适应杀伤力:我们可以学到来自几内亚Pig-Adapted埃博拉病毒感染模型

文摘

建立小动物模型(EBOV)感染埃博拉病毒的研究都是十分重要的遗传因素参与的复杂病理EBOV疾病和抗病毒药物的初步筛选,生产治疗heterologic免疫球蛋白,实验性疫苗的发展。自野生型EBOV在啮齿动物无毒,适应需要一系列文章在这些动物毒性/杀伤力出现在这些模型。这里,我们概述几种适应在豚鼠系列,导致建立几内亚pig-adapted EBOV (GPA-EBOV)变异不同的特点,而均匀的致命感染动物,病毒学和比较,遗传、pathomorphologic,免疫学研究的适应实验所得结果与其他研究小组。

1。介绍

几个埃博拉病毒感染的动物模型,建立了在啮齿动物和非人灵长类动物(额定马力)。额定马力,包括恒河猕猴猴,最适合病机、治疗和疫苗的研究中,因为只有他们可以致命的感染不适应EBOV菌株产生的病理密切类似人类EBOV疾病(1]。然而,由于伦理、实用、和费用的原因,小EBOV感染动物模型开发包括几内亚猪,老鼠,,最近,叙利亚仓鼠模型(2]。这些是建立了一个串行通道所需病毒适应,自野生型EBOV在啮齿动物无毒或引起的非致命性疾病。尽管致命改编EBOV感染疾病的啮齿动物在许多方面是不同的灵长类动物,感染的课程中重要的相似之处进行小动物模型有用,特别是研究EBOV疾病和遗传因素在抗病毒筛选1]。

在灵长类动物,EBOV感染的发病机理是在几个主要的细胞与病毒复制目标伴随着免疫调节异常,凝血障碍。病毒繁殖的主要目标,脾脏和淋巴结的单核吞噬细胞,紧随其后的是肝脏中大量复制,通常,在巨噬细胞和肝细胞,病毒扩散到其他器官和组织(肾上腺、肾脏、生殖器官,肺)。一个旁观者淋巴细胞凋亡被一个未知的机制提出了严重的淋巴球减少症发生在EBOV感染的原因。IFN-mediated反应介导的抑制病毒蛋白质VP24和VP35块先天抗病毒防御。血管损伤直接发生,由于内皮细胞裂解病毒繁殖,或间接诱导的促炎细胞因子对血管壁的影响是发病的重要因素。凝血机制障碍,如播散性血管内凝血(DIC)和出血,以及血小板减少症发生在灵长类动物EBOV感染,还有待详细调查(3]。

建立了豚鼠的致命EBOV变异通过最初的连续的段落(4 - 8次)野生型病毒,,首先,不完整,此外,完整的杀伤力在接种的群体动物4- - - - - -7]。几内亚pig-adapted EBOV造成致命感染轻微症状前4 - 5天,随后迅速发展的一个高度发热条件导致动物死亡第8 - 11天。第一个淋巴结中发现巨噬细胞早在24 h p / i,脾脏和肝脏的病毒传播第二天和其它器官和组织进一步。病毒的传播可以伴随着进步组织的病毒滴度(从1.7到4.8 -6.4日志₁₀空斑形成单位/ g在不同组织包括脾、肝、肾上腺、肺、肾脏、胰腺)天1 - 9的感染,和血液中的病毒血症峰值达到7 ~ 10天⁵空斑形成单位/毫升(7]。然而,在我们的两个适应实验中,只有适度的(8]病毒效价甚至零增长9]不致命的和致命的改编EBOV之间发生。的延长凝血酶原时间(PT)和局部血栓形成质时间(aPTT)观察到受感染的动物1]。

类似EBOV感染过程中在灵长类动物在许多方面,EBOV疾病在啮齿动物中有一些重要的区别。发烧和斑丘疹的皮疹,这是典型的灵长类动物感染的迹象,都没有出现在小鼠感染mouse-adapted埃博拉病毒(MA-EBOV) [10]。在豚鼠感染几内亚pig-adapted埃博拉病毒(GPA-EBOV),只是发烧,但不是皮疹,存在(5,7]。与老鼠和类似于叙利亚仓鼠,致命EBOV感染豚鼠诱发严重的凝血异常包括血小板的下降和增加凝固时间;然而,纤维蛋白口供和播散性血管内凝血(DIC)不容易观察到这些动物2,7,11]。发生出血在豚鼠EBOV疾病仍然是有争议的:一些研究者报告说,动物的死亡不是伴随着可见出血的迹象6];然而,我们经常观察到典型的出血性病灶在肝脏,至少部分的动物感染GPA-EBOV在我们的实验12]。尽管GPA-EBOV感染过程中严重的淋巴细胞减少,淋巴细胞旁观者细胞凋亡,这是灵长类动物和小鼠感染的一个重要特性,通常没有观察到在豚鼠7]。

病毒学的这里,我们提出一个全面的概述,pathomorphologic,血液在豚鼠EBOV适应实验获得的数据(包括四个通道系列在我们实验室执行)并讨论这些结果的价值获得的啮齿动物模型病理EBOV感染的一般理解。

2。建立几内亚Pig-Adapted致命的埃博拉病毒株和毒性的研究和病毒特征

串行通道不同病毒的动物或细胞培养可以导致突变体的选择与不同的繁殖特性和高或低毒性,相比原来的野生型病毒(13,14]。成年豚鼠接种与野生型EBOV隔绝灵长类动物通常开发一种非杀伤性轻度发热甚至无症状的疾病。然而,它已被先前表明,年轻的豚鼠可能偶尔会开发一个致命EBOV感染,和串行通道EBOV导致杀伤力大幅增加在这些动物4,15]。综述论文,我们总结一下自己的数据建立四个独立的适应在豚鼠系列使用EBOV亚型扎伊尔的原始股票,应变Mayinga,不同在他们的一段历史5,8,9,11),并比较他们与其他实验室的EBOV适应系列成功执行(6,7,10]。

原始EBOV,应变Mayinga,股票的第一个适应系列(8 mc)是通过24倍州立E6细胞系豚鼠适应实验前(5),而第二个系列的股票(6年级)是通过两次额定马力(绿色猴子)其次是15章节在人类肺L68细胞(9]。在第三系列(GLA),野生型EBOV,菌株Mayinga,通过两次额定马力和进一步增加在维洛细胞培养11]。第四系列(GPA-P7)成立的个体克隆菌株Mayinga EBOV,由triple-cloning /获得使州立细胞和确认之前因为没有致命性疾病适应豚鼠。这种病毒克隆进一步用于接种的动物被指定为几内亚的前体pig-adapted EBOV (pre-GPA克隆)8]。

首先通过8 mc适应系列(5),一群动物(我们使用了6组动物在我们所有的适应试验)是接种病毒源于恒河猕猴致命感染的肝匀浆Mayinga EBOV应变和通道24倍州立E6细胞。在一些动物,不致命的发热条件发达与体温上升到40°C。动物的肝脏匀浆,高档发烧和更高水平的肝病毒效价,被用于下一个通过接种。每通道,发热温度增加(从39.8 - -40.0°C在早些时候在段落后面段落41.5 - -42.0°C),是肝脏病毒效价,表明整体经济增长从2.9±0.4日志₁₀空斑形成单位/毫升5.5±0.7日志₁₀空斑形成单位/毫升(由空斑形成实验州立细胞)。第一个致命的结果发现通道3,和适应的杀伤力和传染性病毒隔离逐渐增加,直到通过8。在几内亚猪接种病毒隔离的通道8日发烧发生在天4 - 7和代表了双峰模式,第二个峰值在天11 - 13。热事件与组织的最大水平有关病毒滴度。指定EBOV-8mc改编病毒株,和几个克隆来自它和被证明有类似的功能noncloned EBOV-8mc病毒(5]。

如前所述,最初的6年级系列的EBOV股票是通过两次额定马力和进一步15次L68细胞培养其适应豚鼠之前,和它的传染性和毒性是通过系列的发展。病毒的生物效价收成PFU减少从第一到第三段,然后开始增加,达到其高原12通道,进一步保持稳定。然而,病毒传染性豚鼠整个L68段落持平。细胞培养通道后,执行病毒克隆和生物效价(PFU)中间病毒的股票(股票名称Ch-15通过后15日)和克隆获得的三个都是平等的。适应豚鼠开始时,克隆2因为没有发热反应,并从血液样本接种动物病毒隔离失败了。然而,克隆1在豚鼠引起直肠温度上升到第一段后40.5 - -41.8°C,影响了100%的动物。从第四段开始,致命的结果都被记录下来。第五段后,成为了豚鼠高致命性的病毒。病毒在血液被记录在日志效价为3.5₁₀空斑形成单位/毫升通道1和没有改变整个系列。由此产生的病毒株是指定的6年级9]。

在第三段系列,杯子(11)、动物接种在通道1开发了一个低级(低于40°C)发热、显示双峰模式和高峰在7天20。较低的病毒数量(1.62日志₁₀空斑形成单位/毫升)只能检测到病毒后的血清浓度通过离心分离,虽然没有病毒可以从全血分离。组织被检测到的病毒滴度在1.6日志₁₀空斑形成单位/毫升(肝脏)和3.22日志₁₀在腹膜渗出液空斑形成单位/毫升()。第一个发现了致命的结果通过2(10天),伴随增加的血清和组织病毒滴度4.2日志₁₀空斑形成单位/毫升。有趣的是,第二个峰值发烧没有幸存的动物中观察到。在通道3,适应EBOV成为完全致死的豚鼠动物死在5至7天之间,血清和组织稳定在3.0 - -4.0的水平的病毒滴度日志₁₀空斑形成单位/毫升。GPA-EBOV菌株获得了在本系列中被用于pathomorphologic的综合分析,EBOV疾病的血液、免疫、凝血模式在几内亚猪。

在过去的系列,GPA-P7 [8),前身pre-GPA克隆得到的三段原始Mayinga EBOV州立细胞和随后的克隆。系列在适应的过程中,在每个通道,一种动物最明显的显示温度响应白天7 p /我是用作供体的病毒在接下来的段落。段落,受感染动物的发烧开始被记录在4天p / i。热事件的持续时间从通道增加到通道(从6天在章节1 - 2到10 - 12天幸存的动物在章节5 - 6)。白天7 p / i,所有段落的动物表现出低水平的病毒血症,并没有增加整个系列。病毒复制的能力受感染动物的肝脏没有发生明显的改变。在前两个段落,EBOV诱导豚鼠轻微疾病与温度对第4 - 9天40.0 - -40.4°C p / i和最终的复苏。第一个致命的结果被记录在一段3天15 p / i。在通道4没有致命的结果记录,而两个致命的结果(40%致死率)记录通道4。进一步,杀伤力增加,而生存的时间减少了。 At passage 6, 80% lethality was observed, and, finally, at passage 7, full lethality of infection was acquired. The survival time in this fully lethal EBOV infection averaged 11.6 days. In lethal infections, the animals rapidly lost weight, displayed anorexia, and developed impaired motor coordination, especially in the terminal stage. Two-three days before death, guinea pigs had diarrhea and the signs of intestinal hemorrhage were observed. This highly lethal EBOV variant obtained by the 7-passage adaptation of pre-GPA clone was designated GPA-P7 [8]。

我们几个试图适应两个原始Mayinga应变EBOV股票(适应系列8 mc和6年级)成人ICR小鼠,使用同样的方法作为适应豚鼠系列。所有试图适应6年级病毒股票失败;然而,使用高剂量的第一EBOV股票,我们获得了一个自相矛盾的公祭的变体。这篇文章系列在成人ICR小鼠没有造成致命病例,但导致增加肝脏中病毒效价达到5.55×10¹¹在段落后面空斑形成单位/毫升。注意,EBOV浓度在肝脏甚至在第一段达到3.5×10⁹空斑形成单位/毫升11天。这mouse-adapted病毒变种被任命为D-5 [9]。

适应所有系列的名称提供所有原始病毒股票和衍生品在图1。

几内亚pig-adapted EBOV菌株8 mc, 6年级,杯子,和GPA-P7,以及另外两个适应变异得到的另一个研究小组(6,7),因此,代表病毒变异,这似乎是非常相似的毒性和杀伤力(尽管段落的数量需要获得全面的致病性),而血清和组织截然不同的病毒滴度的适应。我们适应系列的两个8 mc和杯子,和其他两个系列报道(6,7]代表2-3-order-of-magnitude增长的组织(PFU)的病毒滴度随应变的发展对豚鼠毒性,而在其他两个,6年级和GPA-P7,没有观察到或轻微病毒效价提高,尽管收购完整杀伤力动物(5,8,9]。适应系列(5- - - - - -7,11),增加肝脏或脾脏中被观察到的病毒滴度(表1),促使假设开发适应高毒性/致命性的病毒变异可能是由于增加了病毒复制的受感染的组织。然而,建立6年级和GPA-P7病毒股票,不显示任何显著增加病毒滴度,同时展示高杀伤力的动物,不支持这一假说。类似地,提出了增加的病毒复制率之间的联系和发展适应的杀伤力Mayinga EBOV应变老鼠(10)是由我们的数据反驳mouse-adapted D-5变体展示非凡的组织病毒滴度高,在没有任何致病性ICR小鼠(9]。因此看来,增加病毒繁殖可能不是中央的行列式EBOV病毒毒力进化过程中适应不同的动物模型。

3所示。研究遗传因素的毒性/杀伤力在几内亚Pig-Adapted EBOV变体

EBOV毒性的遗传标记的信息是重要的理解EBOV感染发病机制,以及疫苗和抗病毒药物的发展。因为一些新的突变(相对于野生型病毒股票)可能发生的新创和一些罕见突变可以被放大和固定在适应病毒股票在适应的过程中,比较适应致命的基因变化和预适应非杀伤性EBOV基因组和匹配的不同的毒性EBOV变体可以产生毒性的遗传因素/杀伤力的宝贵信息。

在我们第一次改编系列中,8 mc,详细分析EBOV基因组核苷酸序列的原始和几内亚pig-adapted病毒的股票显示几个基因组编码区域的变化五个病毒蛋白(9,16]。8 mc克隆显示,总共八个公共子序列变化相比原第一EBO股票。两个沉默的基础变化ORF编码NP蛋白被发现,,很明显,不影响NP函数,而另一个基地NP基因的变化会导致一个保守的氨基酸替换法低浓缩铀(648),也可能影响毒性。没有基础vp35和vp40基因中发现了变化。一个尿苷插入基因编辑网站的病毒糖蛋白(GP)基因和一个氨基酸替换Asp通用电气(397)被发现在三个五8 mc克隆;然而,所有五个克隆在豚鼠的致病性相似,尽管医生表达模式的重大变化前突变造成的。单个碱基变化vp30的3′非编码区基因似乎也与病毒致病性的收购过程中适应。

相反上述突变,至少部分的三个核苷酸的变化vp24基因的编码区,导致氨基酸替换Ile(71),低浓缩铀箴》(147),用力推Ile(187),可能与适应的过程,自8凝胶流动性mc-ebov VP24低于其野生型,表明这种蛋白质的主要结构重排,也许,VP24适应过程的至关重要的作用。

一个保守的氨基酸替换用力推阿拉巴马州(820)在L基因,类似于板式换热器低浓缩铀(648)替换在NP基因,似乎并不负责病毒毒力。然而,由于都是发现在所有5个EBOV-8mc克隆,他们可能有支持作用的增加毒性(16]。

比较核苷酸序列分析病毒变异的第二部改编(6年级)揭示了两个单核苷酸替换vp24 ORF改编的病毒株6年级(比原第二EBOV股票),这导致氨基酸替换Asp通用电气(165)和他的酪氨酸(186)(17]。自前存在于最初的病毒变种Ch-15用于适应在几内亚猪,它很明显,介绍了在额定马力或L68使细胞和似乎无关紧要的发展适应了病毒的致病性。其他vp24突变被发现在6年级EBOV变体几乎相同的位置,在另一个几内亚pig-adapted变体,8 mc,第一段系列中获得,因此,支持的假设可能参与这种蛋白质在宿主适应和致病性的增加(16]。

进一步评估遗传差异的贡献出现在几内亚pig-adapted EBOV变异病毒的毒性,两种不同的方法了。第一个是另一个适应系列开始克隆EBOV股票(pre-GPA),在确定基因事件发生在每一个通道和致病性相比反应在豚鼠反映出新兴EBOV毒性(8]。另一项研究使用反向遗传方法,关注个体的影响突变EBOV-8mc变体及其组合EBOV毒性(18]。

在以前的研究中,GPA-P7适应株基因组被发现不同于基因组pre-GPA克隆的17个核苷酸的变化。没有发现遗传差异的终端区域GPA-P7基因组(3′领袖和5′拖车)。GPA-P7 NP基因的核苷酸序列包含12个核苷酸替换,8的同义和4导致氨基酸编码NP蛋白(低浓缩铀的变化专业(544),Asn爵士(566),爵士箴》(598),AsnAsp (663))。三个替换导致氨基酸变化检测的核苷酸序列GPA-P7 VP24基因(满足Ile(71),低浓缩铀箴》(147),参数低浓缩铀(154))。L基因(编码依赖RNA的RNA聚合酶)GPA-P7包含两个核苷酸替换,一个同义词和一个产生,后者导致氨基酸变化(瓦尔Ile (236))8]。

相关的突变GPA-P7发生的时间(段数)和新兴病毒致病性豚鼠允许毒性评估他们的角色之一。17个核苷酸替换区分GPA-P7 pre-GPA克隆,12日发生早在第一段(GPA-P1变种)。这12个替换包含九个同义(8在NP基因,另一个在L基因)和三个产生替换导致3 NP基因的氨基酸变化(低浓缩铀专业(544),爵士箴》(598),AsnAsp (663))。这些突变新兴EBOV毒性被认为是不相关的,因为它们发生在收购之前的杀伤力。另外两个突变出现在通道3,导致氨基酸的变化Asn爵士在NP蛋白和低浓缩铀(566)箴VP24蛋白质(147)。值得注意的是,第一个致命的结果在本系列中被记录在通道3,受感染的动物之间虽然没有致命的结果记录在通道4。这两个位点仍换人的异构,直到被固定在GPA-P5的基因组变异(5)通过代表的毒性增加豚鼠和导致疾病致死率为40%(2 5观察动物的致命的结果)。在通道6 VP24基因的突变序列,G10557A,发生导致氨基酸改变了Ile (71)。这篇文章是伴随着对豚鼠EBOV毒性,进一步增加出现80%的致命疾病(4天10和12之间致命的结果中的5个动物)。在一个核苷酸替换G10805U通道7,导致一种氨基酸改变参数低浓缩铀(154),固定在VP24基因序列,异构站点(G12286A,瓦尔Ile(236))出现在L基因序列。这些突变的出现与进一步增加对豚鼠EBOV致病性,表现为100%致死率(天8至12)。因此,只有三个氨基酸的变化VP24蛋白质(职位147、71和154年),一个变化在NP蛋白(566年位置),和一个改变L-polymerase(位置236)可能必不可少的贡献逐渐新兴毒性EBOV GPA-P7系列的过程中(8]。感兴趣的,两个相同的突变VP24(职位71和147年)被发现在上述8 mc适应病毒株(16]。

在后者的研究(18),重组病毒携带的各种组合野生型和几内亚pig-adapted基因产生的反向遗传方法和他们的贡献在豚鼠EBOV毒性评估。膜相关蛋白VP24是EBOV发病机制中发挥重要作用,在VP24和氨基酸的变化显示至关重要,足以赋予EBOV毒性在几内亚猪。实际上,重组病毒8只股票拿着那些mc VP24基因的突变存在导致豚鼠的穿制服的杀伤力。接种动物携带病毒NP和/或L基因突变并没有显示任何迹象的疾病,除了死亡组中两个豚鼠感染重组病毒携带NP基因的突变(F648L rEBOV-NP / 8 mc)。序列分析的病毒从那些死去的动物的血液显示额外的氨基酸替换L26F VP24。接种的豚鼠等病毒从动物死亡导致他们的制服。评估这种突变的作用毒性的几内亚pig-adapted EBOV,重组病毒生成,不同于野生型病毒在VP24单一突变,rEBOV-VP24 / L26F。引人注目的是,所有的动物感染rEBOV-VP24 / L26F发达的迹象EBOV疾病大约4天p / i。重要的是,没有额外的突变被发现的病毒从几内亚猪接种重组病毒,这表明自适应变异VP24是必要且充分的豚鼠EBOV毒性增加。“8 mc”突变NP和社会学低浓缩铀(648))没有严格要求的增加致病性但似乎导致加速EBOV变体的选择,在一个VP24能够带来致命性的突变(18]。

感兴趣的,类似的重大贡献EBOV适应VP24突变的老鼠已经观察到,要求支持的突变NP (19]。VP24的角色和NP蛋白的毒性mouse-adapted EBOV压力,然而,与他们逃避IFN-I-triggered抗病毒反应的能力。几内亚pig-adapted和野生型EBOV VP24,相反,相似的能力阻止IFN-I-stimulated响应(18),强调了不同的重要性要远远高于动物EBOV模型的解剖复杂EBOV疾病的表型。

总结所有遗传因素显示的豚鼠适应提供了一系列EBOV表2。

4所示。Pathomorphological发现EBOV-Infected几内亚猪

埃博拉病毒感染在灵长类动物与扩散有关实质坏死在肝脏无明显炎性改变(20.]。不像,Ryabchikova和他的同事报告肉芽肿病变的发生在肝脏是野生型的标志EBOV豚鼠感染(6]。那些提出了肉芽肿病毒间隙中扮演重要角色。Granuloma-like焦点组成的单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞出现在第五天p / i和增加的规模和数量。在这项研究中没有观察到肝细胞的参与,直到天7 - 8,当一些病灶周边的肝细胞演示瀑样的脂滴堆积和破坏。其他器官仅略有涉及,除了脾脏和淋巴结,一些免疫抑制的迹象(减少数量的有丝分裂,浆细胞形成的缺乏,和破坏基质细胞和巨噬细胞)被发现。病毒复制发生在肝脏的单核吞噬细胞只有在感染后期(7天),观察病毒核衣壳的存在和特定的被感染细胞的膜性结构。大部分被感染的巨噬细胞是位于granuloma-like疫源地,包含病毒粒子,出现侵蚀类核模糊。没有繁殖野生型病毒的发现在其他器官21]。

在我们的研究中,我们可以观察pathomorphologic野生型变化的动力学EBOV感染豚鼠(12),这有点不同于上述模式。电子显微镜显示发生扩张Disse EBO病毒粒子的空间早在24 h p / i。同时,发展中肝腺泡周围的炎症反应与肝细胞气球样变性显示混乱的细胞器(线粒体肿胀)和坏死病灶含有巨噬细胞吞噬细胞和病毒粒子(图2(一个))。然而,没有观察到巨噬细胞病毒复制中心。到第五天,渐进性坏死的变化发展,涉及的主要部分与常发生坏死肝细胞肝实质,大量出血肿胀皮下空间,中心坏死病毒复制的焦点,虽然只有几个病毒颗粒(图可见2 (b))。第七天的感染,然而,渐进性坏死的变化的进程停止,组织结构稳定。这时,巨噬细胞与众多osmiophilic夹杂物,包含viroplasm核,许多病毒粒子在他们附近(图2 (c))。从野生型的主要区别EBOV感染豚鼠观察到Ryabchikova et al。6)是肝细胞受损的存在在天5 - 7 p / i。

逐渐出现EBOV毒性的豚鼠在一系列的段落的pathomorphological模式的变化反映在感染。在早期的文章(1 - 3),只有定量差异数量的激活和感染肝巨噬细胞观察。感染的pathomorphological模式改变通道4,涉及更多的肝巨噬细胞,以及病毒在肝细胞繁殖首先发现。然而,只有核衣壳的形成,不适当的病毒出芽,在这个阶段发生在肝细胞,使其不清楚这些细胞的感染效率。一般来说,肝脏病变更严重比早些时候的段落,和脾脏和肾脏参与的迹象变得明显。所有观察形态学变化逐渐更加突出在章节5 - 6,与肝脏病灶病变成为普遍和受感染的细胞和病毒粒子的数量增加。全面收购的致命性的病毒适应豚鼠(8)通过肝组织变得充满了被感染的肝细胞和巨噬细胞与细胞内的核衣壳,以及大量的病毒粒子。一些细胞包含结构异常viroplasm和核衣壳。区域包含细胞溶解肝坏死肝细胞、巨噬细胞和病毒粒子成为普及的。其他器官和组织显示病变的严重程度,以及[21]。

在GPA-EBOV-infected几内亚猪,我们同样,观察坏死肝细胞(图3(一个)(图)和病毒粒子在皮下空间3 (b))早在24 h p /我12]。第二天,组织破坏更为突出,有多个出血和坏死灶含有大量的病毒颗粒,纤维蛋白沉积,巨噬细胞(图3 (c))。小叶中心的肝细胞,通常情况下,显示不断膨胀的营养不良的迹象,而perilobular肝细胞坏死和含有病毒颗粒(图3 (d))。该模式表明肝损伤2天的进展。到第五天,坏死过程包括腺泡的中部地区,大量坏死病灶纤维蛋白浸渍(图3 (e))和viroplasm枯氏细胞和病毒粒子(图3 (f))检测。在第七天,明显和整体破坏肝组织的动物感染GPA-EBOV可见大面积的坏死涉及实质和间质细胞(图3 (g))。这些坏死病变包含积极与小型和大型时间,吞噬细胞巨噬细胞viroplasm,病毒颗粒(图3 (h)),以及肝细胞含有大量的病毒(图3(我))。此时,肝脏病变涉及大量出血导致新领域的出现炎症和肝损伤的概括。我们相信GPA-EBOV-infected豚鼠的杀伤力,因此,由于病毒和随后的介入引发损伤的炎症反应所引起的肝脏的不同区域(12]。

每天pathomorphologic动力学变化发生在GPA-infected豚鼠康诺利和他的同事所示(7是在良好的协议与上述结构变化。在动物感染了改编,完全致命EBOV变体,病毒RNA和抗原检测巨噬细胞在淋巴结早在24 h p / i。被感染的巨噬细胞的数量,典型EBOV胞浆内包涵体代表病毒核衣壳被电子显微镜,增加4-20-fold 48 h p / i,确认进行富有成效的感染。从第三天,一个发展中灶状淋巴坏死和淋巴结的消耗不同定位观察,进展的日子。超微结构,鼻窦含有坏死细胞碎片,被感染的巨噬细胞,和免费的病毒粒子,同时没有证据表明EBOV-infected发现淋巴结淋巴细胞。在脾脏红髓单细胞坏死的发生是在第二天看到p / i,发展成一个更广泛坏死脾白色和红髓和红髓造血元素损耗的第四天。所有生产的迹象感染(病毒抗原,RNA和胞浆内包涵体)检测到红髓巨噬细胞和抗原递呈细胞(树突和网状细胞)的一些白髓毛囊。感染的传播与众多循环单核细胞和组织巨噬细胞包含EBOV夹杂物,与一些感染细胞已经出现病毒出芽病毒粒子和集群的质膜。在肝脏,小的肝细胞坏死灶发生在天2 - 3 p /我和肝细胞和枯否细胞EBOV-staining观察。4天,持续感染肝脏扩散到周围的肝细胞坏死病灶和枯氏细胞,因为他们也开始包含病毒细胞质内含物。 Most of these foci stain EBOV RNA- and antigen-positive, and the sinuses are filled with antigen-positive debris. Free virions in the Disse spaces and virus capsid inclusions are found in Kupffer cells at day 5. Later, at day 7, some periportal fibroblast-like cells become involved in the infection and stained EBOV-positive. The occurrence of the virion-containing fibrin depositions in subendothelial spaces and virus particles in subepithelial connective tissue of the bile ducts (both as free virions and cytoplasmic viral inclusions in degenerate fibroblasts), probably, marks the onset of a systemic spread of infection from the liver at day 9. In fact, at later stages of infection, involvement of different organs and tissues, as well as cellular targets, is observed: gastrointestinal fibroblasts and macrophages, adrenal cortical cells and fibroblasts, bladder epithelium, interstitial and alveolar macrophages, the occasional fibroblasts and endothelial cell of pulmonary venules in the lungs, and so forth [7,21]。

一个独立形态的研究野生型和几内亚pig-adapted EBOV感染展现了一个不适应病毒无法复制的主要目标,巨噬细胞(18]。天竺鼠腹膜巨噬细胞感染在体外由重组病毒通过反向遗传学和自适应变异VP24相同的那些发生在8 mc系列适应显示特征包含病毒核衣壳的包涵体。相反,没有典型的病毒核衣壳,但只有大量的蛋白质内含物被发现的野生型病毒感染的细胞,这与传染性病毒从这些细胞释放的缺乏。这些数据提出一个有效的野生型EBOV感染已经在主要的靶细胞,可能是VP24-mediated阶段的核衣壳装配/崭露头角的[18]。

因此,野生型的形态模式和适应EBOV感染豚鼠提示有病毒的能力建立的生产在巨噬细胞感染,尤其是在肝细胞中。未能大规模生产传染性野生型EBO病毒粒子可能进一步导致宿主防御成功阻断病毒传播感染锁在granuloma-like炎症病灶与随后的病毒清除。适应性突变EBOV基因组可以恢复病毒的繁殖能力的主要目标,巨噬细胞和肝细胞,因此,促进系统的受感染动物病毒的传播导致高毒性。适应的另一方面,这一机制将增加血液和肝脏改编病毒感染动物的病毒滴度,相比那些接种野生型病毒,这不是两个适应系列,6年级和GPA-P7。因此,应该有另一种毒性机制增加适应期间,相关的系列。形态学研究6年级和GPA-P7病毒感染,还没有作为,及其与前面描述的形态模式的感染,因此,有兴趣的。

5。血液、免疫、凝血的变化豚鼠感染病毒由野生型和改编

野生型EBOV感染导致严重的血液在其自然宿主畸变包括由于显著的嗜中性白细胞增多,频繁,在身患绝症的灵长类动物淋巴细胞减少。血小板减少症的发展在人类患者和实验感染患急病的灵长类动物出现出血性综合症。不像,嗜中性和中可以观察到淋巴细胞减少EBOV-infected豚鼠早在第二天p / i和进展的疾病。据报道,这些血液转变个人的规模受感染动物可以作为伟大> 3.5倍数量的增加中性粒细胞和淋巴细胞的数量> 3.0倍下降。这个发现似乎是有趣的,因为淋巴细胞不被EBOV感染在活的有机体内尽管淋巴坏死的进展,他们是由不同EBOV株抵抗感染在体外(7]。旁观者淋巴细胞凋亡,EBOV感染的一个重要特性在灵长类动物和老鼠,还未确定在豚鼠感染改编EBOV,以及[2]。淋巴坏死的机制和损耗发生在灵长类动物和豚鼠尚不清楚,但可能引起的事件造成大量巨噬细胞感染和改变淋巴组织的微环境。严重的血小板减少症(> 14倍,而preinfection水平)发展后,在7天的感染(前两天死在天9),类似的损失血小板在身患绝症的灵长类动物7]。

看来,白细胞计数应该小心,因为一个宽领域变化之间的不同类型白细胞动物及其实验豚鼠组自然(参见嗜中性粒细胞、淋巴细胞百分比报告组,21/77的数据从一个适应系列,57/38 (11])。因此,血液动力学指标的分析在不同段落的适应及其相关的临床过程EBOV疾病似乎更有效。

在我们的一个适应系列,杯子,我们专门研究不同血液指标的进化适应过程中(11]。在这个实验中,白细胞计数在章节1 - 3保持稳定,说明下通道4三倍下降显著,进一步适应保持较低水平。这篇文章也显著的嗜酸性粒细胞的第一次出现血样和突然(~ 8倍),虽然短暂,在单核细胞和浆细胞数量增加,在下一段回到基线值。同时,中性粒细胞的数量下降了20%,这一段(瞬变,恢复通道5),而年轻的百分比,非典型,总的来说,可能激活淋巴细胞显示瞬时增加通道4(也在通过5)回到基线值。有趣的是,这些变化后取得完整的杀伤力的适应EBOV通道3 (11]。

年轻thrombocytes证明三倍增加的百分比通道2和整体通道6的12倍。血小板总数保持稳定,直到突然下降(2倍)通道6。年轻thrombocytes的发生在早期的段落,在完全致命EBOV被选中之前,表明血小板的止血方面的重要变化,这导致血小板在接下来的段落的逐步丧失。

一个有趣的发现是EBOV适应红细胞形态学的变化。正常红细胞的比例逐渐减少在每个通道伴随echinocytes的发生和红细胞内含物,这表明出口未成熟红细胞的骨髓,显然,来弥补缺乏红细胞的有机体。发生echinocytes外周血中已经被发现在急性病毒性肝炎等病毒和炎症性疾病(22];然而,感染红细胞的参与到EBOV从来没有早些时候报道。

外周血数量的变化伴随着骨髓成分的变化,首先,爆炸的增加细胞最早通道2,达到顶峰的65 pro千通道5但进一步下降。这可能说明补充活化骨髓功能与随后的疲惫。巨核细胞计数开始增长通道2,通过5达到峰值,清楚地反映出向上的年轻thrombocytes动力学。

最后,中性粒细胞的吞噬作用被逐步减少从通道2,虽然中性粒细胞的数量是变量在不同的段落。相反,腹膜巨噬细胞的吞噬功能保持稳定6通道,然后突然下降(11,23]。

尽管许多血液指标的波动通过系列或改变在以后章节(允许排除新兴杀伤力的决定性作用适应EBOV),一些显然是伴随增加致病性甚至出现之前获得完整的致命性的病毒。包括年轻thrombocytes的百分比的增加以及越来越多的细胞和巨核细胞和嗜中性粒细胞的吞噬活动的减少,都开始早在通道2,与血液和组织病毒效价的大幅增长和第一个致命病例的发生接种动物。,因此,容易假设发展野生型EBOV获得新特点引发那些早期反应血液参数(11]。这些关键参数也改变始终在我们的其他适应系列,GPA-7,虽然它是相当不同的从上面的杯子实验中,由于病毒效价并非通过系列和完整的杀伤力已经收购了之后,在通过5与通道3杯子系列(8]。然而,中性粒细胞吞噬活动的减少也是早期响应出现在通道2,和积累的趋势非典型淋巴细胞明显在适应的过程中,可能由于凋亡、坏死过程发展。

一个相当有趣的免疫学发现缺乏相关性血液和腹膜肿瘤坏死因子水平和EBOV感染实验动物的致病性。这些豚鼠感染野生型Mayinga或致命的适应8 mc EBOV证明相似,而低,血液和肿瘤坏死因子TNF水平活动活动腹膜渗出液(表3)。相反,当兔子,这是完全抵抗EBOV感染,注射野生型EBOV,而高血清TNF活性检测早期(一天3 p / i)和逐渐增加的高值之后(天5和9 p / i)。在兔子,TNF活动也在腹膜渗出液中发现(表3)[23]。此前公布的数据报告的促炎细胞因子水平升高致命的野生型EBOV感染人类和非人类灵长类动物(24,25),在狒狒感染几内亚pig-adapted EBOV。高水平的肿瘤坏死因子-α生产外周血巨噬细胞感染在体外由另一个filovirus,马尔堡病毒,提出了马尔堡病毒感染的主要致病的因素引起出血性休克(由于其能力26]。因此,我们的数据在EBOV感染的动物模型中TNF活性(几内亚猪和兔子)矛盾的提出病因作用TNF-induced出血在灵长类动物感染。

自凝血障碍,如播散性血管凝固(DIC)或大量出血,EBOV疾病灵长类动物的标志是(27),考虑到之间的紧密和临床相关的相声凝固和补充系统(28,29日),似乎重要讨论补充的角色参与实验EBOV感染豚鼠。

补充活动的动力学在野生型EBOV-infected豚鼠和完整或EBOV-preimmunized动物感染致命的改编EBOV应变显示显著的不同,这可能是重要的理解EBOV-induced凝血障碍。在野生型EBOV-infected动物,补充活动显示了电导率剖面为期两天的延迟,第一,高4 - 7和第二峰值在天,低峰值在第9 - 10天。相反,在动物感染了致命8 mc应变,补充活动演示了一个快速峰值在24 h p /我随后突然下降2天,回到基线由4 - 5天,并进一步下降到9 - 11天的背景水平,其次是动物死亡。最后,豚鼠与formalin-inactivated preimmunized EBOV甚至致命的感染8 mc应变显示更急剧上升的补充活动第一天,更突然落在天2 p /我进一步下降到接近零值6天,白天也紧随其后的是动物死亡8(图4)。

补充活动的增长速率的致命感染豚鼠表明另一种补体激活途径的参与。另外preimmunized动物,经典的激活可以发生,由于anti-Ebola免疫球蛋白的存在,这可能是更高的补充活动的可能原因比没有免疫动物。另外,补体激活的慢动力学豚鼠感染不致命的应变表明经典激活与相对应的两座山峰IgM(第七天前)和免疫球蛋白生产(7 - 14天)。快速补体激活的替代途径似乎是一个独特的能力8 mc致命EBOV应变立即hyperactivate补充生产后续的快速和完整的疲惫的合成(30.]。重要的是,回顾性研究血清的天1和5,后来一个致命的感染病例的实验室人员EBOV事故显示了类似的模式的急剧增加和补充活动的立即下降,表明该数据的相关性对人类[12]。

有趣的是,血清循环免疫复合物浓度的模式(CICs)密切类似补充活动的动力学在完整和preimmunized致命感染动物,与典型的迅速崛起在第一天和立即下降到接近于零的值由天8 - 9和5 - 6完整或preimmunized动物,分别,紧随其后的是动物死亡。缓慢的中投和补充动力学也非常类似的非杀伤性EBOV感染豚鼠。循环免疫复合物的意义(CICs)埃博拉病毒病的发病机理仍有待研究[30.]。

因为没有凝血异常发生在mouse-adapted EBOV模型,这是一种急性病毒感染的小鼠模型的一般特征(19),几内亚pig-adapted EBOV仍然是一个独特的非灵长类模型研究EBOV-induced凝血障碍。

6。结论

自第一隔离野生型EBOV株,动物模型的问题研究生物学和治疗/预防这种感染变得明显。阻力最方便的啮齿动物模型动物(老鼠、几内亚猪,仓鼠,兔子)EBOV感染促使研究人员使用适应野生型EBOV菌株的小动物模型。实际上,EBOV适应豚鼠是第一个要实现更容易。几内亚的杀伤力pig-adapted EBOV变体的非人灵长类动物保持不变(31日]。EBOV适应通过系列的股票不同在这里描述一段历史和以前,完全的出现致命GPA-EBOV变体是容易实现7段落或更少。EBOV适应小鼠需要更多的努力(m .布雷,个人沟通)。在我们自己的尝试EBOV适应小鼠,矛盾不致命的毒株,这证明高级复制和持久性的病毒在动物的肝脏,而没有任何临床症状的疾病。历史上第一次GPA-EBOV应变指定8 mc最初是为疫苗开发和建立heterologic免疫球蛋白生产(32]。然而,它很快就意识到这种变体不仅代表了一个方便的小动物模型,但也提供了机会来比较野生型和改编EBOV菌株之间的遗传差异,建立遗传因素之间的相关性和新兴和发展新宿主的毒性和致命性16]。pathomorphologic的比较,免疫、血液,由野生型和凝固特性EBOV感染,病毒适应允许建立一个最重要的生理参数,影响EBOV的疾病(9,11,12,23]。

我们和其他能够证明突变EBOV VP24蛋白质是最重要的决定因素的病毒毒力和杀伤力8,9,16,18]。

需要复制的一致性过程发生在适应的过程中,建立适应过程的细节要求重复改编系列从病毒的股票不同的通道历史包括克隆EBOV股票。

溶血性补充活动的动力学的差异中发现感染豚鼠的野生型和改编EBOV压力使我们能够预测EBOV感染的结果在第一小时p /我30.]。

此外,我们的研究表明强烈抑制中性粒细胞的吞噬作用的感染豚鼠GPA-EBOV应变,而只有轻微的激活在5天的野生型EBOV感染。这表明EBOV在巨噬细胞的繁殖,一方面,同时抑制中性粒细胞,另一方面,结果扰动的嗜中性粒细胞/巨噬细胞相互作用的驱动力EBOV致命疾病。

另一个有趣的发现是年轻thrombocytes GPA-EBOV-infected动物的存在。缺乏的现象,在野生型EBOV-infected动物,连同骨髓巨核细胞数量的增加,可以激活的证据nonmature血小板的巨核细胞的造血和退出循环。

此前,促炎细胞因子水平升高的过程中已报告发生EBOV疾病和导致感染人类和额定马力的杀伤力,因为他们发展的角色EBOV凝血障碍。然而,矛盾的是,在豚鼠我们发现更高的(虽然可比)TNF -α水平在动物感染了致命的比那些感染了致命的改编EBOV野生型,因此,表明TNF参与GPA-EBOV发病机制的缺乏。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

承认

作者感谢教授l . v . Shestopalova她不可思议的帮助准备的电子显微镜图片用于本文的准备。

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