筛选病毒病原体从儿童疫苗接种后回肠组织样本

文摘

2010年,研究人员报道,两个US-licensed轮状病毒疫苗包含DNA或从猪圆环病毒DNA片段(PCV)。虽然PCV,一种常见的病毒在猪,不是认为导致人类疾病,这些研究结果提出了一些安全问题。在这项研究中,我们试图确定病毒,包括PCV,可以发现在回肠组织样本的儿童接种疫苗的两轮状病毒疫苗。广谱,新颖的DNA检测技术,劳伦斯利弗莫尔微生物检测数组(LLMDA),是利用,确认病毒病原体使用聚合酶链反应(PCR)。LLMDA技术最近被用来识别PCV从一个轮状病毒疫苗。回肠组织样本进行了分析从21个受试者,年龄在15 - 62个月。PCV没有检测到任何回肠组织样本的LLMDA或PCR。LLMDA识别人类轮状病毒疫苗的从一个主题,这可能是因为最近从野生型轮状病毒感染。人类parechovirus LLMDA还指出,一个共同的胃肠炎病毒感染,从两个科目。此外,LLMDA检测常见的胃肠道细菌的生物肠杆菌科,类杆菌,链球菌科家庭从几个科目。这项研究提供了一个从小儿病毒性和细菌性病原体回肠的调查样本,并可能揭示未来的研究来识别病原体对儿童接种疫苗。

1。介绍

轮状病毒是最常见的婴幼儿严重腹泻的原因之一(1]。轮状病毒感染轮状病毒疫苗的引进之前,据估计,导致大约270万例儿童严重的肠胃炎,几乎60000人住院,仅在美国每年大约37人死亡(2]。三个轮状病毒疫苗开发:轮盾(Wyeth-Lederle疫苗和儿科,3]),其一(默克公司(4]),Rotarix(葛兰素史克公司,5])。轮盾,rhesus-based四价轮状病毒疫苗,建议1999年美国婴儿常规免疫接种的(6]但在1年内退出美国市场的介绍,因为它与肠套叠(7]。其一,human-bovine重组轮状病毒疫苗(8),是2006年美国婴儿疫苗接种(推荐9]3剂量的口服药物在年龄在2,4,6个月(10]。2008年,Rotarix人类轮状病毒(单价基于减毒疫苗11),被授权在美国儿科作为服用系列和推荐接种疫苗的婴儿(2008年6月12]。轮状病毒疫苗的引进以来,出现了戏剧性的降低轮状病毒感染的发生率和严重程度都在美国和全球13- - - - - -16]。

小说发展过程中病毒检测技术,研究人员在旧金山血液研究系统研究所和劳伦斯利弗莫尔国家实验室(LLNL)出人意料地发现从Rotarix的外源病毒核酸17]。检测到病毒共享98%的同源性,即猪(PCV-1)和覆盖完整的圆形基因组(17]。PCV感染是常见的猪病毒通常是发现在人类粪便样本(18),但并不认为引起人类的疾病(19- - - - - -21]。污染的Rotarix PCV-1随后证实了疫苗制造商。2010年3月,根据这些发现,美国食品和药物管理局(FDA)建议暂停使用Rotarix [22]。2010年5月6日,FDA公布初步调查结果,其一疫苗还含有可检测PCV材料(23]。

2010年5月7日,FDA生物制品疫苗和相关咨询委员会(VRBPAC)开会审查是否被污染的轮状病毒疫苗可能会对人类健康构成风险。委员会得出结论,基于现有证据,PCV感染人类的假设的风险不超过所观察到的好处轮状病毒疫苗在预防严重急性肠胃炎的婴儿。委员会表示安慰,DNA和DNA片段的检测PCV的轮状病毒疫苗不可能对人体造成伤害,建议关于这一主题的信息提供给父母之前接种疫苗。委员会所做的,不过,建议免费疫苗制造商开发工作轮状病毒疫苗PCV1和PCV2污染物。2010年5月14日,美国食品药品管理局发布了儿科医生建议恢复使用其一Rotarix和继续使用的24]。后续测试的疫苗制造商确认PCV材料被引入两轮状病毒疫苗通过porcine-derived胰蛋白酶,一个试剂用于疫苗生产的细胞培养生长过程,很早就开始在开发过程中(17,25]。使用来自其他物种的细胞或生物制品生产的疫苗会导致细胞DNA和泄漏的引入非传染性的病毒DNA (17]。

虽然最近的宣传对轮状病毒疫苗的潜在安全问题似乎并没有对疫苗的管理实践有一个负面影响大多数医生,它提高了安全的担忧有些家长26]。本研究的目的是运用一种新的DNA检测技术,劳伦斯利弗莫尔微生物检测数组(LLMDA), (27,28)来确定病毒或细菌的DNA DNA片段,包括PCV、回肠组织样本中可以发现儿童接种轮状病毒疫苗。

LLMDA的核酸检测技术,其中包含388000探针,设计检测2200种病毒(38000年目标序列)和900种细菌(3500目标序列)。这个芯片使用长(50 - 65碱基对)寡核苷酸探针,使敏感检测已知病毒和细菌的种类和不同的检测到测序生物物种的同源性。数组数据分析使用一种新型复合可能性最大化方法预测菌株和物种最可能出现在一个示例。每个目标检测日志分数可能性,估计爆炸相似分数的探测每一个可能的目标序列,与探针序列复杂性和共来自爆炸的结果。目标颜色和按分类分组的家人。这个数组已经被用于检测多种病毒感染不同临床样本27]。

尽管各种核酸检测技术包括TaqMan PCR和基于Luminex珠的系统能够识别病原体选择物种或快速应变水平,他们没有能力提供关于已知或小说广谱检测生物体。同时测序提供了最深入的信息来描述微生物基因组,成本,劳动力,和时间与图书馆相关的制备、测序、生物信息学分析和数据存储可能会禁止在分析许多隔离检测病原体。微阵列提供了一种方式为广大测序病原体的监测与分析时间和成本接近PCR检测。在这项研究中,我们首先使用LLMDA屏幕病毒性和细菌性病原体在人类回肠样本,然后利用PCR证实微阵列发现。

2。材料和方法

2.1。道德声明

本研究奥斯汀多机构审查委员会批准(AMIRB)。受试者将慢性消化系统症状进行诊断ileocolonoscopy期间从2008年1月至2010年12月。他们招募了从一个儿科胃肠病学临床和书面知情同意是收到入学前所有受试者的父母或监护人。21受试者年龄在16岁到52个月被包含在本研究中,并且代表15雄性和雌性6。受试者(我)接种轮状病毒疫苗()使用两种轮状病毒疫苗(Rotarix或其一);(2)接种疫苗,但不反对轮状病毒();或(3)未接种疫苗()。人口统计和疫苗状态如表所示1。

2.2。样品采集和处理

少量活检的回肠末端收集使用标准一次性钳活检装置,按照常规活检诊断协议。每个切片检索立即被切割,这样至少一半活检是固定的后续临床病理组织学检查。剩余的样本直接放置到RNAlater(试剂盒Inc .,瓦伦西亚,CA) 24至48小时,然后储存在−80°C到处理。所有样本编码和关于疫苗接种的地位也不清楚。样本运往LLNL干冰。据报道的一个示例PCV-contaminated其一生活、口腔、五价的疫苗(很多0147 z)也包括在分析中。PCV-contaminated Rotarix不是可供分析。

2.3。从人类回肠和疫苗样本中提取核酸

2.3.1。提取从人类回肠

一个回肠每个病人样本中提取。每个回肠大约20毫克,切成大约四个小块被放置在一个2毫升珠打管含有0.5克的1.0毫米氧化锆珠和500年μL冷汉克的缓冲盐溶液。管是珠打30秒速度25。珠打样品被离心法澄清后5分钟在15000×g。上层清液被转移到一个新的1.5毫升管继续核酸提取。由于少量的回肠组织可以在这项研究中,没有DNase治疗或过滤去除细菌和宿主细胞。病毒核酸提取使用试剂盒QIAamp UltraSens工具包(试剂盒)根据制造商的指示。后提取核酸的浓度决定使用表达载体量子位荧光计(表达载体,宏伟的岛,纽约)。大约400 ng的DNA和1.4μg的RNA提取后回肠样本了。

2.3.2。从其一中提取疫苗

其一疫苗提取样本进行分析。一剂疫苗包含2毫升;因此,两个1毫升的抽取,进行。每个1毫升提取进行了使用QIAamp UltraSens病毒工具包后,制造商的协议。后提取每个疫苗样本组合和核酸浓度决定使用一个量子位荧光计。

2.4。微阵列处理

2.4.1。全基因组扩增和净化

提取的回肠和疫苗样本全基因组放大像前面描述的那样使用一个随机扩增协议(26]。短暂,50 ng从每个末端回肠的DNA样本和10 ng其一疫苗的DNA样本中使用了放大过程。放大过程是由孵化每个示例1μL的随机引物5′-GATGAGGGAAGATGGGGNNNNNNNNN-3′(100 pmole /μL)在85°C 2分钟,立即放在冰2分钟。每一个反应,4μL 5 x上标三世缓冲区,1μL核苷酸(12.5毫米),2μL德勤(0.1米),1μL表达载体上标三世逆转录酶,1μL超纯DEPC水(表达载体)补充道。样品被放置在一个四分体ptc - 225热循环(MJ研究,魁北克,加拿大)下列条件:25°C 10分钟,2小时42°C, 70°C的5分钟。第一链合成后,每个20μ2.4 L样本混合在一起μL 10 x克莱诺缓冲区(新英格兰生物学实验室,伊普斯维奇,MA)和0.5μL 12.5毫米核苷酸(新英格兰生物学实验室)。接下来,样本孵化2分钟在85°C和立即放在冰2分钟。最后,1μL克莱诺缓冲区添加到样品和被允许在37°C孵化60分钟紧随其后20分钟70°C。

样本放大通过结合5μL的双链cDNA产品5μL 10 xσTaq缓冲区,1μL核苷酸(12.5毫米),1μL引物5′-GATGAGGGAAGATGGGG-3′(100 pmole /μL), 1μLσKlenTaq LA聚合酶,37岁μL水。反应是放置在一个thermocycler(四分体热循环,乔丹研究,魁北克,加拿大)下列条件:94°C 2分钟;40 94°C的周期为30秒,50°C 1分钟,1分钟和68°C;并为10分钟72°C。使用Qiaquick放大样品纯化PCR净化列(试剂盒)根据制造商的指示。在40个样本筛选了μL缓冲EB的试剂盒装备和核酸浓度由量子位荧光计。

2.4.2。微阵列杂交

我们LLMDA v2用于分析组织或疫苗的病毒或细菌内容样本。这个数组包含所有测序388000探针来检测病毒和细菌,我们测序前2007年4月(28]。此外,我们分析了样本的一个子集,使用多路复用的LLMDA v2格式印在罗氏罗氏(Roche罗氏,麦迪逊,WI) 4×72 K数组格式。样品1 - 8和10运行在4×72 K LLMDA的格式。其他样品和其一是运行在388 K的LLMDA格式。

对于每一个样本,1μg放大产品的使用一种颜色是荧光标记的DNA标记工具包(罗氏罗氏)根据推荐的协议。标签和杂化后的DNA纯化使用罗氏杂交工具包LLMDA根据制造商的指示。17个小时的微阵列被允许杂交和洗使用罗氏洗缓冲设备根据制造商的指示。微阵列扫描在一个轴突GenePix 4000 b 5μ扫描仪(分子器件、桑尼维尔CA)。扫描tiff图像文件一致使用NimbleScan 2.4版软件和对文本文件导出为数据分析。

2.5。微阵列数据分析

数据分析使用自动LLMDA分析algorithm-composite可能性最大化算法(28]。99%的阈值只用于数据分析来分析探测器与信号强度99%以上的随机控制。随机控制不杂交的探针任何已知的目标序列,设计比赛的整体GC含量和热力学目标探测。

2.6。PCR引物设计确认LLMDA的病毒病原体

Taqman签名设计使用run Primux三合脚本的一部分Primux软件(29日]病毒中发现回肠样品5,7,9,11和14。目标集组成的完整序列可用以下病毒:转矩塔诺河病毒(TTV)——minivirus(6基因,验证示例7),人类parechoviruses(44基因组,验证样本9),小anelloviruses和扭矩塔诺河midi病毒(TTMV)(20基因组,样品11和14),艾柯病毒9(7基因,验证样本5)和轮状病毒(7077序列,所有部分,样品5)。使用simulate_PCR预测目标被确定。pl(提交,https://sourceforge.net/projects/simulatepcr)根据LLNL比较大(48 GB)所有可用的内部数据库和组装完成从NCBI微生物基因组,多个公共和大学测序中心(如广泛,同时,IMG,桑格,新加坡,等等),从合作者,目前在48 GB的序列数据。从多个签名设计对于每一个目标,一个是选择预测来检测病毒及其附近的邻居报告的LLMDA样本的结果。引物序列和预期扩增子尺寸表中可以看到2。PCR检测PCV-2的84个基点PCR试验从先前的研究其一疫苗25使用了)。

2.7。PCR分析

DNA PCR引物被命令通过集成技术。每个实时PCR反应由2.5μL 10 x PCR缓冲(表达载体),1μ(10 L正向/反向引物组合μ1.75米),μL MgCl₂(50毫米),1μL BSA (2μ克/μL), 0.5μ0.25 L核苷酸(10毫米)μL表达载体铂Taq (5 U /μL)和13所示μL水。所有反应在四分体ptc - 225进行了热循环与下列条件:95°C 3分钟;40 95°C的周期为20秒,60°C,持续30秒,30秒和72°C;和72°C 2分钟。反应与其一疫苗和其他控制运行1总DNA的ng、cDNA,而反应回肠样本总DNA或互补的运行10 ng。每个样本重复运行。PCR产品重复反应结合,然后运行在4%的琼脂糖凝胶。

3所示。结果

3.1。微生物检测结果数组

LLMDA的病毒检测的样品阵列如图1。微阵列数据分析参数设置都给细菌和病毒的结果与探针信号强度99%以上的随机控制探针。在样例5中,LLMDA检测探针杂交几段的人类轮状病毒和艾柯病毒9。检测轮状病毒片段似乎从人类的起源。LLMDA也发现了一个人类parechovirus 1从示例9。小anellovirus 2中检测出样品11和14。TTV-like minivirus样本中检测出7。人类内源性逆转录病毒(HERVs)被发现在大多数回肠样本(数据未显示)。这可能是由于人类基因组DNA样品中残留。没有其他病毒的目标是确定从其他回肠样本。 A summary of the viral results is shown in Table3。LLMDA识别几个部分的人类轮状病毒(9段7日,和3)从其一疫苗(图1)。几个牛轮状病毒序列片段包括段1、2、6也被检测到。此外,狒狒内源性病毒株M7被检测到,可能由于其一是由猴子细胞系。

此外,LLMDA也发现细菌的回肠样本,总结在表4。拟杆菌物种被识别样本1、5、6、15、18、20。质粒的志贺氏杆菌物种在样品中发现5和15。链球菌agalactiae样品中检测出15种,链霉菌属coelicolor中检测出样品20。

3.2。PCR分析确认芯片结果

病毒检测到芯片和微阵列的负面PCV结果都证实了PCR检测(图2)。PCV-2 PCR结果如图2(一个)。没有一个人类回肠样本显示任何乐队84个基点,预期的PCR扩增子的大小。其一样本和一个积极的控制样本写明ATCC细胞系(PK-15)乐队在84个基点的凝胶。

轮状病毒从样本5 PCR和其一疫苗在140个基点(图给预期的乐队2 (b))。PCR的TTV-like minivirus从样品7和积极的控制从先前的研究发现预期的乐队在112个基点。此外,艾柯病毒9 PCR从样本5检测到一个预期的产品112个基点。PCR的人类parechoviruses 1从示例9发现预期的产品113个基点。小anelloviruses PCR从样品11和14产生预期的乐队在118个基点(图大小2 (c))。

4所示。讨论

我们分析了21个人类回肠末端样本,从儿童进行常规的结肠镜检查,获得的任何病毒和细菌病原体,和评估任何关联特定病原体的疫苗接种。LLMDA v2的样本进行了分析,其中包含DNA探针来检测所有测序病毒和细菌(28]。病毒检测到的LLMDA随后被证实了PCR检测。肠道粘膜是一种理想的组织研究病毒-宿主相互作用,因为它是回肠派尔集合淋巴结淋巴细胞组成的补丁,这是重要的免疫监视的肠道流明。回肠样本收集的孩子,(i)充分接种疫苗包括针对轮状病毒;(2)之前接种疫苗,但不是针对轮状病毒;或者(3)完全未接种疫苗。

总的来说,没有特定的病原体之间的相关性,从这项研究中,确定免疫接种状况之间的相关性识别病原体也不是和疫苗接种轮状病毒疫苗。PCV没有检测到任何回肠样品通过微阵列或PCR分析。

其一疫苗,先前的示例显示包含PCV包括DNA分析但PCV-contaminated Rotarix疫苗不是可供分析。其一的样品检测轮状病毒疫苗和狒狒内源性病毒,之前报道的维多利亚和他的同事们(17]。狒狒的起源内源性病毒被认为是有关非洲绿monkey-derived州立细胞株用于制造和交叉融合其内源性逆转录病毒的狒狒内源性逆转录病毒探针(17]。

其一微阵列分析没有检测PCV的疫苗,证实了前面的结果由维多利亚等人,LLMDA检测PCV从其一Rotarix但没有检测PCV疫苗(17]。然而,PCV2在其一疫苗是由PCR检测化验。其一包含小PCV-1 PCV-2基因组片段,但没有包含检测PCV基因组的较大的部分(30.]。研究表明,在其一PCV的数量低于4000倍Rotarix的PCV的PCV其一难以觉察的是(25,31日,32]。Ranucci等人的一项案例研究报道,PCV-2 DNA片段的浓度在临床一致性很多是在以下范围的检测极限为6.4×10³拷贝/毫升时衡量QPCR, PCV1低于检测极限(0.1 - -0.8×10³拷贝/毫升)[30.]。目前的研究表明,PCV-2信号接近或高于PCR的检测极限,但低于LLMDA的检出限。PCV没有检测到任何回肠样品通过微阵列或PCR分析。也可能PCV片段其一疫苗已经从身体中被淘汰,因此没有PCV仍然回肠样本。

人类轮状病毒检测在一个回肠样本(样本5)通过微阵列和经PCR检测。这个样本来自一个完全接种疫苗的儿童从最近的轮状病毒感染和感染的可能。不太可能,这是剩下的轮状病毒,因为孩子是其一接种大约两年前。其一(默克公司)是一个五价的疫苗包含五减毒活疫苗菌株基因型G1P [5], G2P [5], G3P [5], G4P[5],和G6P[8],派生通过实验室重组的人类轮状病毒菌株牛G6P[5]轮状病毒毒株(w3c) [33]。LLMDA检测到病毒的某些领域,从人类的起源。基因型检测到在这个示例中,G2P[4],不是一个疫苗基因型和它已经发现G1P[8]接种疫苗的患者(34]。

在相同的样本5中,艾柯病毒9也确认了。此外,密切相关的人类parechovirus 1中确定样本9。人类parechovirus艾柯病毒9和1的检测芯片经艾柯病毒9和人类parechovirus 1特定的PCR检测。艾柯病毒是人类肠道病毒B的亚种在胃肠道中找到。人类肠道病毒引起轻微、胃肠道或呼吸道疾病(35),通常传播,超过95%的感染在2到5岁的儿童(35,36]。Nystrom等人最近发现人类肠道病毒物种B在回盲肠的克隆恩氏病(37),这表明这种病毒物种可能在克罗恩病发病中发挥作用或进展。

小anellovirus 2两个病人样本中,检测出。小anellovirus 2也称为转矩塔诺河midi病毒(TTMV)。TTMV和TTV在> 90%的成人世界随处可见,但没有完全建立人类致病性时段(38,39]。没有明显的病毒被确认在任何其他样本。分析大量的回肠样本将有助于进一步识别任何额外coinfecting病原体,以及这些病原体的出现频率。

LLMDA技术的应用提供了一个有效手段调查疫苗存在不定因素的情况下。在这项研究中,LLMDA没有检测PCV从儿科回肠标本的DNA序列;然而,LLMDA检测野生型轮状病毒、人类肠道病毒B,小anellovirus TTMV,常见的胃肠道细菌包括拟杆菌,志贺氏杆菌,和链球菌从一些样品,表明LLMDA可以作为一个工具来监控轮状病毒疫苗的有效性和检测再感染和与其他肠胃病毒或细菌合并感染,可能导致儿童肠胃问题。

5。结论

我们分析了21结肠镜检查的儿童回肠样本LLMDA数组筛选细菌和病毒的病原体和不定的代理可能与疫苗接种有关。我们发现野生型轮状病毒、parechovirus和几种常见胃肠道细菌制剂,拟杆菌,志贺氏杆菌,和链球菌从几个回肠样本。这项研究表明,广泛的技术,如LLMDA,可以作为疫苗的安全性和有效性的监视工具。

利益冲突

水晶j . ja谢伊n .加德纳和凯文·s·迈克劳林申请了一个专利申请(我们12/643,903;提起2009年12月21日)探针设计的劳伦斯利弗莫尔微生物检测数组。

确认

作者非常感谢家庭的孩子参加了这项研究。他们也感谢a Krigsman博士提供回肠研究样本用于这项研究。本文的观点是作者的,不能反映美国政府的官方政策或位置,能源部、国防部、美国空军。

引用

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