HCV RNA的基因分型显示3a是巴基斯坦马尔丹地区最普遍的基因型

摘要

丙型肝炎病毒(HCV)感染患者的临床预后范围从急性肝炎到慢性肝病，如肝硬化或肝细胞癌。识别感染病毒的基因型对于探索HCV感染的许多方面是必不可少的，包括流行病学、发病机制和对抗病毒治疗的反应。本研究对1419例患者进行了抗- hcv筛选，其中166例(11.7%)经免疫层析检测阳性。对166例抗- hcv阳性患者和26例正常人进行进一步分析。从血清中提取RNA，逆转录为cDNA，以HCV基因组核心区为靶点，采用多重PCR扩增。在121例患者中检测到HCV RNA，其中男性87例，女性34例。在观察到的所有基因型中，基因型3a最普遍，其次是3b。基因型1a、2a和2b分别占10.89%、13.22%和6.61%。25.41%的HCV RNA阳性标本未分型。6.05%的患者为混合基因型。 These findings will not only help the physicians to prescribe more appropriate treatment for the HCV infection but will also draw the attention of health-related policy makers to devise strategies to curb the disease more effectively.

1.介绍

丙型肝炎病毒(HCV)是世界范围内最常见的慢性病毒性肝炎病因。近年来，丙型肝炎病毒感染已成为世界各地急慢性肝病最常见的病因之一[1］．丙肝病毒是黄具有大约10 kb长的正意义单链RNA (ssRNA)基因组的家族。由于仅抗- hcv检测不能区分急性、慢性或消退感染，还必须进行补充检测，包括测量抗- hcv免疫球蛋白G活性指数[2]或抗体对特定的HCV结构蛋白和非结构蛋白的反应[3.]，以确认抗- hcv阳性结果[1］．众所周知，丙型肝炎病毒具有很高的遗传异质性[4.］．这使得HCV毒株可以被分为许多基因上不同的组，即基因型、亚型、分离株和准种[5.］．HCV毒株间的遗传变异性为类型全长序列同源性65.8% ~ 68.7%，亚型全长序列同源性76.9% ~ 80.1%，分离株和准种全长序列同源性90.8% ~ 99% [6.］．目前已鉴定出6个主要基因型，即1 ~ 6和50多个亚型。这些基因型在核苷酸序列上的差异为31 - 34%，而子型在全长基因组序列上的差异为20 - 23%。这种广泛的遗传异质性以及突变的趋势阻碍了针对这种病毒的疫苗的开发[5.］．由于感染不同基因型的患者对抗病毒药物治疗的反应不同，识别感染基因型是不可避免的，以指导当前联合治疗(聚乙二醇干扰素+利巴韦林)的正确剂量和时间[7.］．

丙型肝炎在巴基斯坦也很常见，但准确的流行病学信息相当有限。在城市外围和偏远地区，不合格的医疗和牙科从业人员、女性保健访问人员、助产士和理发师经常使用未经消毒的工具，这些工具是巴基斯坦城乡人口中传播HCV感染的主要潜在来源[8.］．虽然这种慢性病的确切比例尚不清楚，但各种研究表明，巴基斯坦3-7%的人口被感染[9.］．一项较早的研究报告称，Mardan地区8.9%的人口感染HCV [10.它是巴基斯坦开伯尔-普赫图赫瓦省的第二大城市。在开伯尔-普赫图赫瓦省的马尔丹地区，检测HCV基因型的程度和分布是非常重要的，在那里，治疗前的检测和基因型测定是散发的。因此，需要适当的信息来进行个体化治疗，以最大限度地增加每个个体患者成功治疗的机会，使HCV基因分型检测成为优化治疗类型、疗程和剂量的重要和有用的工具。本研究旨在确定活跃的HCV RNA感染以及了解在研究区域内循环的HCV基因型。

2.材料和方法

所有血液样本均来自马丹不同地区(医院和临床实验室)。在真空管中采集5cc的血液，分离血清或将全血存储在−80°C，以便在韩国科技大学生物技术系进行进一步分析。在采集血液样本时，还填写了一份形式表，以收集所有个人的医疗/临床信息并取得他们的同意。患者的病史、肝功能检查(LFTs)、黄疸、输血和其他不同的检查，如HBs Ag和抗- hcv，如果进行，要注明。这项研究得到了巴基斯坦科哈特科技大学(KUST)伦理委员会的批准。

2．1．检测试纸测试(ICT)

首先，根据制造商说明，使用ICT设备试剂盒(Accurate Diagnostic, Canada)对所有样本进行HCV抗体筛查。

2．2.RNA提取和cDNA合成(用于5'UTR检测)

从300株植物中提取RNAμL血液样本RNA提取试剂盒(RNA纯化试剂盒，Ultrascript, Anagen Technologies, Inc.， USA)。利用引物从提取的RNA的5'UTR区域合成cDNA。

2．3.常规PCR(用于5'UTR检测)

然后在下一轮常规PCR中使用特异5'UTR的义子和反义引物扩增合成的cDNA [11.］．cDNA取自上一轮，并在热循环器中运行。常规PCR的循环条件为I、II、III三步共25个循环。

2．4．巢式PCR(用于HCV 5’utr检测)

常规PCR后，利用第一对引物内的下一对引物进行巢式PCR [11.］．除引物外，混合物的制备方法与常规PCR相同。PCR循环条件与常规PCR相同。

2．5．电泳

12. μL在2%琼脂糖凝胶上分离。通过与100 bp的DNA阶梯标记(Fermentas, USA)进行比对，鉴定出230 bp的cDNA条带，并利用凝胶文件系统在紫外光照下进行可视化。

2．6．丙肝病毒基因分型

2.6.1。核心区域的cDNA合成

利用特异性引物从提取的RNA核心区域合成cDNA [11.］．反应在热循环器(美国Techne公司)中进行，使用与5'UTR相同的程序。

2.6.2。HCV第一轮PCR基因分型

两种引物(一种反向，一种正向)[11.在热循环器(Techne Inc.， USA)中扩增cDNATaqDNA聚合酶(Fermentas，美国)。

2.6.3。丙肝病毒Genotype-Specific PCR

利用类型特异性引物进行基因分型[11.对9种最常见的HCV亚型和类型(1a、1b、2a、2b、3a、3b、4、5a和6a)进行了HCV基因组核心区检测。为了区分不同的HCV基因型扩增产物，将型特异性混合PCR分为混合A和混合B。混合B除反义引物外，所有试剂均相同。采用与第一轮PCR相同的程序进行HCV基因型特异性PCR/多重PCR。

2.6.4。电泳

PCR产物在2%琼脂糖凝胶上分离，在0.5X TBE缓冲液中制备，并在紫外光下观察。通过将特定基因型的扩增产物(cDNA带)与100 bp DNA阶梯标记物(Fermentas, USA)进行比较，确定HCV基因型。

3.结果

筛选抗HCV共1419个受试者，其中HCV抗体阳性为抗HCV阳性，包含11.7％的筛选人群（图1和表格1)．共筛选出192人进行进一步研究，其中抗- hcv阳性166人，抗- hcv阴性(正常)26人作为对照，无明显丙型肝炎病史或症状的男性103例，女性63例，而在一般人群中，男性17例，女性9例1)．

所有受试者均采用PCR检测HCV RNA。在192例患者中，121例HCV RNA阳性，71例HCV RNA阴性。在121例HCV RNA阳性患者中，男性87例，女性34例。抗-HCV阳性男性16例，女性29例，未检出HCV RNA。在所有26例抗-HCV阴性个体(一般人群)中，巢式PCR扩增后未观察到HCV RNA，提示真正阴性对照。

通过靶向HCV基因组的核心区域的特异性PCR分析对受试者群体中不同基因型的患病率。在26.44％的抗HCV阳性个体中检测到HCV基因型3a，研究区域中最普遍的基因型。在16.52％后观察到HCV基因型3B，其次是基因型2a，13.22％和基因型1a为7.43％。在任何HCV RNA阳性患者中未检测到HCV基因型5A和6A。17.35％的样品使得在没有观察到基因型并且被使用的方法被宣布为可分别的方法。在4.13％样品中发现了HCV基因型的混合感染（图2)．

由于在该地区，雄性对雄性的高风险区域更频繁地访问了男性，HCV感染的机会比较高于女性。发现基因型3A分别感染雄性，分别是3B和2A的频率，而基因型2B和1A被发现是女性感染的主要原因。利用Roy最大的根源分析数据，用于HCV基因型对性别的相关性，发现不显着（RLR = 0.834，ns）（表2)．

4.讨论

丙型肝炎病毒（HCV）在不同的感染患者中具有可变的临床结果，从急性分辨肝炎到慢性肝脏疾病，包括肝硬化和肝细胞癌（HCC）[12.］．识别感染病毒的基因型对于探索HCV感染的许多方面，包括流行病学、发病机制和对抗病毒治疗的反应非常重要[13.那14.］．适合可靠的HCV基因分型方法是大规模流行病学和实验研究不可避免的[11.］．已经描述了旨在鉴定HCV基因型的许多实验室程序[15.］．HCV基因型在全长基因组序列分析中测定，然后是系统发育分析仍然是黄金标准。虽然该系统昂贵且耗时，但不能适应临床研究或广泛的标准使用[15.］．PCR已广泛用于基因分型[13.，基于临床样本中病毒序列的扩增，使用类型特异性引物特异性扩增不同基因型[11.那16.］．从世界各地获得的信息侧重于HCV基因分型日益增加的含义，并强调需要简便、可靠、成本有效和快速的大规模筛查技术。

准确、灵敏的HCV RNA测量对于感染患者的医疗管理以及在研究中了解HCV生物学和HCV感染非常重要[17.］．与开伯尔-普赫图赫瓦省的其他地区一样，马尔丹区对HCV感染的临床原因、危险因素、严重程度和HCV基因型的定义仍然很差。11.70%的研究人群中观察到抗HCV抗体，与Muhammad和Jan在Buner地区报告的4.57%相比，这表明HCV的患病率很高[18.］．

我们的数据显示，在Mardan地区，基因型3a(26.44%)其次是基因型3b (16.52%)， Idrees和Riazuddin的研究[19.]，其中3a和3b基因型在研究人群中占主导地位[19.］．Idrees和Riazuddin的另一项研究发现，HCV基因型3a在一般人群中占主导地位[19.］．关于HCV基因型在阿根廷等其他国家的发生率，基因型2更为普遍[20.］．同样，Alfonso等人(2001)在拉丁美洲地区61.4%的感染者中观察到基因1型，23.7%的感染者中观察到基因3型[21.］．在最近的综述中，我们报告说，基因型3a占旁遮普邦普夫夫的68.94％，SINDH的76.88％，KPK中的58％，俾路支省巴基斯坦省份为60.71％[22.］．

流行病学数据分析显示，单感染患者与类型特异性PCR显示的明显混合感染患者之间存在显著差异[13.］．在我们的研究中，4.13%的样本出现了混合感染(图)2)．混合基因型可能是由于反复接触HCV而感染不同类型的HCV [23.］．此外，17.35％通过嵌套的PCR用于HCV RNA证实的个体未被类型的PCR键入。这与我们之前的发现不一致，表明KPK中的20.16％的HCV阳性个体是可删除的[22.］．

HCV被称为沉默的杀手，因为大多数情况下，在感染的早期阶段和症状出现症状时，难以看到适当的迹象或症状。其次，由于缺乏设施，大多数发展中国家的诊断并不适当。通过条带或通过用于HCV感染的抗HCV筛选人们进行抗HCV，但这些方法更为错误并且缺乏敏感性[24.］．因此，基于PCR的HCV分子检测方法是不可避免的，因为它比血清学方法具有更高的敏感性和特异性。HCV感染是一种典型的疾病，在这种疾病中，直接检测病毒是正确诊断的必要条件。与其他现有的体外检测方法相比，RT-PCR具有额外的诊断前景，因为它提供了最终检测HCV [25.］．

本研究表明，狂欢团中HCV基因型3的分布类似于巴基斯坦的其他地区。在该区域中，HCV类型2和3在该区域中普遍存在，可以更好地响应干扰素治疗，但第1型和4型也是需要更长的治疗的循环。应在该地区启动适当的流行病学研究和治疗策略。还应考虑到适当的预防措施来控制这种可怕疾病的传播。

利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

致谢

作者们感谢阿卜杜勒威汗大学Mardan（Aukum），科特科科技大学（Kust），Peshawar大学，以及巴基斯坦的高等教育委员会（HEC）资助该项目。

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