Dickinson）上对T细胞（CD3/PE，克隆SK7）、B细胞（CD19/BB515，HIB19）和B细胞亚群（CD23/APC，克隆EBV-CS5和CD27/PE，克隆L128）的表面抗原进行三色细胞术。购买细胞活力溶液7AAD（VIA-PROBE）测定细胞活力。所有抗体都是从贝顿·迪金森那里购买的。简而言之，冷冻保存的PBMCs在50年内解冻并重新悬浮μBSA染色缓冲液（Becton Dickinson公司）的L和与预稀释的荧光染料缀合的抗体的黑暗中在室温下温育30分钟。然后将PBMC与BSA染色缓冲液洗涤两次，并再悬浮于500μBSA的L缓冲液用于流式细胞术分析。控制PBMC悬浮液用相同的方法制备。通过细胞生存力染料测定20000个活细胞进行门控，并在套CD3 / CD19 / CD23和CD19 / CD27 / CD23的收集用于三色分析。使用CellQuest Pro软件（Becton Dickinson公司）分析数据。
2.5条。LCLs增殖试验
为了将lcl分为两类（快速生长和慢速生长），根据制造商的指示，使用实时Glo-MT细胞活性测定（Promega）测定细胞增殖率。这是一种基于非溶性发光的检测方法，可以检测培养72小时内活细胞的实时增殖。简单地说，10000个细胞/孔接种在白色平底96孔板（Greiner Bio one）上，一式三份。从提供的试剂盒中制备2X反应混合物并添加到每个井中。细胞在37°C，5%一氧化碳下培养2对于测量1小时前采取了不同的时间点（0，16，20，24，40，44，48，64，68，和72小时）使用发光酶标仪（Tecan公司）。的相对发光单位（的RLU）对时间曲线图进行作图，以显示了LCL的生长曲线。在该曲线图中，细胞数目通过的RLU表示。的LCL的每个类别的使用的RLU，倍增时间（在值加倍所需的细胞数时）使用，其被用于显着性检验[多点在线计算器计算15]。这个在线工具使用最小二乘拟合指数法来计算倍增时间[15]。生长速率（每单位时间中发生的倍增的数目），然后使用以下公式计算： 所有LCLs加倍时间的平均值为54.69小时。因此，以该值为截止时间，将翻倍时间大于54.69小时的lcl分为生长缓慢的lcl，反之亦然。
2.6条。统计分析
在三个独立的实验中进行用于的LCL的每个类别流式细胞分析，除非另有规定。数据以平均值表示标准偏差（STD。DEV）。使用其中的数据被认为是显著当非参数检验（曼 - 惠特尼和秩和检验1H）测定显着p小于0.05。
3。结果与讨论
3.1条。研究对象的疾病活动
表格1显示16例RA患者和1例健康个体的人口学数据，以及常用RA诊断标志物的血检结果，提示其疾病活动。根据16例RA患者的DAS28-CRP指数，其中3例为高活动状态，8例为中度活动状态，3例为缓解状态，2例由于数据收集不完全，状态不明。
3.2。的LCL的代
16例类风湿关节炎患者和1例健康供体（标记为C）采集外周血单个核细胞（PBMCs）（表1)冷冻保存。冰冻保存的小份外周血单个核细胞用于EBV感染。在17个烧瓶中，15个EBV转化的lcl（4E和14A除外）在感染一周后产生，在烧瓶中可以看到可见的细胞团。当在显微镜下观察时，LCLs显示出典型的玫瑰花状形态，其大小如红色箭头所示（图1）。所述的LCL产生的成功率为88.23％（15出来的17）。
3.3条。LCLs生长速率及倍增时间的计算
然后，我们使用非溶解性和实时发光的细胞增殖分析来测定每一类lcl的生长速度。数字2示出了由相对发光单位（的RLU）表示的LCL的每个类别的生长曲线。表格2示出了使用在线计算器[各自的LCL的计算倍增时间和生长速率15]。从的LCL的每个类别的所得到的倍增时间，我们划分了LCL成使用54.69小时（所有的LCL的平均值）作为截止值，这导致在10快速增长的两大类和5生长缓慢的LCL（表2和4）（p<0.05）。
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3.4。表面的LCL的标志物表达
流式细胞术检测PBMCs及相应的LCLs表面标志物CD3、CD19、CD23、CD27的表达。CD3和CD19分别是t细胞和b细胞的表面标记物。以从患者8A和相应的LCL-8A中分离得到的PBMCs为例，如图3显示CD3如何+T细胞和CD19+流式细胞术检测B细胞形态及门控。然后，以分析的淋巴细胞总数（20000个细胞）的百分比表示表达水平。供体外周血单个核细胞中，T细胞占29.78-81.8%，B细胞占2.35-45.95%。EBV转化后，T细胞数量减少到0-0.27%，B细胞数量增加到68.59-89.35%。这清楚地表明，EBV已经成功地取代了T细胞群，实现了B细胞永生化。CD3+T细胞衰老和将从了LCL被完全洗掉。
CD23是B细胞活化标记物CD27，同时是用于记忆B细胞的标记物[16，17]. 在类风湿性关节炎患者中，表达CD23的B细胞水平升高与疾病活动呈正相关，它们可能成为治疗靶点[10，18]。相比之下，CD27+B细胞被发现与疾病活动负相关，发现在RA患者[被削弱12]。在目前的研究中，我们不能区分CD23和CD27的PBMC中和LCLS的表达模式（表3）。数字4描绘了CD19的门控+，CD23年+和CD27+从患者中分离8A的PBMC，并通过流式细胞术相应的LCL-8A。从所有的LCL，而68.59-89.35％的人CD19+如预期，它们表达CD23(16.94-58.9%)和CD27(15.74-80.89%)。b细胞共表达CD23和CD27的比例为5.72-41.53%(见表)3）。
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LCL：淋巴母细胞系；PBMC：外周血单个核细胞。 ＃流式细胞分析所有的表面标志物是只执行一次和CD3水平尚未确定，由于细胞数量的限制。 |
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3.5。疾病活动度，表面标志的表达水平，LCL增殖的关系
进行统计分析，以测试该疾病活性和表面标记的表达之间的相关性;然而，他们没有表现出显着性。同样，疾病活动没有相应的LCL的增长率相关。
从的LCL的每个类别的倍增时间，进行了测定，并进行统计分析两个快和生长缓慢的LCL平均值。表格4显示显著差异（p<0.05）两种类型之间的倍增时间。同样，确定了相应类别的CD23、CD27和CD23+CD27+水平的平均值。快速生长的LCLs表达CD23（42.39%）高于缓慢生长的LCLs（35.28%）。然而，这在统计学上并不显著（表4）。相反地，CD27表达和CD23 / CD27共表达均相比缓慢生长的LCL（分别为51.57％和19.49％），在快速增长的LCL（分别为36.15和13.36％），较低。当进行统计分析，只有在快速增长的LCL表现出显著降低CD27但不是CD23 / CD27的表达。与更大的样本量需要进一步的研究，以验证这些结果。
CD23的高表达可能是由于EBV感染或改造。有迹象表明B细胞永生化可能依赖于细胞CD23表达的证据。研究表明，CD23阴性B细胞可通过EB病毒感染，但不能除非特殊的生长因子补充[永生19]。另一项研究表明，EB病毒感染的B细胞可以发展成两个不同的亚群：CD58号+白细胞介素6-和CD58号+白细胞介素6+[20个]。前者的B细胞亚群，而后者亚群停止增殖增殖活跃。CD23的表达也可能通过EBV核抗原如先前在一个Burkitt淋巴瘤（BL）细胞系[描述被诱导以下的B细胞的EBV转化2（EBNA-2）的表达16]. 相反，CD27在生长缓慢的LCLs中的高表达可能表明它们对LCLs的增殖有抑制作用。
4。结论
CD23在B细胞EBV转化和LCLs生长中起促进作用。我们的研究表明，快速生长的LCLs具有较高的CD23表达，较低的CD27表达和CD23CD27表达。进一步的大样本研究有助于深入探讨表面标记表达对EBV维持和细胞生长的影响。
数据可用性
用于支持该研究结果的数据包括在项目之内。
利益冲突
作者宣称，有感兴趣的关于这篇文章的发表任何冲突。
致谢
我们要感谢马来西亚医学研究所（IMR）分子病理学组的Alan Soo Beng Khoo博士，感谢他慷慨地为我们提供了B95-8绒猴源性EBV，使我们的工作永垂不朽。胡怡雅获三威大学研究奖学金硕士学位。这项研究由Sunway大学内部研究拨款2019（INT-2019-SHMS-DMS-01）、马来西亚国家癌症委员会（MAKNA）癌症研究奖（CRA）2016（EXT-SIDS-SIHD-MAKNA-2017-01）和Sunway医疗中心研究基金（SRC/002/2017/FR和SRC/003/2017/FR）资助。
补充材料
该表显示所研究的例诊断日期，血液采样，冷冻保存的PBMC，EBV永生化，和持续时间冷冻保存的PBMC。（补充材料）
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