调查种在作为轮状病毒肠胃炎的潜在治疗药物

文摘

轮状病毒(RV)感染导致全球婴幼儿严重腹泻。许多国家疫苗可用,但成本高昂,只有减少严重的症状。接种疫苗的婴儿继续减少感染性粒子,研究显示减少RV疫苗的功效在热带和亚热带国家最需要的地方去。持续监测新房车菌株,疫苗有效性的评估和开发成本有效的抗病毒药物仍然房车研究的一个重要方面。本研究旨在确定抗氧化和消炎的功效种在抑制房车复制。花生(答:hypogaea)毛状根培养诱导产生种在,由高性能逆流色谱法纯化(HPCCC)和高效液相色谱分析。HT29。f8细胞种在RV感染的存在。细胞生存能力方面没有显示出对HT29细胞毒性的影响。f8细胞。病毒感染性滴度计算和相对评估来确定种在治疗的影响。两种在trans-arachidin-1 trans-arachidin-3,显示在房车传染性滴度明显降低。免疫印迹分析在受感染的细胞溶解产物补充传染性滴定和表示病毒复制的显著下降。这些研究显示对房车的种在复制的治疗潜力。

1。介绍

RV-induced腹泻的机制是多因素疾病,包括分泌和malabsorptive腹泻组件。尽管付出很大的努力,我们没有一个完整的理解的房车病理生理学(1]。疫苗策略对RV-associated腹泻旨在刺激免疫系统使用减毒活房车或房车蛋白(2]。有两个许可房车疫苗在美国,其一,由默克公司和Rotarix,葛兰素史克公司生产的。两者都是有效预防接种疫苗的儿童严重腹泻(3,4]。Rotavac,最近,一种新的房车疫苗开发使用应变的RV孤立、制造、测试和在印度海得拉巴Bharat生物技术国际有限公司(5]。这些疫苗是为了防止常见的房车菌株的遗传稳定性,因此依赖于病毒。重组事件很常见,可能导致新的毒性房车现有疫苗毒株可能无法避免的(6]。同样,RV感染人畜共患的特性支持的参数继续调查对新兴房车菌株引起的跨物种传播与潜在的疫苗失败(7]。上述许可房车疫苗更有效的在撒哈拉以南非洲和东南亚国家最需要的地方(8- - - - - -11]。此外,高成本,分配有限的可用性,以及后勤工作落后的发展中国家的疫苗是挑战性的问题(3]。因此,成本效益的发展,容易分散,小说,host-oriented抗病毒范式需要影响广泛的房车压力和减少RV感染的疾病负担。利用天然产物的抗氧化和消炎作用治疗RV感染符合小说的原则治疗策略有一个抗病毒效果。

种在是酚类化合物来源于phenylpropanoid /乙酸途径。在这些化合物中,反式白藜芦醇(收发)是最广泛研究种在展示了强大的抗氧化剂和chemopreventive属性(12]。此外,研究白藜芦醇及其衍生物显示抗病毒特性。白藜芦醇在MDCK细胞强烈抑制流感病毒的复制,提高生存和降低肺病毒传染性流感病毒感染小鼠的滴度。此外,白藜芦醇表现出没有毒性作用在体外或在活的有机体内(13]。然而,另一项研究测试了20的影响μM和40μM浓度的白藜芦醇孵化24和48小时postinfection多瘤病毒在3 t3和HL60细胞。结果显示细胞毒性以时间和剂量依赖性的方式和多瘤病毒DNA合成的抑制作用。没有细胞毒性效应或细胞系有0.02%二甲亚砜(DMSO)独自一人14]。另一项研究发现白藜芦醇衍生物和强有力的anti-HSV-1 HSV-2活动。几个三聚物的四聚物的衍生品显示antiherpetic活动以个位数微摩尔的浓度(15]。

种在是由一群植物包括葡萄、花生、和一些浆果[12,16,17]。反式-Piceatannol (t-PA)是一种羟化模拟小数量的葡萄中含有的白藜芦醇和花生。反式-Arachidin-1 (t-A1)是一个prenylated piceatannol (3-methyl-1-butenyl)模拟,而反式-arachidin-3 (t-A3)是一个prenylated白藜芦醇(3-methyl-1-butenyl)模拟(数字1(一)- - - - - -1 (d))。t-A1和t-A3都生产的花生在真菌的挑战。可以从一些植物中提取这些种在但不适合许多应用在食品/医药行业由于整体种在低浓度的植物提取物。提供一个高度和stilbenoid-enriched产品定义,毛状根培养的花生(一个。hypogaeabioproduction系统)已经建立了生产水平的提高种在,包括t-A1和t-A3,治疗后细胞内(18,19]。t-PA和收发商用,但t-A1和t-A3仍在实验阶段导致的机会探索新的抗病毒生物活性。

本研究评估的治疗潜力四种在,收发,t-PA t-A1, t-A3(数字1(一)- - - - - -1 (d)),抑制房车文化使用克隆人类感染肠细胞系,HT29。f8 (20.]。这个工作的假设是种在调节RV感染期间生成的病毒载量。两组实验进行不同浓度的种在和两个时间点postinfection进行评估。确定的影响种在期间产生的病毒感染,病毒感染性滴度测定使用上层清液为每个不同的治疗(10μM和20μ种在)收集在12和24小时postinfection (hpi)。病毒感染性滴度产生的细胞种在使用集中处理形成单位(洁净)分析比较单独RV感染产生的传染性病毒滴度和RV感染0.02% DMSO溶液。结果报告为感染性病毒颗粒/毫升。免疫印迹分析从这些实验证明使用细胞溶解产物生成非结构化房车蛋白质的存在(NSP4非结构蛋白4),多功能病毒蛋白,对于病毒复制和传染性病毒颗粒的生产(21]。

2。材料和方法

2.1。细胞,病毒,和试剂

这项研究的目的是测试的效果(s)四种在HT29房车复制。F8细胞种在的变量浓度和不同的收集时间。剂量是基于之前的研究,评估20的影响μM白藜芦醇和0.02% DMSO在两个细胞系多瘤病毒感染(13,14]。另一项研究利用不同浓度的DMSO和更高浓度的白藜芦醇(50,100年和200年μ米)在流感A-infected细胞系。50和100μM浓度的白藜芦醇没有细胞毒性细胞(13,14]。基于这些结果,我们选择测试10μM和20μ米每一种在浓度随着DMEM 0.02% DMSO溶液。总共五个实验每种在集进行。在第一组实验,细胞被感染SA114F房车在感染复数(MOI) 2之前报道的22]。在第二组实验中,0.02% DMSO溶液添加RV感染证明0.02% DMSO溶液用于溶解种在没有影响细胞的生存能力或生产房车。在第三和第四个实验集,10μ米到20μM种在的浓度,分别在DMEM可溶性0.02% DMSO,添加到RV培养液,并用于感染的细胞。第五集HT29无毒性。种在f8细胞治疗。第六集HT29无毒性。f8细胞治疗0.02% DMSO,第七集HT29无毒性。f8细胞(图2)。每组实验测试24-well组织文化的四个井(TC)板。媒体从四个井池和离心机和上层清液储存在−80°C和用于确定病毒传染性滴度。收集细胞在PBS,冻结,解冻三次,和离心机。收集上清液的细胞溶解产物和储存在−80°C到用于免疫印迹分析。使用两个化验病毒感染性滴度进行了一式三份,重点形成单位(洁净)和空斑形成单位(PFU)化验。等量的细胞溶解产物被用于解决病毒蛋白免疫印迹分析和房车NSP4探针。

2.2。种在Bioproduction和净化

毛根部的花生简历。船体(第3行)培养至少20 250毫升玻璃瓶,每个包含50毫升MSV的介质(如前所述)(18,23]。第九天的毛状根文化,从每个瓶花中被删除,取而代之的是抽取介质(新鲜MSV介质与9 g / L甲基-β环糊精(Cavasol支W7 M))和在黑暗中孵化28°C的额外72 h种在诱导合成和分泌到培养基最近描述(19]。在先启阶段后,培养基被撤每个瓶和总和。这个池中混合着同等体积的乙酸乙酯在分液漏斗中提取之前描述的种在[18]。乙酸乙酯相恢复,干在Rotavapor (Buchi)和t-A1 t-A3被HPCCC纯化,提取如下。干乙酸乙酯提取物在HPCCC resuspended溶剂系统(己烷:乙酸乙酯:甲醇:水(4:5:3:3))和注入光谱(动态提取)HPCCC系统。上阶段的溶剂系统是作为固定相,色谱法监测在340 nm紫外线。分数收集每30年代,SpeedVac干,并通过高效液相色谱分析。

高效液相色谱分析在Dionex峰会系统中,配备了光电二极管阵列检测器(PDA)。SunFire C分离了₁₈,5μ米,4.6×250毫米列(水)在40°C 1.0毫升/分钟的流量。2%的甲酸水的流动相包括(A)和甲醇(B)。该方法从100%开始1分钟。然后进行线性梯度从40%和60%至35%和65% B(1 - 20分钟),紧随其后的是一个线性梯度从35%和65%到100% B(20到25分钟)。然后列与100%洗5分钟(25 - 30分钟)。引起花生seed-derived t-A1和t-A3被用作参考标准(23]。

纯度HPCCC后获得的分数是由高效液相色谱监测使用紫外吸光度在280,320和340海里。选择分数也被质谱纯度检查使用终极3000超高液相色谱(UHPLC)系统(Dionex,热科学)加上LTQ XL线性离子阱质谱仪(热科学)中描述的沼泽et al。24]。包含t-A1 HPCCC分数和t-A3纯度95%以上基于高效液相色谱分析(UV 340海里)相结合,在氮气流干,用于病毒化验。的干质量纯化种在重组在0.02% DMSO 1μ莱克伍德,g / m胰蛋白酶(卫氏生化NJ)在DMEM培养基。之间的比较结果nonprenylated种在(源和t-PA)及其prenylated类似物(t-A3 t-A1, resp)合成/商用源(Sigma-Aldrich)和t-PA (Alexis)被用于这项研究。

2.3。细胞系和病毒

MA104细胞获得写明ATCC(马里兰州罗克维尔市)和HT29。F8细胞,自发极化细胞系,来自父人类腺癌(HT29)肠线20.]。细胞系被证实是免费使用MycoFind支原体污染支原体PCR工具包2.0版本(Clongen实验室、LLC)。房车SA11克隆4 f (G P[1]和[3]基因型)(25]在MA104细胞种植和效价,储存在−80°C。种在功效对房车使用HT29进行了测试。f8细胞。

2.4。可行性分析

生活/死细胞的百分比计算采用台盼蓝染料排斥试验如前所列出(26]。简单地说,~ 10的细胞悬液⁶细胞/毫升稀释1:1台盼蓝0.4%解决方案和加载到血细胞计数器。染色细胞的数量和总数量的细胞数,和清白的细胞的百分比计算报告为可行的细胞的百分比。以确定用于溶解疏水的0.02% DMSO种在不利影响HT29的寿命。F8细胞,进行了可行性分析和房车,房车与0.02% DMSO,细胞0.02% DMSO,细胞本身,房车与0.02% DMSO 10μM和20μM种在使用[描述的台盼蓝细胞排斥试验26]。

2.5。病毒量化

测试的生物活性种在RV感染、洁净和空斑形成单位化验进行如前所述[27,28]。MA104细胞增长到80%的融合24-well组织培养板(康宁生命科学),渴望胎牛血清感染前12 h,然后感染RV SA114F。短暂,SA114F房车股票是用(5分钟使用杯角依恋和冰浴Misonix超声发生器3000年Misonix, Inc .)法明岱尔,纽约)在无血清DMEM和孵化1μg / mL胰蛋白酶(卫氏生化,莱克伍德,新泽西)30分钟在37°C。激活病毒培养液细胞孵育1 h公司37°C的5%₂我的2。与血清DMEM培养液是取代补充1μg / mL胰蛋白酶现病史和孵化12和24。收集上清液,澄清在300 g×5分钟,储存在−80°C。这些细胞被洗冷杜尔贝科的PBS, 1 x(沉箱实验室、史密斯菲尔德、UT),并从板块发布使用trypsin-EDTA 0.25%解决方案(1 x)(沉箱实验室、史密斯菲尔德、UT)。后加入DMEM和5%的边后卫,这些细胞被resuspended在寒冷的PBS和稀释准备住/死细胞计数(见部分2。4)。平衡的细胞被用来准备细胞溶解产物通过反复冻融3次,进行澄清在300 g×10分钟。收集媒体(浮层),在300 g×10分钟澄清,储存在−80°C。细胞溶解产物和上层清液都储存在−80°C。病毒感染性滴度都是一式三份的间接immunofluorescent染色MA104单层膜感染串行上层清液的稀释。荧光疫源地的平均数计算三个井和用于确定聚焦形成的数量单位/毫升(洁净/毫升)29日]。自RV病毒感染性滴度是至关重要的对我们的结论,两个化验使用。洁净工程数据显示没有区别病毒感染性滴度在12 hpi使用10μ浓度(数据未显示)。因此,我们选择执行空斑形成单位(PFU)分析比较这两个控件,房车,房车与0.02% DMSO 20μ现病史的种在24。斑块形成分析进行了一式三份的上面列出洁净化验,除了小时后感染;病毒培养液换成3毫升的媒介覆盖(1:1 1.2%琼脂糖的混合物(先端低熔点琼脂糖,杰纳西科学Inc .)和完整的2×MEM包含0.5μg / mL胰蛋白酶)和37°C 5%孵化有限公司₂3到4天或者直到斑块变得可见。一个中性红叠加(1:1的混合物与同等体积的无血清2×1.2%琼脂糖MEM包含50μg / mL中性红)的制备和2毫升/污点覆盖了第一个琼脂糖/介质覆盖。six-well板块在37°C,直到孵化斑块是可见的(大约4 - 24小时)。个人斑块数和浓度计算如下:斑块数量××1 / 1 /稀释因素(培养液的mL) =空斑形成单位/毫升。

2.6。统计分析

数据表示为平均数±标准差,通过方差分析和比较在统计学上评估(方差分析)和学生的测试使用Excel(显著性水平,≤0.05)。

2.7。蛋白质定量和免疫印迹分析

微bicinchoninic酸(BCA)蛋白质分析来量化蛋白质浓度使用牛血清白蛋白作为标准/制造商的协议(热科学皮尔斯)。从每个样本一微克总蛋白质的12.5% sds - page分离,在硝化纤维膜,electroblotted和探测NSP4 peptide-specific抗体(30.,31日)和活性乐队被添加可视化HRP-conjugated免疫球蛋白和超级信号西方Pico化学发光底物(皮尔斯)其次是暴露在柯达X-OMAT电影(22,32,33]。

3所示。结果与讨论

3.1。Bioproduction种在的毛状根文化的花生

生产种在t-A1 t-A3我们使用先前建立毛状根3号线从花生的简历。船体。这些毛茸茸的根能合成和分泌收发,t-A1, t-A3培养基在治疗诱导子乙酸钠(18]。根据诱导子处理的周期,级别和类型的种在发现在中可以修改(18]。研究的影响其他细胞内生产t-A1和t-A3我们测试了不同的细胞内,包括甲基-β环糊精(CD)。在初步实验中不同剂量的CD被添加到毛状根文化为0到96之间的不同时期h(数据未显示)。72 h治疗9 g / L CD选择是基于生产t-A1的最高水平。如数据所示3(一个)- - - - - -3 (c),t-A1和t-A3主要种在培养基中。源是出现在非常少量的提取物。净化t-A1 t-A3,乙酸乙酯提取物制成培养基和受到HPCCC(高效逆流色谱法)。以前所使用的溶剂系统是改编自共产党(离心分配色谱法)系统,有效地净化t-A1 t-A3从毛状根培养基中提取(16]。唯一的修改是更换庚烷为甲醇乙醇和正己烷。分离是有效的,与前一个实现(16]。因此高收益率的高纯度的分数t-A1和t-A3实现中使用了抗病毒化验。

3.2。HT29的可行性。F8细胞0.02% DMSO溶液的存在

生活/死细胞的百分比计算使用染料台盼蓝排斥试验(数字2(一个)- - - - - -2 (d))。在现病史24,所有组之间细胞生存能力测试(HT29。f8细胞房车,HT29。f8细胞房车和0.02% DMSO, HT29。f8细胞与RV和10μM种在,HT29。f8细胞和房车20μM种在,HT29。f8细胞与20μM种在,HT29。f8细胞0.02% DMSO, HT29。f8细胞)并没有统计上显著不同()。这些数据显示,房车的加入可以提高细胞死亡,但没有明显的时间检查。此外,添加20μM浓度种在减少细胞的生存能力但不显著,而添加0.02% DMSO文化系统没有影响HT29的可行性。f8细胞文化或降低病毒复制(数字2(一个)- - - - - -2 (d)和6)。这些数据表明HT29。房车f8细胞没有不利影响,0.02% DMSO,或浓度20μ米四种在测试(t-A1收发,药t - pa,或t-A3)。

3.3。种在的影响感染轮状病毒粒子的生产

传染性病毒滴度测定使用洁净上层清液的化验RV-infected HT29。f8细胞种在处理(10μM和20μt-A1 M收发,药t - pa,或t-A3)。上层清液收集在12 hpi相当于RV-infected控制细胞(数据未显示)。同样,在现病史24,20μ米的浓度nonprenylated种在、收发和t-PA,证明没有改变病毒效价相比RV-infected控制(数字4(一)和4 (b))。然而在24 hpi, 10μM t-A1产生了十倍的浓度减少病毒传染性效价相比RV-infected控制上层清液(),20μM的浓度t-A1生成twenty-fivefold降低病毒传染性效价相比RV-infected控制上层清液()(图4 (c)),然而,有一个统计区别房车,房车DMSO的8倍减少传染性病毒滴度与RV和DMSO ()(图4 (d))。10μM t-A3产生了九倍的浓度减少病毒效价相比RV-infected控制上层清液(),20μM t-A3生成浓度九十- 8倍降低病毒效价相比RV-infected控制上层清液()(图4 (d))。

因为洁净化验的数据生成关键测试我们的假设,空斑形成单位化验(PFU化验)进行以证实洁净化验的结果。PFU化验都使用相同的执行上层清液,利用洁净化验。斑块数,三个实验的平均值计算空斑形成单位/毫升(数据用图表表示5(一个)- - - - - -5 (d))。

产生的数据利用PFU化验显示相似褶皱与洁净工程分析如图所示(数据的差异5(一个)- - - - - -5 (d)和4(一)- - - - - -4 (d)、职责)。使用方差分析和学生的以及,平均和标准偏差计算和画(数字4(一)- - - - - -4 (d)和5(一个)- - - - - -5 (d))。PFU实验使用t-Pa和收发没有统计学差异控制,与DMSO房车,房车,房车和10μ与20 M t-Pa /源,或者房车μM t-Pa /收发数据5(一个)和5 (b))。然而,实验数据从t-A1 PFU化验证明fifty-sevenfold差异控制,房车,和forty-ninefold差异控制,房车和DMSO统计学意义(和0.04,分别地)(图5 (c))。同样,从20个实验数据μM t-A3 PFU化验证明fifty-fivefold差异的控制,房车,和sixty-onefold差异控制,房车和DMSO统计学意义(和0.02,分别地)(图5 (d))。两个化验显示显著降低房车传染性滴度的20倍μM t-A3。

3.4。免疫印迹(WB)分析意味着不同的房车复制

补充和可视化差异显示在病毒传染性浓度之间独自房车,房车DMSO, 20μM t-A1, 20μM t-A3,免疫印迹分析进行如前所述[22,32,33]。使用相应的细胞溶解产物,等量的蛋白质为主的病毒蛋白类型4,NSP4,被发现在所有RV-infected细胞溶解产物。房车,房车的免疫印迹数据DMSO都展示了相对等量的multimeric形式和diglycosylated(完全糖化)monoglycosylated,乳沟NSP4的碎片和表明,0.02% DMSO并不影响NSP4生产的数量在RV感染(图6通道1和2)。multimeric的存在形式的NSP4之前已经研究[34- - - - - -36]。结果与t-A1房车和t-A3显示相对少量的完全糖化NSP4(图的形式6,车道3和4)。这表明病毒复制是负面影响20μM t-A1和t-A3。细胞溶解产物没有房车(图6,巷5)揭示没有乐队和显示anti-NSP4抗体的特异性。

4所示。结论

我们的数据显示剂量和时间减少病毒后代当房车和prenylated种在(t-A1或t-A3)与人类肠细胞系HT29.F8孵化。非结构的存在的病毒蛋白NSP4免疫印迹分析证实了RV感染和HT29表示病毒复制。f8细胞。的prenylated种在,t-A1 t-A3,明显比的亲脂性的nonprenylated源或t-PA分子。prenylated侧链分子的亲油性增加它。因此,prenylation促进协会通过细胞膜和渗透。亲油性增加经常积极增加相关生物活性在不同组的类似结构的化合物(37,38]。几个运载系统包括乳剂和纳米颗粒检测的亲脂性的,具有生物活性的天然产物(39]。取决于应用程序,这些运载系统可以适用于t-A1 t-A3和测试应该推进其发展作为潜在的治疗药物。

尽管t-A1保护作用的分子机制和t-A3并不知道,病毒复制的抑制作用可能是由于种在抗氧化和消炎的成分。在先前发表的论文,t-A1和t-A3已被证明调节大麻素受体在微摩尔的水平(40]。之前研究的实验数据表明,t-A3大麻素受体1 (CB1R)作为一个竞争对手,而t-A1对抗CB1R受体激动剂的竞争性和非竞争性机制(40]。有趣的是,HT29细胞线,父HT29细胞线。f8,大麻素受体表达41),和受体表达对HT29应该调查。f8克隆细胞。这些受体的神经信号系统是众所周知的调节胃肠功能,如胃排空、分泌和肠道蠕动42,43]。因此它是合理的建议之间的连接房车肠胃炎的大麻素受体的功能和机制。研究结直肠癌,大麻素CB1和CB2受体受体激动剂被证明有一个通过肿瘤坏死因子对细胞凋亡的影响α增加介导神经酰胺生产(44]。另一项研究对乳腺癌显示了受体受体激动剂抑制腺苷酸环化酶活性,营地,和PKA活性基因转录的差别导致了对这些45,46]。cAMP-dependent PKA机制似乎也是重要的房车发病机制在人类肠道细胞系,Caco2 [47]。

提出了最近,大麻素受体拮抗剂对丙型肝炎病毒作为潜在的治疗药物调节脂质稳态(48]。憔悴的研究等。49)使用RV-infected MA104细胞显示剂量依赖性降低病毒传染性病毒RNA生产的TOFA (5 - (tetradecyloxy) 2-furoic酸),脂肪酸合成酶抑制剂的酶复杂(49]。此外,房车的传染性ACC1击倒细胞降低了8.5倍(意义重大,小干扰rna针对ACC1),基因编码的酶催化palmitoyl-CoA的病原反应一步合成途径。这强烈表明,房车传染性介导通过脂肪酸代谢(49]或选定的脂肪酸。

总之,这些数据可能意味着抗病毒机制t-A1 t-A3通过调制的大麻素受体和随后的宿主细胞中脂肪酸代谢的变化。需要更多的研究来证实和扩大我们的知识的RV t-A1和t-A3减少属性。因此,这些化合物可能可以用于设计和开发更有效的房车治疗药物。

缩写

房车:	轮状病毒
洁净工程:	集中形成单位
空斑形成单位:	空斑形成单位
白平衡:	西方的屁股
NSP4:	非结构蛋白4
现病史:	小时postinfection
DMSO溶液:	二甲亚砜
的边后卫:	胎牛血清
DMEM:	杜尔贝科最小的重要媒介
t-A1:	反式-Arachidin-1
t-A3:	反式-Arachidin-3
t-PA:	反式-Piceatannol
t-Rev:	反式白藜芦醇
我:	感染复数
TC:	组织培养
毫西弗:	修改Murashige和斯库的媒介。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项工作是支持的动物公式卫生批准号ah - 9240从美国农业部合作状态研究,教育和推广服务。这项工作是支持的研究和赞助项目办公室斯蒂芬·f·奥斯汀州立大学(研究试点研究。107552-26112-150)。这项工作是由美国国家科学Foundation-EPSCoR(批准号eps - 0701890;中心Plant-Powered Production-P3),阿肯色州资产倡议和阿肯色州的科学和技术权威。

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