文摘
研究了植物生产制药化合物二十多年了。自从工厂生产家禽疫苗新城鸡瘟病毒做了一个突破,获得监管部门的批准,研究利用植物疫苗对动物蛋白质的表达和交付进一步加强。事实上,在兽医疫苗的生产成本高,植物代表吸引力biofactories和提供了许多有前途的优势生产重组蛋白疫苗。此外,进行免疫原性和挑战的可能性研究目标动物大大夸大了进步。虽然没有食用共生产出动物疫苗市场,植物疫苗技术有巨大的潜力。综述、开发、使用和植物在各种表达重组蛋白生产平台的优点进行了讨论。此外,植物动物疫苗的例子显示强劲的迹象的功效在动物疾病预防也进行了描述。
1。介绍
植物分子农业是一个术语,用来描述的应用分子生物学技术在植物商业产品的合成,其中包括多种碳水化合物,脂肪,蛋白质,以及辅助产品(1]。制造一种植物疫苗的过程在植物的绿色工厂开始感兴趣的目标抗原的选择。候选疫苗是克隆植物表达盒,能够促进和终止转基因表达。表达盒然后被发送到工厂的生产重组蛋白(2]。
交付一个表达式盒式携带该基因的利益转化为植物细胞可以通过稳定或瞬态转变。瞬时基因表达是一个快速和方便的系统验证和描述的目标基因产物。尽管,现在常规实践分子农业的生产外源蛋白(3]。避免了长时间的发展过程和低蛋白质积累水平与转基因植物的使用。此外,外源蛋白生产只是暂时的,它不需要选择方法来识别转化植物细胞。瞬时表达系统相比,主要优点稳定的转基因线是候选基因序列整合到植物基因组,从而获得蛋白质生产特征是遗传的。这允许转让所需的字符到下一个和多个代4]。因此,种子股可以建立,保证股票的持续可用性(5]。
2。植物性重组蛋白生产的发展简史
植物分子农业的迅速发展是26年前概念证明重组植物的药用蛋白质时报告(表1;(1,6])。其中,生物活性人工干扰素αD生产萝卜与突变的花椰菜花叶病毒接种后携带人类干扰素αD的ORF二世(7]。同年,烟草植物表达伽马或kappa免疫球蛋白链鼠标是交叉产生的后代表达两种免疫球蛋白链,展示植物的能力组装不同的生物分子(8]。然后,人类血清白蛋白的生产在烟草和土豆植物相同的报道真实的人类蛋白(9]。
这个想法已经扩展到许多工业和农业重组酶的生产。主要的例子是亲和素(12),β葡萄糖醛酸酶(13),和胰蛋白酶14]。此外,利用植物生产外源蛋白特别是生物医学重要的材料是广泛而多种多样。一些生物制药,如生长激素、人血组件和细胞因子在植物中表达的6,11]。此外,许多医学相关的蛋白质包括抗体或疫苗对人类和兽医用不断地探索和发展。单克隆抗体对乙型肝炎表面抗原(HBsAg),表达了在烟草,是第一个商业化植物的抗体。营销渠道在古巴,它已经取代鼠标派生单克隆抗体的常规净化HBsAg重组乙肝疫苗生产(10]。植物抗体目前商业化的管道包括那些反对变形链球菌和非霍奇金淋巴瘤(6,11]。单克隆分泌抗体变异链球菌工厂制造了防止殖民化的微生物在人类口腔(22]。它自2003年被批准为医疗设备由欧洲监管机构对人类使用和商业化CaroRx [6]。
另一方面,各种各样的疫苗抗原检测表达在植物,无论是人类还是兽医应用程序。在疫苗目标供人类使用,变异链球菌表面蛋白的龋齿和HBsAg病毒性肝炎B是第一个探索(23]。它已经证明了植物22纳米粒子的表面类似于HBsAg粒子来自人类血清和重组酵母,身体上和抗原(15]。随后,各种候选疫苗包括大肠杆菌heat-labile肠毒素B亚基(LT-B),诺沃克病毒粒子,和霍乱毒素B亚基在植物中表达的23,24]。细菌抗原LT-B制造第一个概念证明食用共生产出疫苗通过证明交付的口服疫苗授予保护效力老鼠(18]。此外,疫苗针对的抗原如病毒性肝炎B, LT-B,诺沃克病毒向高级发展阶段和已经完成了第一阶段的临床试验(6]。尽管,许多疫苗抗原使他们前进尽管他们在发展的早期阶段。这些包括和不限于疫苗对轮状病毒感染25],麻疹[26,27),人类免疫缺陷病毒1型(28- - - - - -30.),人类巨细胞病毒(31日),呼吸道合胞体病毒(32,33),金黄色葡萄球菌(34),铜绿假单胞菌(35,36),而恶性疟原虫(37]。
然而,这是一个工厂生产家禽疫苗鸡新城疫病毒(NDV)是第一个植物疫苗获得监管部门的批准来自美国农业部兽医生物制品(中心21]。NDV疫苗被证明带来超过90%保护率与NDV在鸡的挑战。虽然概念证明家禽疫苗没有被商业化和没有其他兽医疫苗引入市场从那时起,动物病原体已经成为植物中表达的重点(38]。事实上,候选人的数量和范围从动物微生物和病毒抗原表达在植物广泛39]。实施的可能性挑战实验具体感兴趣的动物物种鼓励和热情导致工厂生产动物疫苗的发展。
3所示。的植物生产系统
自1990年代初以来,植物获得了额外的作用在分子农业生物反应器为新药物和疫苗(38]。整个植物,通过稳定或瞬态转换,用于生产外国利益目标抗原(40)有可能被应用在常规疫苗接种策略。植物,因此,代表有吸引力的替代品生产疫苗。不同部分的植物叶子和茎组织,种子和根菜类蔬菜和水果已被用于外源蛋白的生产。使用的一些常见的植物物种包括小开花野草拟南芥广泛用于植物科学、烟草、紫花苜蓿、菠菜、土豆、大米、大豆、玉米、番茄、草莓、胡萝卜、和许多更多3]。最初概念作为食用疫苗的生产平台(41],表达外源蛋白在植物旨在减少针的使用和冷链疫苗交付特别是在发展中国家。此外,食品工厂应该用于外源蛋白表达特别是对疫苗,他们可以直接食用或只有最小的处理。然而,植物生产系统提供了许多其他优势。
工厂的生产成本是只有一小部分的哺乳动物细胞系统和10至50倍低于微生物系统大肠杆菌发酵生产相同的蛋白质(42,43]。转基因植物的种植需要相对基本和经济传播材料如阳光,水和营养物质。此外,转基因植物的收割和下游处理需要一个简单的技术和生产是简单和快速的扩大可以通过增加种植面积(41]。
生产外源蛋白在植物和哺乳动物细胞相比,通常被认为是安全的系统,他们不太可能港口或朊病毒致病微生物对人类或动物(41]。传统的生活尤其是兽医疫苗病毒的起源,用于家禽,通常是在鸡胚或细胞培养系统中传播。这些疫苗主要包括减毒病毒株,失去毒性属性但仍复制并演示所需的抗原特性。尽管疫苗可以模仿的过程中自然地获得免疫力,他们承担回归毒性的风险,这可能导致感染,而不是保护(44]。此外,鸡胚或动物细胞传播系统固有的故意污染的威胁,因为他们富含营养物质,因此容易受到污染。禽白血病病毒被发现的污染物在商业马立克氏病疫苗的家禽(45]。虽然污染疫苗及时从市场消失,据报道,日常质量保证措施未能检测到病毒污染物。这无疑提高了安全问题疫苗生产的动物来源。植物作为生产系统时,有更低的风险无关的传染性病原体的污染。
除了成本方面的明显优势,可伸缩性和安全性、植物表达平台能够进行转译后的改性蛋白质的二硫键的形成和糖基化(46]。蛋白质可以针对和保留在细胞的内质网允许N-glycosylation,避免复杂类型N-glycan修改由高尔基体(43]。结构更接近的昆虫细胞表达系统,利用植物系统,然而,需要修改和协调特有的N-glycosylation应该需要生产治疗糖蛋白为兽医或人类的目的(47,48]。在动物细胞培养能够进行转译后的修改和复制与N-glycan糖蛋白结构特定于他们来自的动物,他们是由明显的高生产成本补偿的49]。与昆虫细胞和植物表达系统,利用哺乳动物细胞培养非人类起源的糖蛋白的表达对人类使用需要人性化[49]。同样,尽管微生物生产系统大肠杆菌比哺乳动物细胞系统和酵母相对便宜多了,他们不能够合成糖基化的蛋白质所需的生物属性(48]。因为细菌不glycosylate,而酵母可能hyperglycosylate,产生的免疫原性的蛋白质可能会受到影响(46]。
4所示。植物表达重组蛋白的平台
探究了许多植物,并用于生产重组蛋白和疫苗抗原(表2;(41,50])。一般来说,这些可分为绿叶作物,水果和根菜类蔬菜,和种子。大豆、苜蓿和玉米是最有效的植物系统生产外源蛋白从经济的角度来看41]。初步研究生成稳定转换转基因植物表达蛋白质的兴趣经常看到模型的使用植物等拟南芥和烟草(39]。与测序的完成拟南芥核基因组(51),转基因植物的研究方兴未艾。各种各样的拟南芥线和突变体可遗传信息是可用的。因此,转换协议拟南芥建立了甚至可以成功地执行由非专业人士写的。然而,工厂不是用于商业生产,因为它有一个低生物量(50]。
相反,烟草能达到一个相对高生物质产量(52]。除此之外,它是一个非食品和nonfeed作物;因此转基因烟草的风险进入饲料和人类食物链因此减少(50]。然而,交叉的风险与nontransgenic烟草大田生产不能完全消除(41]。此外,转基因烟草不能直接消耗没有下游加工,因为它含有大量的尼古丁和其他有毒生物碱前必须清除完全可以是口头传递。然而,low-alkaloid品种,需要更少的处理是可用的。此外,烟草细胞悬浮文化缺乏这些有毒代谢物和他们也可以用于生产外源蛋白(53]。
其他的作物,探索分子农业包括紫花苜蓿、三叶草,生菜(50]。紫花苜蓿和苜蓿相对建立转换协议,他们可以很容易地由无性繁殖栽培[41]。植物的叶子可以吃未煮过的,这是特别有用的在动物疫苗的开发50]。此外,这些绿叶作物含有高蛋白质水平和他们可以实现大型干燥生物质产量每公顷的土地(53]。紫花苜蓿可以收获许多倍和9倍。N-glycosylation模式在紫花苜蓿主要是同质的(50]。N-glycosylation过程的一致性等重要尤其是在治疗性蛋白质的生产这些蛋白质的生物功能的影响N-linked多糖结构(54,55]。与N-glycosylation在烟草显示高度异构模式中,高达75%的单克隆抗体表达苜蓿表现出相同的多糖结构适用于下游人性化处理(56]。然而,他们的风险远交nontransgenic植物开放领域的生产。虽然有一个深根系减少化学肥料的必要性,转基因植物给彻底清洗从生产领域带来一些困难(41]。
水果和根菜类蔬菜如番茄和土豆也变得喜欢植物表达宿主。土豆经常被使用,因为转换协议生成转基因线建立了。块茎提取物S1糖蛋白基因的转基因线表达传染性支气管炎病毒(IBV)已被证明保护鸡的临床疾病,以及病毒脱落在挑战[57,58]。此外,超小型电子管生产马铃薯是用于快速测定(41]。外源蛋白生产也稳定,能长时间储存在存储组织没有制冷(50]。异型杂交的风险在大田生产低植物无性繁殖系地传播。此外,工业处理建立了块茎,下游加工的成本可以大大降低。然而,马铃薯块茎含有蛋白质含量相对较低(41),它不是美味虽然可以生吃。虽然做饭可以改善其适口性,它可能导致外源蛋白质的变性,从而导致可怜的免疫原性如果是用于生产疫苗抗原(59]。
因此,番茄已经成为一个更有吸引力的替代系统[41),因为它们是美味,可以生吃,不做饭。因此,疫苗抗原表达他们不被热变性治疗风险。第一个候选疫苗用于表达式在西红柿是狂犬病毒糖蛋白(60]。此外,他们被用来表达轮状病毒的衣壳蛋白VP2和VP6,显示出免疫原性小鼠的腹腔内交货(61年]。固有的高水平的维生素A在西红柿也可以帮助提高免疫反应(59]。西红柿有完善的工业培养和处理系统就像土豆。然而,水果也在蛋白质含量相对较低,必须冷冻收获后为了防止损坏(59]。尽管冷冻干燥技术可用于保存水果,这增加了一个额外的成本到下游处理。
植物种子代表另一个表达式的外源蛋白和疫苗抗原的合成平台,以及他们的存储。相比易腐烂的植物如绿叶作物和水果,植物种子使长期存储产生的外源蛋白(1]。植物种子通常低含水量大多数种子的含水量小于总生物量的10%,而在大多数情况下,叶子含有超过90%的水(62年]。此外,植物种子蛋白质含量相对较高,范围从10%到40%的湿重,而在大多数叶片蛋白质百分比小于5%62年]。因此,植物种子代表一个好的汽车,促进稳定蛋白质的积累和储存。此外,在植物种子蛋白酶活动很低,从而损坏的风险大大降低,不受蛋白水解降解产生的外源蛋白(50]。证明和疫苗抗原的抗体积累在种子保持稳定而不丧失活动多年来在室温下(63年,64年]。因此,种子适合直接消费和特别有用动物疫苗的发展。工业规模种子种植和生产已经很成熟,从种植、收获、储存、配送、加工的种子1]。
玉米是应用最广泛的粮食作物分子农业(65年]。玉米种子或每公顷玉米粒度更大,高生物质产量相比其他谷物。体外操作和转换的玉米已经被广泛研究,而其商业化生产,加工,和可伸缩性也。第一个商业化corn-produced产品是抗生物素蛋白(12)公司ProdiGene和可用的σ目录用于诊断(65年]。此外,玉米已被用于动物疫苗的发展。传染性胃肠炎病毒(TGEV)包络峰值(S)蛋白表达的玉米被证明产生保护性抗体在小猪和金边债券(66年,67年]。同样,口腔喂食转基因玉米蛋白质表达糖蛋白NDV是免疫原性,赋予保护性免疫鸡(68年]。
大米是另一家领先的平台生产外源蛋白(1]。像玉米、水稻生物量产量高,和它的生产,加工,和可伸缩性也已建立。水稻在玉米的一个明显的优势是非法的基因流的风险降低由于花粉释放产生的自花受粉[62年]。枚specific-pathogen-free两星期的口腔喂食免疫试验(SPF)鸡与水稻种子的VP2蛋白表达传染性法氏囊病病毒(IBDV),挑战和保护研究显示证据的保护性免疫鸡(69年]。大麦是另一个商业平台研究了玉米和大米。大麦是一个重要的优势的自花传粉的特质被认为是作为外源蛋白生产系统的发展。例如,皮下注射的F4菌毛adhesin产肠毒素的蛋白质大肠杆菌在大麦谷物生产是为了诱导中和抗体对小鼠70年]。
豌豆和大豆是两个常见豆科植物分子农业平台正在研究[1]。在一项研究中,大豆种子被用来表达产肠毒素的大肠杆菌LT-B蛋白(71年]。这些转基因种子能够诱导系统性和粘膜免疫小鼠口服和授予部分保护的挑战。的主要优势在谷物豆类,豆类谷类的总蛋白质含量相对高于谷物。相比总蛋白(8到13%)从谷物、豌豆和大豆的总蛋白质含量可高达40%72年]。然而,这种明显的优势是补偿豆类的艰苦的和低效的转换过程除了年度产量相对较低和较高的生产成本相比,玉米和大米。然而,豌豆和大豆都是自花传粉的物种;因此基因流污染更少的风险。
总的来说,seed-based表达式的一个主要的缺点是相对延长time-to-product期(62年]。蛋白质的表达是针对种子,转基因植物生长开花周期产生种子。评估对外源蛋白的表达只能当种子设置开始。这也使得seed-based生产系统变得不那么适合某些外源蛋白的表达像流感病毒抗原62年]。由于流感疫苗是每年修订,种子的数量在给定时间可能不足以供应生产。此外,seed-based生产涉及到开花周期可能增加花粉释放的风险和基因流受花粉污染转移特别是在大田生产系统(53]。相比之下,转基因的作物可以收获之前开花,因此远交的风险降低。
5。概念验证植物的动物疫苗
植物动物疫苗的巨大发展主要由于能力进行挑战感兴趣的特定的动物实验(4]。关键例子共生产出免疫原性蛋白检测对疾病的挑战目标动物物种如表所示3。第一批示范展示植物的疫苗的保护效果从水貂肠炎病毒(兆电子伏),短的,线性的,和病毒VP2的中和表位衣壳蛋白表达在黑眼豆73年]。使用植物嵌合病毒颗粒(cvp)的方法,简单的抗原决定基是插入到豇豆花叶病毒感染并显示在cvp的表面在植物。皮下注射1毫克的嵌合病毒颗粒表达兆电子伏在cvp肽表面保护貂对临床疾病和毒性兆电子伏的挑战。在另一个研究中,研究表明,VP60蛋白兔出血热病毒产生的转基因土豆授予保护兔子对感染后肠外免疫(74年]。这也是免疫原性和诱导部分保护兔子在口服交付的疫苗(75年]。
事实上,最有前途的概念证明的可食用的植物动物疫苗交付口头反对TGEV猪(67年,79年,80年]。TGEV S蛋白的表达在玉米混合药代乳品和美联储口头10天大的小猪(66年]。在单一剂量的2毫克(S蛋白喂食,小猪之前美联储在10天内毒性TGEV口头受到挑战。相比对照组与商业疫苗接种,78%的仔猪腹泻开发,只有50%的小猪美联储与转基因玉米腹泻。这项研究得出结论,转基因玉米能赋予部分保护小猪对临床疾病和实验挑战了致命的病毒。此外,进一步的研究进行了检查与转基因玉米在金边债券和疫苗接种的转移保护anti-S蛋白质抗体哺乳仔猪通过初乳67年]。在这项研究中,所有的英国国债的被试修改住TGEV疫苗口服天115年和102年,肌内产小猪前88天。初级预防接种后,金边债券被分成组并受不同类型的辅助治疗。与对照组相比,没有收到任何助推器剂量,金边债券给出双口服助推器包含26个毫克的S蛋白的转基因玉米在35和14天产小猪显示显著增加TGEV血清中和抗体效价,初乳和牛奶。这种反应与金边债券收到修改的活病毒疫苗作为一个助推器。牛奶的中和抗体效价水平被认为是充分保护的哺乳仔猪,尽管在小猪[功效并没有进行测试67年]。
此外,开展保护效力的可能性的发展目标动物实验也让plant-expressed口蹄疫病毒(FMDV)疫苗偶蹄类动物。携带病毒衣壳蛋白VP1 FMDV中和抗原表位是表达式的目标在不同的植物。转基因植物表达的完整蛋白质或抗原肽VP1植物中已经生成拟南芥(81年],苜蓿[82年,83年),和土豆84年]。早期的研究在小鼠经腹腔内进行(81年- - - - - -84年)和/或口头(82年)交付的叶子中提取显示该疫苗免疫原性和保护。此外,VP1蛋白也表示使用植物病毒显示向量的烟草花叶病毒通过本量利烟叶的方法(85年]。整个VP1蛋白表达的植物病毒,以及随之而来的cvp腹腔内注入老鼠授予防止病毒与生活FMDV的挑战。虽然这些研究表明诱导保护性免疫的小鼠,只是到了后来,猪的防护效果进行了实验,FMDV的天然宿主之一。在一个相关的研究中,表达的免疫原性VP1肽氨基酸包括128年到164年通过本量利的方法成功地开展[76年]。使用竹子花叶病毒(BaMV)作为植物病毒显示向量,VP1肽基因融合到修改BaMV的外壳蛋白基因。在感染的叶子藜藜麦BaMV植物宿主,VP1肽是显示在cvp的表面。两个肌肉内注射5毫克的VP1-displaying cvp分开在两个月的SPF猪6周导致anti-FMDV中和抗体的感应。在猪疫苗演示一个完整的保护对FMDV挑战助推器注射后4周。
在家禽疫苗领域,一些传染性病原体的经济重要性的关注植物疫苗的发展。NDV是其中之一,病毒表面糖蛋白融合和/或血凝素神经氨酸酶表达的目标。除了第一个批准共生产出NDV疫苗(21),是在烟草细胞培养,NDV病毒蛋白表达在其他植物系统。口腔喂食转基因玉米病毒融合蛋白表达了免疫原性和授予保护性免疫鸡(68年]。
此外,IBV S1糖蛋白包含病毒中和hemagglutination-inhibiting抗原表位疫苗发展感兴趣的组件。通过稳定S1糖蛋白基因转化成马铃薯植物,转基因马铃薯的块茎提取物用于鸡(疫苗接种和保护效果研究57,58]。这里,陈小鸡被喂以口头与2.5或5 g的块茎提取对应28.6或57.2μg (S1糖蛋白和喂养在天重复7和14。使用致命病毒的挑战通过鼻内执行路线IBV七天最后的疫苗接种后显示所有小鸡再辅以5 g的块茎提取物是从临床疾病和病毒保护脱落。这个结果与对照组接种活疫苗与商业修改。
IBDV的高度传染性和致命病毒的年轻的鸡,是另一个重要病原体的家禽。这是一个双链RNA病毒基因组有两个部分,称为a和B (86年]。IBDV的VP2衣壳蛋白片段包含病毒中和抗原表位,并被选为组件工厂生产疫苗的发展(69年,87年]。在一项研究中,VP2基因的变体IBDV毒株E表达拟南芥(87年),而在另一项研究的VP2基因毒性IBDV毒株与衰减段在水稻种子中表达的是69年]。在口腔喂食免疫试验水稻种子,枚SPF鸡喂养转基因水稻种子在两星期的每周间隔了四次受到挑战与毒性IBDV毒株(69年]。鸡再辅以5 g的转基因水稻种子含有40.21μg VP2蛋白在一粒69年),总计大约10毫克剂量VP2蛋白(88年),给最好的结果在挑战和保护的研究。评估基于损伤评分后囊挑战表明,口服免疫鸡取得更好的病变评分相比,鸡,收到了减毒活疫苗疫苗。口服免疫鸡也包含更少的抗原存在于基于免疫荧光测定法氏囊组织。此外,经典的长篇VP2基因IBDV毒株已经是暂时性的表达烟草benthamiana叶子和亚单位疫苗接种的重组蛋白提取78年]。Eighteen-day-old小鸡肌内注射12μg VP2蛋白乳化石油辅助和推动22至35天之后可以产生anti-IBDV抗体中和能力。除了VP2蛋白稳定或瞬态转换得到的植物、cvp的方法也用于生成可行的嵌合BaMV病毒VP2 P域循环非常致命的IBDV [77年]。肌内注射与600年μg重组BaMV油佐剂的质询SPF鸡被证明诱导IBDV-specific抗体和保护小鸡在一个非常致命的挑战IBDV毒株接种疫苗后28天。这些研究得出的结论是,植物VP2蛋白是一个有用的疫苗接种战略IBDV的鸡。
6。结论
这的确是令人惊讶的看到26年后只有两个重组蛋白产品从植物通过授权监管流程:单克隆抗体对HBsAg和家禽抗NDV的疫苗。植物疫苗作为食用疫苗的想法已经收到了很多宣传和热情发展以来第一个概念证明重组植物的药用蛋白质。然而,进展并不是没有障碍(3]。虽然成功的报道感兴趣的目标抗原的表达是众多,其中许多未能实现表达水平适合商业化(41]。除此之外,使用食品植物生产疫苗抗原的发芽人类食物链的污染的担忧。担心监管问题也阻碍了植物疫苗的开发。然而,植物分子农业的监管途径疫苗抗原用于兽医相比远远短供人类使用的产品。因此,这是一个机会,权证的追求植物疫苗的动物。演示安全,增加使用共生产出重组蛋白产品在动物会导致植物表达技术的接受和承认。这将反过来鼓励他们使用植物性生物制药生产供人类使用。最后,用一个更好的理解植物基因表达和分子生物学,实现理想的植物可食用疫苗不会太远。因此,疫苗的分子农业,兽医或人类使用,将是值得探索的。
利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
作者希望感谢y Abba博士校对论文草稿。这项研究是由中国高等教育资助,马来西亚。