的比较β丙内酯和福尔马林灭活对西尼罗病毒的抗原性和免疫反应

文摘

西尼罗河病毒(西尼罗河病毒)是一种致病性虫媒病毒,属于属黄病毒在同属黄病毒属。到现在还没有批准西尼罗河病毒疫苗供人类使用。在这项研究中,两个烷基化剂的影响,甲醛和βpl,一般用于制备灭活疫苗、评估的基础上的西尼罗河病毒灭活抗原和免疫原性潜力。血统5西尼罗河病毒隔离被福尔马林和灭活βpl的治疗方法。失活被反复证实通过BHK-21细胞系和婴儿老鼠。病毒灭活的治疗显示更高的抗原性。免疫反应在小鼠模型中显示血清anti-WNV相比,福尔马林灭活抗原抗体滴定度适度更高βpl灭活抗原。然而,没有观察到显著差异在中和抗体滴定度。总之,我们可以甲醛和状态βpl失活过程是同样有效的西尼罗河病毒失活。然而,他们需要与其他灭活剂相比,随着研究细胞介导的免疫反应。

1。介绍

西尼罗河病毒(西尼罗河病毒)是一种致病性虫媒病毒,属于属黄病毒,同属黄病毒属。自然循环涉及宿主,即野鸟和家禽。蚊子,一般库蚊物种,充当主向量和人类作为终端主机(1,2]。虽然大多数人类的西尼罗河病毒感染仍然是亚临床、发热性疾病和神经感染性疾病的发展20%,< 1%的受感染的患者,分别3]。最初,病毒分布在非洲,亚洲,欧洲,它引起的罕见的和不可预知的温和的系统性疾病的流行4]。然而,最近病毒很快就传播到新的地区,如罗马尼亚(1996),美国(1999年),最近希腊和意大利(2010),导致全球数以百计的神经和死亡病例(4,5]。在印度,西尼罗河病毒抗体被发现在人类血清从孟买(1952)(6]。从那时起,发热性疾病流行形式和临床上明显的脑炎病例已经观察到南部,中部,印度西部[7]。在印度东部,西尼罗河病毒感染引起急性脑炎综合征首次报道在2006年从阿萨姆邦的(8]。西尼罗河病毒出现了近几十年来作为重大负担公共卫生及随后传遍世界已经将它描述成一个重现全球病原体(9]。目前,有5个灭活和嵌合疫苗许可用于兽医(10]。然而,没有人类疫苗可用虽然有几个候选疫苗在临床试验(11]。临床和亚临床疾病的经济影响权证搜索和使用有效的疫苗。福尔马林和β丙内酯(βpl)是常用的失活的病毒通过化学反应和病毒衣壳蛋白和核酸12]。福尔马林和βpl所分类下的国际癌症研究机构(IARC)组2 a和2 b,分别为(13]。但是直到现在没有流行病学数据相关的评估人类烷化剂的致癌风险。一般来说,保存的完整性免疫抗原表位疫苗功效是很重要的。在这里,我们研究和比较的影响两个烷基化剂,甲醛和βpl通常用于疫苗制备(10,14]西尼罗河病毒抗原和免疫原性的属性。

2。材料和方法

2.1。病毒株和细胞传播

西尼罗河病毒的毒株,WNIRGC07,孤立于2008年从人类AES病人(资源库ID: HQ246154)从阿萨姆邦,印度,被使用。系统发育分析把它放在血统5西尼罗河病毒(15]。四个病毒在婴儿段落瑞士白化老鼠和随后两个段落小仓鼠肾(BHK-21)细胞株进行提高适应性和病毒效价。细胞株是来自国立细胞科学中心,浦那(印度,和维护在鹰最小基本培养基(EMEMσ)补充10%热灭活胎牛血清,7.5%碳酸氢钠(σ)、谷酰胺和2毫米。组织培养感染剂量50 (TCID₅₀病毒的细胞病变效应(CPE)方法计算了按协议的崔et al。16]。

2.2。病毒失活

病毒感染文化上层清液澄清了在10000转离心1小时在4°C。βpl加入病毒悬液的浓度为0.1%,保持在4°C(48小时17]。福尔马林灭活的浓度是0.2%,保持在32°C(5天18]。悬浮液都在10000转离心1小时在4°C和收集到的上层清液处理硫酸鱼精蛋白(1µg / mL)并将其保持在4°C为30分钟。随后,悬浮液的离心20分钟在5000 rpm和上层的收集和储存在−80°C到进一步的实验。

2.3。筛查病毒传染性

灭活病毒制剂检测残余传染性串行通道成BHK-21细胞和颅内接种灭活病毒的幼鼠。任何残留的病毒核酸,病毒RNA提取使用QIAamp病毒RNA迷你包(试剂盒、德国),从大脑收集小鼠接种后幸存的21天。(逆转录酶)- RT - PCR是由特定的西尼罗河病毒NS5区使用的引物序列向前5′-GCTCCGCTGTCCCTGTGA-3′和反向5′- CACTCTCCTCCTGCATGGATG-3′(19]。

2.4。血细胞凝集(HA)测定

灭活病毒滴度测定HA试验所描述的克拉克和卡萨尔斯20.]。连续两个稀释的灭活病毒在牛白蛋白磷酸盐缓冲剂(0.4%芭布斯)准备和孵化轮底板与变量0.4%的鹅红细胞抗原稀释剂(VAD)的pH值6.2,6.4,6.6和6.8。30分钟后在室温下孵化,红细胞凝集效价,表示为最高稀释生产完整的红血球凝聚的倒数是阅读。

2.5。灭活病毒的抗原性

灭活病毒的抗原性准备由间接决定抗原捕获ELISA按照标准方法(21]。九十六孔微量滴定板(Nunc-MaxiSorp)涂上了50µ信用证的黄病毒特定的单克隆抗体(HX-2Ab)的稀释1:50层缓冲区。生物素化的HX-B(礼貌:病毒学研究所浦那(印度)被用来检测抗体。ELISA阅读是在490 OD一式三份。

2.6。体外Microcytotoxicity化验/细胞生存能力分析

灭活病毒的细胞毒性试验的准备工作在BHK-21细胞系细胞细胞毒性评估使用3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT)细胞增殖工具包(罗氏)。细胞毒性的百分比计算在哪里和分别控制和治疗细胞的吸光度(22]。

2.7。小鼠免疫

免疫原制备标准灭活病毒制剂(βpl和福尔马林)与相同体积的混合Alhydrogel(2%的明矾,σ),在室温下孵化了30分钟,并存储在4°C (23]。一共有两组(老鼠)还是3 -瑞士白化小鼠皮下注射免疫与50µ免疫原的L。对照组被注射磷酸盐缓冲盐水(PBS)。升压注入相同配方有14日,第一次免疫后28天。

2.8。测定免疫反应

接种小鼠的anti-WNV IgG抗体反应是决定在接种后7天血清样本收集间接ELISA遵循标准的程序。短暂,96 -微量滴定板(Nunc-MaxiSorp)涂有老鼠大脑派生的西尼罗河病毒抗原在1μg / mL涂层一夜之间的缓冲区(pH值9.6)和保存在4°C。盘子被1% BSA(σ)PBS (pH值7.4)。与PBST洗涤后,井与postimmunized血清孵化一式三份井(100µ信用证)。对照组小鼠的血清还包括与标准anti-JEV多克隆血清与JEV应变提高,P20778大检查。结合抗体被发现HRP-labeled山羊anti-mouse免疫球蛋白(σ)。ortho-Phenylenediamine盐酸盐(门诊部当)(σ)发色体和过氧化氢(H₂O₂)作为衬底。显色是停止使用1 M H₂所以₄和盘子被ELISA读者阅读490海里。确定终点的抗体效价,吸光度读数≥OD值的两倍-控制血清被认为是积极的。

确定中和抗体,超免疫血清对各自提出病毒活性代理与西尼罗河病毒菌株。四倍稀释血清和100空斑形成单位(P.F.U.)的病毒株G22886和孵化为1小时37°C。病毒稀释剂(0.1毫升)混合物是允许在preseeded吸收融合性的细胞单层24-well BHK-21细胞的微量滴定板和孵化为1小时37°C。然后,细胞被覆盖以同样数量的2 x MEM和1.8%羧甲基纤维素(CMC)补充FCS为2%。60小时后,介质被丢弃,沾0.1%氨基黑染色方案。50%的蚀斑减少中和抗体滴度是表示(PRNT₅₀)。

2.9。统计分析

结果表示为平均值至少三个实验。比较两组使用两个独立样本测试。

3所示。结果

3.1。西尼罗河病毒失活的

西尼罗河病毒失活后确认重复进入婴儿小鼠和BHK-21细胞单层。没有观察到婴儿死亡率小鼠接种颅内,而婴儿接种活病毒接种3 - 4天后就去世了。CPE没有观察到在灭活病毒感染细胞单层膜。PCR扩增子还显示没有病毒核酸的痕迹。

3.2。HA效价和抗原性

HA试验显示4096年的滴定度最高的βpl和福尔马林灭活过程。然而,在βpl失活,抗原效价的病毒被发现依赖pH值稀释剂(VAD)滴定度最高的VAD pH值6.4。然而,与福尔马林灭活抗原制备,得到了统一的滴定度高的vad pH值6.2,6.4,6.6(图1)。

福尔马林的抗原性和βpl灭活病毒被间接ELISA检测做准备。无显著差异的抗原性两灭活病毒灭活的代理观察(图2)。

3.3。通过MTT测定细胞毒性评价

西尼罗河病毒灭活的细胞毒性βpl和福尔马林灭活BHK-21细胞系MTT比色定量测定。这是观察到13%的福尔马林处理病毒诱导细胞死亡和细胞βpl治疗病毒诱导细胞死亡细胞的12%。

3.4。体液免疫反应

体液抗体反应postimmunized小鼠血清间接ELISA的测量显示anti-WNV相比,福尔马林灭活抗原抗体滴定度比较高βpl灭活抗原。统计分析显示,两组之间无显著差异(图诱导体液免疫反应3)。ELISA效价JEV特定的多克隆血清可以忽略不计,进入截止的负面价值。

抗原的中和抗体反应要么通过失活的方法(βpl或福尔马林)显示高PRNT₅₀浓度(控制老鼠组相比)。尽管实验群体效价水平没有显著差异,但两失活过程引发了平等的保护效果。然而,postimmunized西尼罗河病毒特定的小鼠血清显示交叉保护性中和抗体的1:针对JEV 25。

4所示。讨论

西尼罗河病毒入侵继续扩大其地理分布。因此,研究不同疫苗制备方法的安全性和有效性是重要的发展干预策略。我们的研究的主要目的是评估和比较的效率两个病毒灭活剂,福尔马林βpl,西尼罗河病毒。烷化剂,福尔马林βpl灭活病毒通过与病毒衣壳蛋白和核酸的化学反应。他们测试了在不同的实验标准使用浓度(17,18]。

结果获得了β实现pl和甲醛灭活证明完全失活在48至120小时包含0.1%的媒体β分别pl和0.2%的甲醛。的数量βpl需要灭活病毒的不同取决于病毒的群体。虫媒病毒组,0.05到0.1%pl是足够的17]。用福尔马林灭活甲型肝炎的病毒,和疫苗被发现是安全的和可致免疫实验模型(18]。是观察到的福尔马林灭活;浓度、pH值和介质成分是至关重要的。福尔马林的翻倍浓度26°C, pH值8.4,为失活(48小时是足够的24]。一个不完整的失活过程对公共卫生可能是致命的。委内瑞拉马脑炎爆发是由于不完全失活的疫苗由福尔马林灭活(25]。βpl引起结构改性烷基化和脱嘌呤核酸和能够灭活病毒在10 - 15分钟37°C,而福尔马林至少需要24 - 96小时在4°C-37°C条件相似条件下失活(26,27]。尽管通过福尔马林灭活RNA降解的确切机制尚不清楚,可能是由于病毒RNA,福尔马林反应形成N-methylol (N-CH2OH),紧随其后的是一个亲电攻击形成亚甲基桥氨基酸组之间导致核酸和蛋白质之间的交联。这种交联抑制逆转录提取RNA干涉的互补脱氧核糖核酸合成(28]。

研究表明更高程度的抗原性βpl的灭活病毒疫苗(29日]。在一项研究中比较βpl和福尔马林inactivaton脊髓灰质炎病毒,显著高于抗原恢复被发现βpl与福尔马林灭活抗原的抗原(30.]。然而,在我们的研究中,没有观察到显著差异抗原之间的潜力βpl和福尔马林灭活的西尼罗河病毒。都显示相同的抗原效价使用单克隆抗体的间接ELISA黄病毒(HX-B)。此外,它也可以支持高抗原效价获得HA试验在失活过程。在βpl失活效价最高,pH值6.6,而福尔马林灭活显示高效价与vad pH值6.2,6.6和6.8。稀释剂的pH值对HA反应有重要影响,影响不仅HA效价的准备,而且红细胞凝集的外观模式。它可能发生,所以,在βpl水解、pH值降低,导致构象变化哈,因为它已经被观察到的流感病毒(31日]。

研究在人类和动物模型表示一个有效的体液反应预防的重要性黄病毒感染周边和中枢神经系统内(32,33]。在目前的研究中,甲醛和βpl失活过程是同样有效的西尼罗河病毒失活的和能够引起针对西尼罗河病毒的体液免疫应答。然而,目前的研究是有限的,体液免疫反应只接种后7天到(π)。免疫原性反应研究必须完成屏幕每3个月π为1年。此外,其他灭活剂,如二进制乙烯亚胺(34]应该进一步比较和评估不同的失活剂对先天免疫的影响研究(细胞介导的免疫反应)应该制定最好的西尼罗河病毒疫苗制备合适的方法。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项研究是由印度医学研究理事会()。支持Pritom Chowdhury和Rashmee Topno ICMR,开展博士高级研究奖学金计划。

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