肠道病毒的直接探测和识别健康的尼日利亚儿童粪便的使用细胞培养独立RT-Seminested PCR分析

文摘

最近,肠道病毒的细胞培养独立协议检测临床标本是推荐的监测与先前建立的协议。在这里,我们调查是否这个新协议将显示相同的肠病毒多样性景观建立细胞培养相关的协议。收集的粪便样本60显然健康儿童在伊巴丹,尼日利亚。样本resuspended在磷酸缓冲盐,RNA提取,VP1基因放大使用世卫组织建议RT-snPCR协议。扩增子测序和序列进行系统发育分析。15(25%)的60个样本产生预期的乐队的大小。15的扩增子测序,12是可利用的。其余3重复了多个山峰unexploitable。十一12的可利用的序列被确定为柯萨基病毒A1 (CVA1) CVA3, CVA4, CVA8, CVA20,艾柯病毒32 (E32),肠道病毒71 (EV71), EVB80, EVC99。随后,最后利用序列被确定为enterobacteriophage底板基因的核苷酸。 The results of this study document the first description of molecular sequence data on CVA1, CVA8, and E32 strains present in Nigeria. The result further showed that species A enteroviruses were more commonly detected in the region when cell-culture bias is bypassed.

1。介绍

肠病毒感染与数组有关的临床表现,从无菌性脑膜炎在1型糖尿病急性弛缓性麻痹(AFP)等(1]。然而,这些临床表现感染肠病毒感染的代表< 10%的实际负担,估计每年大约10 - 15百万病例数量仅在美国(2]。剩下的超过90%的感染是无症状(3]。

肠道病毒是nonenveloped病毒直径20 - 30 nM。在病毒粒子是一个积极的意义上,单链RNA基因组,长约7500元。基因组有一个开放阅读框(ORF),多蛋白产品是autocatalytically裂解成结构(VP1-VP4)和非结构化(2 a-3d)的蛋白质。子是在两端未翻译区(utr)和多聚腺苷酸尾3′端。

肠道病毒属肠病毒在家庭中引起,Picornavirales秩序。肠道病毒分类是基于病毒粒子粒子结构、组织文化生长属性和发病机制在人类和动物4]。然而,现在分类是基于病毒基因组学(4),尤其是发展史的VP1蛋白(5- - - - - -16]。基于最近的分类(http://www.picornaviridae.com/),有12种的属,四(肠病毒物种一个物种D [EVA-EVD]),以前被称为“人类的肠道病毒。“在写这篇文章的时候,伊娃含有25种血清型的11个患者,10编号的肠道病毒,和四(4)从非人灵长类动物肠道病毒分离。EVB含有63种血清型组成的一(1)脑血管意外,六(6)CVBs 28艾柯病毒,27个编号的肠道病毒,和一个从非人灵长类动物(1)肠病毒分离。EVC包含23种血清型组成的九(9)脑血管意外,三(3)脊髓灰质炎病毒血清型,11(11)编号的肠道病毒。EVD包含五(5)组成的血清型肠道病毒(编号http://www.picornaviridae.com/)。

除了这一事实EVB最高数量的血清型,也是最常检测(15- - - - - -21]。然而有人认为这种现象(称为EVB偏见)可能是一个战略的产物用于肠病毒隔离和可能不是真正的代表肠病毒多样性景观(21,22]。

几乎所有先前的研究记录肠病毒多样性在尼日利亚(15,16,23,24]显示EVB的优势。然而,所有这些研究都基于细胞培养,主要使用了RD细胞系已建议EVB偏见(15- - - - - -21),对肠道病毒隔离。不同的研究才(22]MCF 7和LLC-MK2细胞株用于肠病毒隔离和记录的增加肠病毒物种的检出率C (EVC)成员。

最近,Nix et al。(25)细胞培养独立协议建议直接从临床标本检测肠道病毒(4)对肠病毒监测与先前建立的协议(26,27]。在这项研究中,我们调查了这个策略是否会显示相同的肠病毒多样性景观建立细胞培养相关的协议(26,27尼日利亚西南部]和文档的eva。

2。方法

2.1。样本收集和存储

收集的粪便样本60(男= 37岁女= 23)看似健康的1到10岁儿童参加公立小学在伊巴丹,尼日利亚。从学生收集的样本获得批准和同意后从学校管理和《卫报》或孩子的父母,分别。从每个孩子的粪便样本收集到适当标签无菌收集瓶子。样本被送到实验室的病毒学,医学院大学医院,伊巴丹,尼日利亚,冷却器装满冰块保持大约4°C的温度。在到达实验室,粪便样本存储在−20°C到分析。

2.2。样品处理

约1克的每个粪便标本稀释3毫升磷酸缓冲盐(PBS), 1毫升氯仿,一克玻璃珠子。混合物被漩涡20分钟,之后在3000转离心20分钟。随后,2毫升的上层清液在1毫升卷成cryovials整除。一个瓶是储存在−20°C,另一是进一步分析。

2.3。RNA提取和互补脱氧核糖核酸的合成

JenaBioscience RNA提取工具包(Jena生物科学,耶拿,德国)是用于病毒RNA提取根据制造商的指示。脚本互补脱氧核糖核酸合成装备(Jena生物科学,耶拿,德国)用于根据制造商的指示互补脱氧核糖核酸的合成。然而,而不是随机五个一、引物AN32 AN33, AN34, AN35 [25)被用于互补脱氧核糖核酸的合成。

2.4。肠病毒VP1基因Seminested PCR (snPCR)测定

引物是在25岁μM浓度和PCR是在30完成的μL反应。第一轮PCR包含2μL的引物224年和222年(Nix et al ., 2006), 6μL的红色负载Taq 10μL (cDNA, 10μL RNase-free水。热循环中完成Veriti热循环(美国应用生物系统公司,加州)。热循环条件94°C 3分钟紧随其后的是45周期在94°C 30秒,30秒42°C, 60°C与坡道60秒的40%来自42°C到60°C。这是紧随其后的是72°C 7分钟,举行4°C到被终止。与第一轮第二轮PCR进行PCR产物为模板,类似热循环条件下,除了扩展时间减少到30秒,和引物代替AN89和AN88 [25),分别。随后,PCR产品解决在2%琼脂糖凝胶用溴化乙锭染色的,是通过紫外线透照器查看。

2.5。核苷酸序列

扩增子都运到Macrogen Inc .,首尔,韩国、净化和测序的预期大小的乐队。引物AN88和AN89用于测序。后来,肠病毒的基因工具(28)是用于肠病毒物种和基因型的决心。

2.6。系统发育分析

使本研究中描述的序列与参考序列从基因库,下载ClustalW项目大型5软件(29日)是使用默认设置。后来,neighbour-joining树构造与Kimura-2参数模型(30.5]和1000年引导复制使用相同的大型软件。

2.7。加入核苷酸序列号码

所有的序列在本研究报告已经沉积在基因库KT717062-KT717072加入数字。

3所示。结果

3.1。RT-snPCR结果

总共15(25%)的六十(60)粪便样本筛选产生预期的乐队为肠道病毒VP1基因检测RT-snPCR屏幕大小(表1)。37岁和23个样本收集的男性和女性参与者,分别11(29.73%)和4(17.39%)产生了预期的乐队(表大小1)。

3.2。病毒识别

15的扩增子进行测序,只有12是可利用的。其余3人unexploitable由于重复的多个峰值的出现。11(11)12成功利用序列类型的工具型肠道病毒(废气温度)柯萨基病毒A1 (CVA1)(1株)CVA3(1株)CVA4(1株)CVA8(2株),CVA20(1株)艾柯病毒32 (E32)(1株),肠病毒A71 (EVA71)(2株),EVB80(1株)和EVC99(1株)(表1)。随后,最后利用序列受到爆炸搜索和发现最类似于一个enterobacteriophage底板基因(表1)。基于11(11)类型的菌株,肠病毒物种A, B, C和D占54.55%,18.18%,27.27%,0%的菌株。

3.3。系统发育分析

CVA1,获得的序列从基因库和本研究中描述的一个集群分成五个不同的组,并有很强的引导支持(图1(a))。尼日利亚的CVA1序列描述的起源研究集群与欧亚大陆(图序列1(a))。在CVA3 phylogram,有三个不同的集群,并有很强的引导支持(图1(b))。集群内2,在本研究发现尼日利亚CVA3集群与另一个CVA3之前检测到2003年在尼日利亚(15)(图1(b))。就像CVA3,尼日利亚CVA4在这项研究中发现集群与另一个CVA4之前2003年在尼日利亚发现(15)(图1(c))。

本研究中描述的两个CVA8序列集群,具有较强的引导支持。这些CVA8序列似乎没有太密切相关的任何CVA8序列在phylogram(图2(一个))。CVA20序列描述在这项研究中,另一方面,没有集群与先前2012年在该地区发现(图2 (b))。相反,它与其他集群CVA20序列最近在中非共和国(描述19)和喀麦隆(21)(图2 (b))。

E32序列描述在这个研究没有集群与其他E32序列描述最近在中非共和国(19)和喀麦隆(21)(图3(一个))。相反,它聚集与E32序列中描述最近印度(31日]。另一方面,EV71病毒序列中描述这项研究集中在一起,并有很强的引导支持在基因型E(图3 (b))。虽然这只基因型由序列来自撒哈拉以南非洲的15,19,21),本研究集群中描述的EV71病毒序列与EV71来自喀麦隆(21]在以前描述的EV71在尼日利亚2004集群与中非共和国(19)(图3 (b))。

单一EVB80序列中描述这项研究集群,具有较强的引导支持,我们2014年在尼日利亚最近发现孩子与他人诊断为法新社(未发表的数据)。与EVB80情况相反,本研究中描述的EVC99序列不同于我们2014年在尼日利亚最近发现孩子被诊断为法新社(未公开的数据)。虽然他们都是2014年在尼日利亚发现,他们似乎最密切相关EVC99序列来自喀麦隆(21),但不同的基因型。

4所示。讨论

4.1。肠病毒检出率

考虑到只有十一的样品可以明确显示包含肠道病毒,这项研究的结果显示肠病毒检出率为18.3%(11/60)在伊巴丹看似健康学龄儿童中,尼日利亚西南部。这是高于先前的研究中描述的5.5%和10%从西南部明显健康学龄儿童15东北部]和[24尼日利亚,分别。这可能反映了使用不同的检测协议的影响。而直接检测临床样本的肠病毒基因组在这项研究中,使用其他研究[15,24)使用细胞培养的基础算法,特别是RD和L20b细胞系,正如前面推荐的人(27]。因此这可能表明,细胞培养独立的协议Nix et al。25)肠道病毒的直接检测临床标本可能更敏感比那些基于细胞培养的协议27]。然而,这样的结论不能达成明确,因为样品分析在这项研究中没有同时使用基于RD和L20b细胞株的筛选和细胞培养独立的协议。

4.2。肠病毒物种多样性景观

这项研究的结果表明,物种检测到肠道病毒更常见(54.55%)比其他肠道病毒物种(表的成员1)。这与以前的研究结果从该地区15,16,23,24)给人的印象,物种B肠道病毒是最常见的循环。的真正含义和意义这一矛盾是很难确定的,考虑到相同的样本不受细胞培养使用先前记录的协议。然而,这一发现可能是更好的描述该地区肠病毒多样性景观,因为它绕过了细胞培养的偏见。

但是可以认为肠病毒多样性景观的图片画的细胞培养独立分析可能只是反映了特异性引物。因此,景观的倾斜对物种的成员可能不是真实反映景观多样性。然而,考虑到,而不是物种A, C和D都分别有少于30种血清型记录,物种B有超过60种血清型记录(http://www.picornaviridae.com/),更多的物种B成员将被认为是在引物设计过程中(7,9,25,32]。因此,引物应偏向物种B而不是其他物种。因此,优势物种的肠病毒成员在这个人口不太可能由于底漆的偏见。

4.3。肠病毒血清型检测

这项研究的结果显示存在的九(9)不同血清型的nonpolio肠道病毒(CVA1、CVA3 CVA4, CVA8, CVA20, E32, EVA71, EVB80,和EVC99)在看似健康,学龄儿童在伊巴丹,尼日利亚西南部,2014年(表1)。本研究文件的第一个描述分子序列数据CVA1, CVA8, E32菌株出现在尼日利亚。虽然这也是第一次出版的分子序列数据EVB80 EVC99从尼日利亚,我们曾发现EVB80 EVC99儿童在2014年与法新社(未公开的数据)。此外,我们先前描述CVA20 2012年在环境样品(33]至于CVA3 CVA4, EV71毒株的分子序列数据循环十(10)多年前曾描述(15]。

4.4。肠病毒区域约束假说

2004年在尼日利亚EV71病毒基因型的发现E (15,23)和更多的成员的后续检测基因型在中非共和国(19)和喀麦隆(21)导致假设某些肠道病毒株循环在撒哈拉以南非洲可能局限于该地区(区域约束假说(RCH))。最近发现的EV71病毒基因型F在马达加斯加34)进一步支持读出校验这是假定数据缺乏肠病毒基因型循环在该地区可能负责延迟发现这些EV71病毒基因型(19,21]。然而,随后的发现EV71病毒基因型F,它最近表明,基因型可能背离他们的独立,最近共同祖先在1990年代(34]。

EV71病毒株在这项研究中发现属于基因型E(图3 (b)),进一步证实了读出校验此外,CVA3(图1(b)), CVA4(图1(c)), CVA20(图2 (b)),和EVC99(图4 (b))也显示读出校验的证据来支持然而,尽管区域限制,实际的EV71病毒进化枝恢复2004年在尼日利亚似乎是被一种新的进化枝(图所取代3 (b))。在类似的光,尽管区域局限,EVC99应变在这项研究中发现不同于我们最近发现孩子患有法新社(未发表的数据(图)4 (b))。这因此建议同时流通的两个截然不同的演化支EVC99。另一方面,基因型替代已经观察CVA20(图2 (b))。然而,同样不能说CVA3和CVA4由于缺乏分子序列数据从该地区在这些基因型。虽然CVA3的隔离和CVA4在这项研究中发现类似发现在10年前从同一地区(数字1(b)和1(c)),描述更孤立的几年将有助于更好地理解这些血清型的演化动力学。

E32隔离中描述这项研究似乎更接近隔离来自东南亚比撒哈拉以南非洲地区(图3(一个))。一方面,这电话问题读出校验然而,另一方面,它带来的另一个突出的underdiscussed问题有关肠病毒识别,给新人一些头痛。VP1基因的序列通常用于肠病毒识别。然而,尽管最合适的策略将会放大整个VP1基因,大部分协议放大5′-或3′端。对于新手来说,这可以很困惑是否偏VP1基因的5′-或基因的3′端。然而,肠病毒的基因工具(28)有助于解决这个问题通过物理位置的图形视图在任何VP1基因(完全或部分)提交的查询序列,从而帮助确定问题是完整的基因序列或基因的5′-或3′端(表2(一)和2(b))。

Nix et al。(25协议是一个升级Oberste et al。(7,9)协议和放大VP1基因的5′端。因此,使用这个协议只能生成序列相比使用类似的协议生成放大VP1基因5′端或完成。序列从协议生成的3′端放大VP1基因像Oberste et al。6),卡萨斯等。10),卡罗et al。12)或任何迭代这些都是没有任何价值的系统发育分析VP1基因序列生成使用Nix et al。(25)协议。这是因为它不可能使部分VP1序列生成使用Nix et al。(25协议与协议,扩大基因的3′端。

有大量的这类序列在基因库和一些撒哈拉以南肠病毒序列属于这一类与来自世界其他地区(表2(一)和2(b))。这种二分法破坏能力更好的调查RCH手头的数据,需要需要一眼的采纳和使用Nix et al。(25不放大的)协议和其他协议的整个VP1基因的研究集中在调查读出校验这种二分法占E32为什么菌株的区域限制,以及CVA1 CVA8, EVB80,在这项研究中发现无法详尽决定尽管撒哈拉以南非洲毒株序列数据的可用性的核苷酸数据库。因此,其他细胞培养独立协议等肠道病毒的直接检测临床样本ECRA最近被Arita et al。35],它有能力扩大完整的VP1基因,应该进一步调查和负担得起的和现场部署的开发工具,尤其是在资源有限的设置。

4.5。与合并感染时,会发生什么?

后续完成的这项研究中,观察到,在肠病毒合并感染的情况下,拒绝et al。(25)协议往往会放大的最普遍的基因。例如,当进一步筛选与肠道病毒物种特定的引物,这是发现,样本数量45(表1)也有EVB88(未公开的数据)。这是完全错过了Nix et al。(25]panenterovirus RT-snPCR屏幕。另一方面,Nix et al。(25]panenterovirus RT-snPCR屏幕并不是完全可靠的。失败的试验放大感兴趣的基因不应被视为绝对确定性的病毒样本是负的利息。例如,在另一起事件中,Nix et al。(25]panenterovirus RT-snPCR屏幕未能放大VP1基因从一个肠病毒隔离恢复RD细胞线在我们的实验室。然而,当物种B和C特定RT-snPCR化验,艾柯病毒6 (E6)和脊髓灰质炎病毒1 (pv)检测,分别。因此,这么有价值的分析是,它也有它的弱点。因此,策略仍然需要被开发来提高其灵敏度以及将其集成到已经建立肠病毒隔离协议(26,27]。此外,Nix et al。(25)协议持续放大一个enterobacteriophage尾巴基因(表1)的一个乐队的大小相似,肠病毒。因此,存在一个乐队在预期的范围内进行解释时应特别谨慎等待扩增子的测序。

4.6。结论

这项研究的结果显示CVA1, CVA3, CVA4, CVA8, CVA20, E32, EVA71, EVB80, EVC99在伊巴丹,2014年,尼日利亚西南部。它从而文档的第一次描述分子序列数据CVA1, CVA8, E32菌株出现在尼日利亚。这进一步表明,物种肠道病毒在细胞培养时更常见的在该地区发现的偏见是忽略。这项研究的结果证实,肠道病毒可以直接从粪便悬架中发现使用Nix et al。(25)协议提出的肠病毒监测指南(4]。此外,产生的扩增子从Nix et al。25]panenterovirus VP1 RT-snPCR化验是充分的肠道病毒的序列和识别存在于这样的样本。它进一步表明,Nix et al。(25)协议往往会放大时的最普遍的基因混合物存在和失败的试验放大感兴趣的基因不应被视为绝对确定性的病毒样本是负的利息。

伦理批准

任何信息,可以用来识别参与者在这个研究包括在本文中。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

(1)研究设计是由Temitope Oluwasegun矶法Faleye,摩西Olubusuyi Adewumi,和约翰逊Adekunle阿德尼吉。(2)样本集合是由Bamidele Atinuke科克和Felix Yasha Nudamajo。(3)试剂和实验室的收购和数据分析是所有作者的责任。(4)Temitope Oluwasegun矶法Faleye写论文的初稿。(5)所有作者修正。(6)和所有作者阅读和批准了最终稿。

确认

作者要感谢这项研究的参与者,他们的学校管理人员,和/或监护人的父母为他们的合作研究的整个时期。

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