牛乳头瘤病毒1型分子和系统发育分析:第一份报告在伊拉克牛

文摘

本研究旨在提供的第一个分子描述牛乳头瘤病毒1型(BPV-1)在伊拉克。BPV是广泛分布在伊拉克牛和致癌病毒与良性和恶性病变的形成,导致明显的经济损失在奶制品和牛肉。在目前的研究中,140位皮肤乳头状瘤标本收集从牛在伊拉克中部。这些样本提交组织病理学检查、PCR和测序分析。组织病理学显示fibropapilloma标本之间的主要损伤类型。BPV-1 DNA检测样品(86.42%)的121年伊拉克牛疾病的主要病原体。部分序列E2, L2基因,并完成了E5基因序列存入基因库。系统发育分析证实BPV-1的存在和显示,感染可能是欧洲进口的牛的起源。获得一个完整的E5基因序列使我们进行结构预测。本研究提出的第一份报告BPV-1感染在伊拉克牛和有助于扩展的知识的起源这个疾病的传播。 The results of this study will aid in the development of appropriate control measures and therapeutic strategies.

1。介绍

牛乳头瘤病毒(BPV)包含一个双链,圆形,8 kb的DNA基因组。BPVs显示粘膜组织的趋向性和鳞状上皮和间质组织(1),与良性和恶性病变的发展(2,3]。尽管BPVs具有种特异性病毒、BPV-1 BPV-2, BPV-13可能感染马科动物以及牛和可能导致肿瘤的发展在这些物种4- - - - - -6]。十四BPV类型定义,分为四类:Xipapillomavirus,Deltapapillomavirus,Epsilonpapillomavirus,和Dyoxipapillomavirus(7- - - - - -9]。小膜相关蛋白,E5 BPV的主要改变蛋白质和拥有一个强大的生物效应10]。E5蛋白诱发细胞转换通过刺激血小板源生长因子受体β(PDGFβ- r) [11]。此外,减少的表达主要组织相容性复合体类我(MHCI)分子在细胞表面使病毒逃避免疫监视作用,导致胞内运输通过联接蛋白异常表达的抑制(5]。文献[12记录一个E5 / PDGF组成的三组分复杂βR / D单元体内。E5癌蛋白之前显示绑定到的proteolipidic D分量V1-ATPase质子泵。文献[12]表明E5 / PDGFβR / D单元复杂可能扰乱proteostasis,细胞器,胞质内稳态,可以导致自噬改变蛋白质降解和反应。文献[13)提出,E2作用BPV DNA复制起始的支持E1绑定到BPV起源通过DNA蛋白质和蛋白质的相互作用。E2是一种多功能蛋白,主要角色在基因组转录激活和维护,配合病毒E1解旋酶启动病毒DNA复制。BPV基因组包含17 E2绑定网站,主要集中在控制区域,和一个E1结合位点在病毒复制的起源14]。另一项研究,15]表明L2的重要参与蛋白质的包装BPV基因组内PV病毒粒子,包括交互L2蛋白与特定的DNA序列。

以前在伊拉克,我们组调查的方法在细胞培养BPV来自牛的皮肤疣收集建立细胞培养技术,使进一步的研究。从腹部皮肤细胞,脖子,乳房被培养,培养细胞显示上皮和间叶细胞形态。实现成功的长期文化,培养细胞被用来准备疫苗治疗乳头瘤BPV-infected牛(16]。黑白花牛和荷斯坦牛杂交的主要类型是黑白花奶牛品种牛在伊拉克和奶制品和牛肉产品的一个重要来源17,18]。牛乳头瘤样增生,造成BPV基因型,负责重大经济损失相关的生长迟缓,体重减轻,降低牛奶产量在BPV-infected动物(19]。由于这些原因,获得知识这种疾病在伊拉克的养牛人重要性。BPV的自然载体和主要来源是牛。病毒进入人体通过划痕或其他伤害,并通过都直接和间接接触感染发生。感染似乎是通过接触传播污染材料,挤奶机和精液。其他因素,包括营养不良、内分泌失衡,突变,和长期暴露在阳光下,会增加感染的风险在免疫缺陷的情况下(20.]。此外,外周血单核细胞被证明是一个水库BPV-1 BPV-2 DNA的影响动物(21]。

本研究旨在识别和描述BPV-1循环在伊拉克中部。这项研究的结果将帮助发展的适当的控制措施和治疗策略。

2。材料和方法

2.1。动物和样品收集

在这项研究中,140个皮肤乳头状瘤样本收集从140年在伊拉克中部农场的牛不同地区注册兽医(安巴尔省,巴格达迪城市)。研究样本包括奶牛患有牛乳头瘤样增生,被带到私人诊所被主人从2013年12月到2015年5月。研究标本收集在常规治疗和护理,以及通过网站访问选定的农场。收集到的样本有不同直径(从1到10厘米)和来自身体的不同部位(例如,乳房,乳头,腹部和背部)。每个样品立即被分为2部分,要么是冷冻在冰箱后续分子生物学分析或中性缓冲福尔马林固定在10%进行组织学分析。

2.2。组织病理学

组织样本被浸泡在福尔马林溶液和加工标准技术。样本切成5μ米厚的部分,放在幻灯片,用苏木精和伊红染色())。幻灯片在不同放大倍数在显微镜下进行评估。

2.3。聚合酶链反应

一个Bosphore®组织基因组人工DNA提取旋转工具(土耳其安纳托利亚Geneworks)和氧化镁®基因组DNA组织设备(自动化镁DNA提取机)(土耳其安纳托利亚Geneworks)被用于这项研究。工具被用来提取DNA从140年冰冻组织样本根据制造商的指示。为此,使用一套专门设计的引物对BPV-1(向前5′-AGGAGGGTCATGCTTTGCTC-3′;反向5′-GCTGTTCGGAGTGGTGTGTA-3′)获得847个基点的DNA片段。这些引物设计目标守恒的地区(相同的核酸序列)对齐下列BPV 1型完整的基因组(X02346, NC_001522、AB626705 JX678969)。这个新设计的引物是验证包括测试包容性和排他性。放大了使用SureCycler 8800热循环仪(美国安捷伦科技)在最后一卷25μ包含100 - 300 L ng DNA, MgCl 2毫米₂,1.25μL引物(0.5μ12.5 M),μL 1 x KAPA2G健壮HotStart ReadyMix (Kapa生物系统,开普敦,南非)。放大协议用于这项工作表所示1。PCR病毒DNA检测的产品含有溴化乙锭1.5%琼脂糖凝胶上电泳,放置在此种缓冲和运行在一个恒定电压(100 V)大约为35分钟。DNA使用视觉可视化凝胶文档系统(英国Scie-Plas)。消极的控制,从皮肤组织提取的DNA来自临床健康牛屠宰之前显示组织学和PCR分析负面结果。

2.4。测序

总共有121 BPV-1-positive标本(如由PCR),它被选为代表BPV的地理分布,证实病毒基因组测序类型。测序分析、PCR产品含有E2, E5,和L2基因纯化使用StrataPrep DNA凝胶萃取设备(美国安捷伦科技);测序进行国家检测中心的环境管理(NICEM),首尔国立大学农业与生命科学学院(韩国)。测序反应进行使用正向和反向引物在10μL反应总额(ABI BigDYE V3.1 Ready-Reaction设备;美国应用生物系统公司)根据制造商的建议。样本分析3730 xl DNA分析仪(美国应用生物系统公司)。正向和反向互补序列对齐使用猿(质粒编辑)软件(v2.0.49, 2015),和获得的结果提交给基因库和分析通过爆炸搜索(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库基因库。猿软件被用来检测相应的氨基酸序列。

2.5。系统发育分析

在这项研究中获得的序列被提交给系统发育分析。如上所述,生成的序列使用一套BPV-1-specific底漆,在基因库和产品都需要加入KT203919数量,连同以下所有13 BPV基因型参考菌株:BPV-1(加入X02346), BPV-2(加入M20219), BPV-3(加入NC_004197), BPV-4(加入X05817), BPV-5(加入AJ620206), BPV-6(加入AJ620208), BPV-7(加入DQ217793), BPV-8(加入DQ098913), BPV-9(加入AB331650), BPV-10(加入AB331651), BPV-11(加入AB543507), BPV-12(加入JF834523),和BPV-13(加入JQ798171数量)。序列使用猿软件保持一致。识别分析序列之间的进化关系,系统发育分析通过neighbor-joining方法使用大型软件版本6 (22]。

2.6。蛋白质结构

研究蛋白质结构对应于测序基因,我们使用了I-TASSER服务器,这是一种基于internet的软件产品,使蛋白质结构和功能预测。I-TASSER允许自动生成高质量的预测蛋白质分子的三维结构和生物功能基于他们的氨基酸序列23,24]。

3所示。结果

3.1。组织病理学

所有140年收集的样品可能是临床所描述的多个外部生长的疣(图的存在1(一))。他们中的大多数位于头部和颈部(46.6%)、乳房和乳头(19%)、腿(16%),和背部和腹部(18.4%)。组织病理学检查表明,样本fibropapilloma。在数据1 (b)和1 (c)、表皮和真皮并指(乳头状预测)的代表样本所示。成纤维细胞增殖、胶原沉积和淋巴细胞浸润观察(图1 (d))。此外,koilocytes角质细胞的细胞核周围的光环或肿胀、明显的细胞质和细胞核固缩的在场(数字1 (e)和1 (f))。

3.2。聚合酶链反应

BPV-1 DNA检测在121年140年收集的乳头状瘤样本。BPV-1-positive样品生产847个基点的DNA片段长度对E2, E5,和L2基因,使用BPV-1-specific引物(图放大2)。PCR分析表明,86.42%的分析引起牛papillomatoses BPV-1评估伊拉克牛的数量,包括进口品种和杂交在伊拉克中部长大。

3.3。测序

测序分析进行PCR产品E2, E5, L2基因放大从收集到的样本显示相同的序列。结果证实BPV-1的存在,97%的身份对于大多数NCBI BLAST-searched BPV-1序列。当我们使用BPV-1-specific引物来扩增DNA提取的样本,BPV-1发现在所有的主要基因型121 BPV-positive(100%)牛疣组织样本。这一发现是第一组确认存在的BPV-1作为牛乳头瘤样增生的主要病原体在伊拉克牛在伊拉克中部地区。

3.4。系统发育分析

系统发育树是利用基因组序列检索生成,并沉积在加入针对13 BPV KT203919和分析基因型参考序列(图3)。BPV-1主要BPV基因型鉴定(121个样本)。一致的样本序列分为BPV-1(属Deltapapillomavirus)。对齐序列显示高相似的核苷酸序列BPV-1(加入X02346)和一系列BPV隔离来自日本(加入AB626705)。

我们能够获得一个完整的E5基因序列,我们翻译成氨基酸序列,加入我们存入基因库ALB72915数量。氨基酸序列mpnlwfllfl glvaamqlll llfmllfflv ywdhfecscs nlpf。爆炸NCBI数据库的搜索使用确定伊拉克BPV-1改变蛋白质E5序列显示有100%的身份与BPV-1 E5序列从南非获得sarcoid-affected斑马(加入ACR09659)和98%的身份与BPV-1 E5序列获得的马肉质的英国(加入AAP69967)。距离树使用NCBI数据库创建的,它证实了这些结果(图4)。

3.5。蛋白质结构

完整的氨基酸序列的蛋白质结构改变的跨膜蛋白E5孤立伊拉克BPV-1分析使用I-TASSER服务器,一个基于互联网的软件程序,可以用于生成蛋白质结构和功能预测。I-TASSER生成高质量的预测蛋白质分子的三维结构和生物功能基于氨基酸序列(图5(一个))。在此基础上分析,一个配体结合网站预测PDGF E5,促进其绑定β- r(图5 (b))。

4所示。讨论

在当前的工作中,临床和组织学检查确诊病例的牛乳头瘤病进行了研究,识别和描述的BPV-1基因型是最常见的在伊拉克中部地区,这是一个大型畜牧农场的主要位置。BPV-1基因型的识别和描述出现在这个地区对有效的疾病控制很重要。我们使用genotype-specific引物识别和描述BPV-1经测序和系统发育分析,它被认为是最好的方法根据文献[这些目的25,26]。

组织学结果显示疣标本在本研究评估皮肤fibropapillomas,显示乳头瘤样增生为特征的描述Zachary和McGavin27]。在我们的分子分析,BPV-1 DNA中检测出121个样本。扩增子通过PCR反应是提交测序和发现是相同的,确认BPV-1的存在,属于属Deltapapillomavirus。目前的研究显示,高致病性BPV-1普遍在伊拉克;这个基因型与皮肤乳头瘤病的发展(fibropapilloma) [28]。我们所知,这是第一个研究报告BPV-1在伊拉克的存在。

在目前的调查,我们可以得到一个完整的E5基因序列。有趣的是,基于距离分析,这个序列被发现展览E5氨基酸序列高度相似性,孤立从南非斑马和马肉质的在英国。这些结果表明疾病传播的可能性,通过英国军队马在1920年代当他们出现在伊拉克。另一个可能性是在伊拉克BPV-1起源于牲畜从其他国家的进口,因为荷斯坦牛黑白花奶牛(17,18大量进口到伊拉克。最高度保守的E5 Fibropapilloma病毒编码蛋白(29日]。描述BPV-1, E5蛋白质的结构及其配体结合网站预计使用一个特殊的程序。E5是已知最小的癌蛋白调节细胞转换。这种调节是通过激活PDGFR——实现β(30.]。E5蛋白形成二聚体在改变了受感染的细胞。二聚体包含一个membrane-spanning段,直接绑定到PDGF的跨膜域β- r。这个绑定然后诱导受体二聚、自身磷酸化和持续的促有丝分裂的信号(3,31日]。BPV-1 E5蛋白已被证明是本地化fibropapilloma内改变基底角质细胞组织(32]。针对E5为一个可能的治疗的代理也被描述(10]。因此,研究这种蛋白质是重要的以及其他病毒蛋白质更好地理解的致癌分子通路比如Calpain 3表达papillomavirus-associated牛的膀胱移行细胞癌(33]。

目前的研究是第一个针对伊拉克中部BPV-1基因型的检测和表征。这项研究的结果对协助发展的很重要的预防和治疗措施,减少在伊拉克与牛乳头瘤样增生相关的经济损失。

伦理批准

在这项研究中使用的动物被定义为“农场动物,”和没有进行实验工作;因此,批准不需要从IACUC或伦理委员会。动物的主人为这些研究提供了权限。伦理委员会在伊拉克癌症中心和医学遗传研究回顾了工作和批准豁免。

信息披露

本研究是在实验进行治疗部门,伊拉克癌症和医学遗传研究中心Al-Mustansiriya大学,伊拉克的巴格达。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

引用

1. s . Shafti-Keramat c . Schellenbacher a Handisurya et al .,“牛乳头瘤病毒1型(BPV1)和BPV2是密切相关的血清型,”病毒学,卷393,不。1、1 - 6,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. s . Roperto r·布朗f·保利et al .,“检测牛乳头瘤病毒2型牛外周血的膀胱肿瘤:可能的生物作用,”普通病毒学杂志,卷89,不。12日,第3033 - 3027页,2008年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. k . Talbert-Slagle和d . DiMaio”牛乳头状瘤病毒和PDGF E5蛋白质β受体:探戈需要两个,”病毒学,卷384,不。2、345 - 351年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. f . Bocaneti g . Altamura a . Corteggio e . Velescu f . Roperto和g . Borzacchiello“牛乳头状瘤病毒:洞察一个古老的疾病,”跨界和新兴疾病,卷63,不。1、5、2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. a . Corteggio g . Altamura f . Roperto, g . Borzacchiello“牛乳头瘤病毒E5, E7癌基因蛋白在自然发生的肿瘤:是两个比一个?”传染性病原体和癌症第一条,卷。8日,2013年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. m . Lunardi b . k . de阿尔坎塔拉,r·a·a . Otonel w·b·罗德里格斯a . f . Alfieri a和a . Alfieri“牛乳头状瘤病毒类型13 DNA在马肉质的,”临床微生物学杂志,51卷,不。7,2167 - 2171年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. g . Borzacchiello和f . Roperto牛乳头状瘤病毒和癌症腹泻牛”,兽医研究,39卷,不。5、2008年p。19日。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. m . Lunardi a . a . Alfieri r·a·a . Otonel et al .,“小说牛乳头状瘤病毒的遗传特性的成员Deltapapillomavirus属”,兽医微生物学,卷162,不。1,第213 - 207页,2013。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. j·s·芒迪:汤姆森,m . Dunowska c . g .骑士,r·e·劳里和山,“猫sarcoid-associated乳头瘤病毒的基因组描述并提出分类为牛乳头状瘤病毒类型14日”兽医微生物学,卷177,不。3 - 4、289 - 295年,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. a . Venuti f .保利·l·纳西尔et al .,“乳头瘤病毒E5:最小的癌蛋白具有许多功能,“分子癌症第140条,卷。10日,2011年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. s . Roperto g . Borzacchiello。埃斯波西托et al .,“生产牛乳头状瘤病毒感染2型怀孕牛胎盘的影响与膀胱肿瘤,”《公共科学图书馆•综合》,7卷,不。第三条ID e33569, 2012。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. s . Roperto诉Russo g . Borzacchiello et al .,“牛乳头瘤病毒2型(BPV-2) E5癌蛋白结合的亚基D V1-ATPase质子泵在天然的膀胱移行细胞肿瘤牛,”《公共科学图书馆•综合》,9卷,不。2篇文章ID e88860 2014。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. Y.-S。Seo, f·穆勒,m . Lusky et al .,“牛乳头状瘤病毒(BPV)编码的E2蛋白增强了绑定的E1蛋白BPV复制起源,”美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国,卷90,不。7,2865 - 2869年,1993页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. s . m . Melanson博士和e . j . Androphy地形的牛乳头瘤病毒E2蛋白在病毒基因组在细胞周期中,“病毒学,卷393,不。2、258 - 264年,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. K.-N。赵,X.-Y。阳光、i . h·弗雷泽和j .周”DNA包装由L1和L2牛乳头状瘤病毒的衣壳蛋白1型,”病毒学,卷243,不。2、482 - 491年,1998页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. m·a·哈马德a s banna, n . y . Yaseen”从疣的牛乳头状瘤细胞培养建立。”安巴尔兽医学杂志》上4卷,第81 - 77页,2011年。视图:谷歌学术搜索
17. f·r·Al-Samarai n n Al-Anbari, y . k . Al-tmimi“黑白花牛的繁殖性能遗传学方面,伊拉克兽医杂志》上,30卷,第107 - 95页,2006年。视图:谷歌学术搜索
18. m . Al-Kinani a . a . Al-Zahir和m . Al-Baiti”之间的关系的研究的一些环境条件在某些生理血液学的十字面包黑白花牛黑白花奶牛奶牛,”伊拉克兽医杂志》上卷,34岁,15至21,2010页。视图:谷歌学术搜索
19. 欧盟d·桑托斯·m·a·r·席尔瓦n . e .连接部分et al .,“检测不同的牛乳头状瘤病毒类型和合并感染牛的血液,”跨界和新兴疾病,卷63,不。1,pp. e103-e108, 2016年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. c·j·林赛·m·e·阿尔梅达c . f . Vicari et al .,“牛乳头状瘤病毒DNA在牛奶、血液、尿液、精液、精子的牛papillomavirus-infected动物,”遗传学和分子研究,8卷,不。1,第318 - 310页,2009。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. 布兰德,r . Haralambus a . Schoster r . Kirnbauer和c•斯坦内克”外周血单核细胞代表牛乳头状瘤病毒DNA的水库sarcoid-affected马,”普通病毒学杂志,卷89,不。6,1390 - 1395年,2008页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. k . (g . Stecher d·彼得森a . Filipski和s . Kumar“MEGA6:分子进化遗传学分析6.0版”,分子生物学与进化,30卷,不。12日,第2729 - 2725页,2013年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. 严r . j .杨,a·罗伊·d·徐,j .泊松和y张“I-TASSER套件:蛋白质结构和功能预测,“自然方法,12卷,不。1、7 - 8,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. y张“I-TASSER服务器对蛋白质三维结构预测,“BMC生物信息学第四十条,卷。9日,2008年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
25. r·p·Araldi r·f·卡瓦略t·c·梅洛et al .,“在牛肉牛乳头状瘤病毒:首先描述BPV-12和假定的类型BAPV8在巴西,“遗传学和分子研究,13卷,不。3、5644 - 5653年,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
26. a . Grindatto g·费拉罗,k Varello et al .,“分子和组织学特征的牛乳头状瘤病毒在西北意大利,“兽医微生物学,卷180,不。1 - 2、113 - 117年,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
27. j·f·扎卡里·m·d·McGavin,动物疾病的病理基础爱思唯尔健康科学,费城,宾夕法尼亚州,美国,2013年。
28. f .内克和r . Tachezy皮肤乳头瘤病牛。”比较病理学杂志,卷132,不。1,第81 - 70页,2005。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
29. k . Van Doorslaer“进化的乳头,“病毒学,卷445,不。1 - 2、11日至20日,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
30. a . l . Halpern和d . j . McCance“乳头瘤病毒E5蛋白质,”转换第五十二条,卷。9日,1996年。视图:谷歌学术搜索
31. d . DiMaio和l . m . Petti E5蛋白质。”病毒学,卷445,不。1 - 2、99 - 114年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
32. 美国伯内特:Jareborg, d . DiMaio“本地化的牛乳头瘤病毒1型E5蛋白质转换基底角质细胞和宽容fibropapilloma分化细胞组织,”美国国家科学院院刊》上的美利坚合众国,卷89,不。12日,第5669 - 5665页,1992年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
33. s . Roperto r·德·图里奥,c . Raso et al .,“Calpain3表达在papillomavirus-associated proteolitically活性形式的膀胱移行细胞肿瘤牛,”《公共科学图书馆•综合》,5卷,不。4篇文章e10299 2010。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

版权

版权©2016年穆罕默德·a·哈马德et al。这是一个开放的分布式下文章知识共享归属许可,它允许无限制的使用、分配和复制在任何媒介,提供最初的工作是正确引用。