因子X在BHK-21细胞中的表达促进了低致病性流感病毒复制

抽象

将从鸡胚中分离的因子10 (FX)的cDNA克隆插入哺乳动物细胞表达载体pCDNA3.1中，转染到鼠宝宝肾脏(BHK-21)细胞系中。利用诱导表达FX的生成的BHK-21细胞，研究丝氨酸跨膜蛋白酶对具有单侧裂解位点的流感病毒血凝素(HA)蛋白水解激活的效果。数据显示，十次连续传代后，BHK-21/FX稳定表达FX。该细胞对低致病性禽流感病毒血凝素的蛋白裂解能力为0.01。病毒在BHK-21/FX、BHK-21和MDCK细胞上的生长动力学通过滴定每种培养上清中的病毒颗粒来评估。在随后的传代中，细胞中明显检测到高效的多循环病毒复制。病毒滴定表明，BHK-21/FX细胞支持高滴度病毒生长，其中病毒滴度与TPCK-trypsin在BHK-21或MDCK细胞中生长的病毒相当。结果表明BHK-21/FX在流感病毒复制程序和相关研究中的潜在应用。

1.介绍

流感是全世界人类和禽类和动物物种的最经济上最重要的病毒呼吸系统疾病之一。致病剂属于Orthomyxoviridae，负感道，单链RNA，其编码至少11蛋白。型病毒基于两个主要表面糖蛋白血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA），并在特定分子和发病机制标准的基础上进一步分类为低致病（LP）或高致病（HP）[1,2]。禽流感病毒主要在肠道复制，而人类流感毒株则在上呼吸道复制[3.,4]。感染周期是由病毒血凝素特异性结合宿主细胞表面的一个末端唾液酸帽糖基化分子启动的。当附着在细胞上时，受体介导的内吞作用发生α2-6Gal或α2-3Gal链接(5,6]。流感病毒的细胞趋向性和传染性主要是由这些受体在细胞表面的分布决定的。此外，用于HA0前体蛋白翻译后切割的特定宿主细胞蛋白酶的存在对病毒感染性、致病性和组织向性至关重要[7,8]。甲型流感病毒以广泛的组织为靶标，因此病毒的复制已在多种细胞中进行了检测[9- - - - - -13]。结果表明，在细胞之间对病毒的易感性显着变化;特别是气管上皮，MDCK和A549已被描述为适合的允许细胞，用于复制人和禽流感病毒。流感病毒的复制可归因于2-6和2-3个连接的细胞表面上的2-6和2-3个连接的唾液酸受体。除了病毒受体相互作用确定的病毒性覆身，受体的局部密度，脂质筏微摩擦和宿主细胞蛋白酶激活病毒表面糖蛋白在流感感染中发挥主要作用[14,15]。这些病毒有能力利用宿主病毒激活蛋白酶系统来支持自己的复制。细胞宿主蛋白酶，如跨膜丝氨酸蛋白酶(TMPRSS)，一种类似于鸡尿囊液到血液凝血因子10 (FX)的蛋白酶，以及纤溶酶参与了A型流感病毒感染进入后阶段[8,16]。特别是近年来，人们对流感病毒感染时的止血作用越来越感兴趣。因子X可能在病毒复制中发挥作用这一事实表明，止血和凝固对宿主确实可能是有害的[17]。禽流感病毒在鸡源细胞中生长时可达到高滴度;但是，LP病毒在补充胰蛋白酶的情况下可以实现有效的复制和感染[4]。该酶通过HA的裂解，增强了流感病毒进入细胞的内在化，但没有提高宿主细胞内在化病毒的能力[18]。有充分的证据表明，由于尿囊液中存在一种蛋白酶，它可以裂解血凝素，所以LP病毒不能被细胞内普遍存在的蛋白酶裂解，但它们可以在卵细胞中高效复制[19]。既往研究表明，病毒感染可诱导出FX，一种凝血酶原家族中的维生素k依赖性丝氨酸蛋白酶。病毒激活蛋白在一个特定的含有精氨酸的单一位点裂解仙台病毒、新城疫病毒和流感病毒的融合蛋白，并在病毒在尿囊内传播中发挥关键作用[16,17]。在本研究中，我们克隆了BHK-21细胞中的FX mRNA，并评估了所建立的BHK-21/FX细胞对一株LP流感病毒的敏感性和病毒复制动力学的影响，为未来流感病毒诊断方法的发展提供了思路。

2.材料和方法

2.1。细胞和病毒感染

MDCK和BHK-21细胞在杜尔贝科改良的Eagle’s培养基(DMEM) (Invitrogen)中生长，该培养基中添加了10%胎牛血清(胎牛血清;胎牛血清;胎牛血清;胎牛血清;胎牛血清;西格玛奥德里奇)，100u /mL青霉素，100mg /mL链霉素，37℃，5% CO₂。通过使用剂量 - 反应试验，针对每种培养物测定最佳L-（甲基酰胺-2-苯基）乙基氯甲基酮（TPCK）胰蛋白酶浓度。BHK-21细胞系对胰蛋白酶毒性的易感性更大，并且接受0.1mg / ml，而MDCK细胞系是由胰蛋白酶引起的毒性最耐毒性并接受0.45mg / ml。细胞的单层以1×10的浓度⁶在补充胰蛋白酶的存在下，以0.01的多重感染(MOI)的方式感染了局部分离的H9N2流感病毒a /鸡/伊朗SS8(2011)。37℃吸附1 h后，取出接种菌，洗涤后更换DMEM。在感染后(hpi)培养72小时，并通过倒置光镜检查细胞病变效果(CPE)。每个细胞用四套不同的组织培养瓶进行感染。模拟病毒感染细胞作为对照。

2.2。表达载体pcDNA3.1-FX和转染BHK-21细胞

构建pcDNA3.1表达载体(Invitrogen)中FX的cDNA克隆。利用引物5-扩增了从胚卵绒毛尿囊膜中分离得到的位于肽酶S1结构域(241-473 nt)的FX开放阅读框GGATCCGATGAGTGTCGTCCTGGTGA-3和5 -AAGCTT含限制性位点的Bam你好,h分别dIII(强调)。使用Lipofectamine 2000 (Life Technologies)根据制造商的说明，使用pcDNA3.1-FX质粒转染BHK-21细胞。选择转染细胞，在10%胎牛血清和800 g/mL Geneticin (G418;英杰公司)。两周后，选择存活的细胞汇集，在1.5 mg G418/mL中传代三次，并冻结在aliquots中。分离g418抗性菌落，采用提取的RNA(高纯度RNA提取试剂盒，德国罗氏公司)和一步RT-PCR(内含子生物技术，韩国)，RT-PCR验证232bp长度FX的表达。

2.3。在多个细胞通道期间的BHK-21 / FX细胞筛选

在病毒感染之前，我们评估了BHK-21/FX细胞的生长特性和电镀条件。细胞接种于两个48孔细胞培养板，孵育过夜。当单层细胞融合度在90% ~ 95%之间时，在MOI 0.01处接种病毒。一个培养皿接受胰蛋白酶补充培养基，另一个培养皿接受普通培养基。将细胞在37℃5% CO的条件下孵育4天₂并在显微镜下检查CPE的存在。每个实验均加入模拟细胞作为对照。感染后第1天和第4天(pi)，每个板8个孔用流感NP特异性抗体免疫染色，评估病毒内部蛋白的表达。在不同时间对细胞进行病毒复制动力学定量检测。然后用TCID对感染性病毒颗粒进行定量表达_50.。最后，剩余收获的上清液作为接种剂，继续进行10个传代。用免疫分析法测定各传代流感病毒的传染性。简单地，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤一次，室温下用4%多聚甲醛PBS固定15分钟。固定的细胞用小鼠抗流感NP单克隆抗体清洗和免疫染色，然后用fitc标记的山羊抗小鼠IgG (Dako, Glostrup，丹麦)。在尼康Eclipse E600荧光显微镜下观察免疫染色细胞。

为了评估在BHK-21/FX细胞中产生流感病毒的影响，我们通过感染10个细胞来评估敏感性试验⁵与H9N2病毒的细胞进行10次病毒传代在每个传代中，估计病毒滴度，确定HA和NA核苷酸序列。在这种情况下，提取的病毒RNA使用一步RT-PCR对HA和NA片段进行全长扩增[12]。克隆不同通道的病毒基因的PCR产物并在两个方向上随后测序。使用BioEdit序列对准编辑器版本7.0.9软件的群集W对准方法进行分析序列。

2.4。统计分析

数据以平均值±标准差表示。数据的统计相关性通过方差分析和学生方差分析来检验是否显著以及。差异与被认为是重要的。

结果

3.1。细胞系验证

在缺乏和存在的情况下评估H9N2流感病毒感染MDCK和BHK-21细胞系的能力。在细胞和中等CPE中复制的H9N2病毒仅在胰蛋白酶的存在下是显而易见的48HPI。在没有胰蛋白酶的情况下，病毒未能产生CPE，因为HA仍然不会发生未切割的病毒复制。

3.2。BHK-21/FX单元的建立和筛选

通过转染编码FX的质粒来建立BHK-21 / FX。在抗生素选择下连续两周，系统地评估存活的培养的BHK-21 / FX细胞，以敏感对初级流感病毒感染和病毒复制和传播的介电常数。从RT-PCR中的BHK-21 / FX细胞的总RNA中扩增的特异性带已经证实了细胞中的FX基因的存在。BHK-21 / FX细胞的形态与BHK-21细胞不同。在用流感病毒感染BHK-21 / FX细胞后，通过24hPI观察到可见CPE，与BHK-21细胞相比，巨型细胞形成和培养瓶大量脱离（图1)。被病毒感染的BHK-21细胞在72 hpi时产生非常轻的CPE。两个细胞的病毒滴度都从10增加了^3.0TCID_50.在BHK-21细胞连续传代过程中，第一传代保持不变(10)^5.5TCID_50.)，而H9N2病毒感染bhk -21/FX细胞的病毒滴度最高。将BHK-21/FX细胞第一次传代时的病毒产率提高了约2500倍(10^7.5TCID_50.)在第五通道一直到第七通道。这清楚地表明，细胞允许产生传染性流感病毒颗粒(图)2)。通过免疫荧光检测NP在72 hpi中的表达，监测病毒的生产和传播(图)3.)。从8 HPI，随着时间的推移，NP表达的细胞的数量增加。病毒感染-BHK-21细胞在补充胰蛋白酶的存在下表现出相同的面板，而在没有胰蛋白酶的情况下未观察到病毒复制。它可能是由于蛋白酶活化的病毒HA切割位点，其支持病毒进入和复制。

分析了在BHK-21/FX细胞中传代7次的病毒HA和NA基因的核苷酸序列，并与亲本病毒基因组序列进行比较。在HA蛋白的卵裂位点、受体结合袋和n -糖基化位点没有观察到氨基酸的变化。它们都表现出残差守恒¹⁸³,我¹⁹⁰,我²²⁶,问²²⁷,和G²²⁸在受体结合袋和卵裂位点的RSSR基序中。NA的比较序列分析表明，氨基酸序列在NA蛋白活性位点的位置³⁶⁶IRKDSRAG³⁷³,^399.DSDNRSGY⁴⁰⁶,⁴³¹PQE.⁴³³是守恒的。在第5篇文章中发现了3个同时发生的核苷酸替换，但没有导致氨基酸的变化。在病毒在BHK-21/FX细胞的后续传代中，未检测到病毒基因核苷酸序列的突变导致氨基酸密码子的变化。

4.讨论

自1997年以来，已确认了若干人感染不同亚型禽流感病毒的病例，提高了禽流感病毒在人群中大流行的可能性。因此，早期检测对于启动有效的控制程序是非常重要的。在胚胎蛋或细胞培养中分离病毒，然后进行分型被认为是检测禽流感病毒的标准方案。近十年来，一些分离株在MDCK细胞系中生长性能较低[20.]。由于特异性受体分布和宿主细胞蛋白酶，禽流感病毒通常在胚胎卵或原发性小鸡胚胎发起的细胞上生长。已经证明血液衍生的蛋白酶促进呼吸道外的流感病毒复制。

在这里，我们开发了表达FX的BHK-21细胞系，在没有补充胰蛋白酶的情况下可以影响流感病毒HA的激活。我们项目的主要重点是描述LP禽流感病毒在基因操纵的BHK-21细胞中的传播特性，以及使用BHK-21/FX细胞进行病毒分离和复制的可能性。RT-PCR在10个连续传代细胞中证实了靶基因的表达。H9N2病毒在BHK-21/FX、BHK-21和MDCK细胞上的生长动力学通过每种培养上清中病毒颗粒的滴定进行评价。病毒在操作细胞中的生长动力学与MDCK或BHK-21加TPCK-trypsin ()。监测病毒滴度和子代病毒在多周期感染中的释放对过程表征和优化具有重要意义。根据病毒接种到增加病毒感染滴度的间隔时间，估计流感病毒繁殖周期为5-6小时。其他研究表明，流感病毒单株子代产生周期在MDCK细胞中需要8-10小时，在A549细胞中也需要8-10小时，而在Chang的结膜细胞中需要20小时[10,12,21]。我们分别在8、18和24小时检测了BHK-21/FX的子代病毒释放。经II型跨膜丝氨酸蛋白酶转染的MDCK细胞中，2,6个唾液酸受体的过表达显示出足够的滴度用于细胞型人流感疫苗的生产[7]。增强病毒受体相互作用导致增加膜融合，病毒藻生产和结合率。还通过在没有外源胰蛋白酶的情况下检测在BHK-21 / FX细胞中的病毒NP表达来证实病毒进入和引发感染程序。内部病毒蛋白可能在病毒生命周期的早期阶段中发挥重要作用，包括将分段的病毒基因组包封成核糖核蛋白，VRNA合成和与病毒聚合酶的相互作用。NP蛋白是用于从转录转录到复制的指标。因此，根据蛋白质的免疫荧光测定，BHK-21 / FX细胞可以在不存在外源胰蛋白酶的情况下切割H9亚型的HA蛋白。切割是一种细胞相关过程，导致病毒复制和生产与MDCK或BHK-21细胞加上胰蛋白酶的高滴度相当的高滴度。间隔通道的HA和NA基因的全长扩增和测序模式证明了10个通道的H9N2病毒仍然类似于亲本病毒。这些数据表明BHK-21 / FX是一种允许细胞，其能够优化禽流感病毒复制以获得高滴度。

在生长和感染过程中对修饰的细胞系进行鉴定，将为基于细胞培养的流感疫苗的研制、病毒的分离和诊断提供基础。在本研究中，我们使用了一个Ca^{2 +}- 依赖丝氨酸蛋白酶探讨流感病毒复制中涉及的宿主因素。FX在肝脏中合成，在体内作为血浆蛋白循环，并通过内在和外在途径活化为因子Xa。因子XA的活动位点被分成四个子数据库，如S1-S4。S1 Subpocket确定选择性和绑定的主要组件[16]。感染细胞表面蛋白酶的激活和结合是HA蛋白水解裂解的另一种机制，这是病毒复制和致病性的前提条件[22]。理解分子水平的病毒复制的最近进展揭示了许多包络病毒，包括流感病毒，在复制后从病毒细胞融合过程中将细胞表面蛋白掺入病毒颗粒中，从而在复制后的宿主细胞的质膜[23]。在流感病毒颗粒的宿主编码蛋白中，annexin家族是很好的代表。附件是Ca的一个家族^{2 +}/脂质结合蛋白并用作膜 - 膜或膜 - 细胞骨架接头。蛋白质已涉及CA^{2 +}- 注释的戒断事件和内吞作用的某些方面。细胞的细胞膜的特异性表达表明高度专业的功能，蛋白质与细胞膜相互作用的能力相互作用[24]。研究了annexin成员作为细胞间质病毒蛋白在流感病毒复制中的作用。作为一种病毒-宿主相互作用，细胞蛋白annexin 2 (Anx2)的表达在流感感染时由于Ca的失调而增加^{2 +}体内平衡。细胞表面Anx2的上调允许纤溶酶原的募集，而纤溶酶原被病毒粒子激活。随后，血凝素裂解Anx2, Anx2结合到病毒颗粒中[25]。Anx6的表达显著增加了病毒的产生，而其过表达可降低病毒子代的滴度，提示Anx6在甲型流感病毒感染中发挥负调控作用[26]。ANX13刺激MDCK细胞中流感病毒HA的顶端传输[25]。假设Ann2和Anx13提升Ca^{2 +}-脂质筏的依赖关系[24]。作为细胞内分类和信号转导活动平台的筏[27]在病毒复制过程中的几个步骤中起决定性作用，包括病毒蛋白在细胞内的运输、子代病毒在质膜上的装配和出芽、病毒颗粒的环境稳定性、病毒进入时病毒与宿主细胞内体膜的融合[28- - - - - -30.]。脂质筏被用作浓缩血凝素结合受体的平台;因此，病毒通过介导有效融合利用筏域的信号能力。病毒钠在筏体中富集，正常进入病毒粒子并出芽[23,28]。RAFT关联也被ANX5与质膜的结合介导。在萌芽过程中掺入流感外壳中的肿瘤封闭，并且在脂质筏中存在大量比例的蛋白质，病毒芽的部位[30.]。

病毒和细胞因子之间的相互作用决定了对流感感染的宿主敏感性，因此在某些细胞中没有显着的病毒复制可以显然是由于没有特定蛋白酶。在宿主病原体相互作用的基础上，使用细胞蛋白酶因子进行BHK-21 / FX，以支持高滴度LP流感病毒复制。分析了细胞对定义细胞密度和病毒MOI的后续病毒通道对病毒滴度和敏感性的影响。特异性流感病毒受体的分布，对其他亚型的特异性，对更高沼泽的敏感性，细胞稳定性和膜蛋白和脂质筏细胞蛋白相互作用需要在未来的研究中建立基于细胞的流感病毒诊断或疫苗制造平台丝氨酸蛋白酶和工程化BHK-21细胞。

披露

作为该论文的通讯作者，Shahla Shahsavandi要保证所提交的材料或部分以前都没有发表过，或正在考虑在其他地方发表。

利益冲突

所有作者声明，他们没有利益冲突。

作者的贡献

Shahla Shahsavandi等作者参与了有意义的研究，并批准了最终论文。

致谢

作者要感谢我们实验室的所有成员乐于助人的助理。本研究由Razi疫苗和血清研究所的授予2-18-18-91128资助。

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