南非临床和鸡样本中的新型陀螺病毒，包括鸡贫血病毒

摘要

介绍．直到最近，鸡贫血病毒(CAV)是唯一的成员Gyrovirus属。6种新型陀螺病毒，AGV2、HGyV1和GyV3-6，已经在人类和鸡样本中发现。方法．VP2基因PCR扩增用于检测包括粪便、呼吸道、脑脊液和hiv阳性血浆在内的一系列临床样本中的AGV2/HGyV1、GyV3和CAV。同时对当地新鲜鸡肉进行筛选。结果．健康儿童(17/49,34.7%)和腹泻患者(22/149,14.8%)的粪便中检出AGV2/HGyV1或GyV3。1.2%(3/246)鼻咽呼吸系统标本阳性。在哮喘患者的鼻拭子、脑膜炎患者的脑脊液和hiv阳性血浆中均未检测到AGV2/HGyV1或GyV3。51%(25/49)健康儿童的粪便中发现CAV, 16%(24/149)腹泻样本中发现CAV。28份鸡标本中，陀螺病毒(20/28,71%)的流行率高于CAV(1/28, 3.6%)。CAV VP1基因的系统发育分析显示，其南非序列与巴西D2和A2基因型分离株聚类。结论．包括CAV在内的新型陀螺病毒存在于南非腹泻和呼吸道疾病人群以及健康儿童中。它们的存在表明它们起源于鸡肉消费。

1.介绍

直到最近，鸡贫血病毒(CAV)是该属的唯一成员Gyrovirus属于圆环病毒科。这个属的特征是小的无包膜DNA病毒，具有负义单链环状DNA约2.3 kb [1]．相反，圆环病毒的基因组是双义的。陀螺病毒基因组结构与annelvirus相似，有3个重叠的开放阅读框(orf)，这使得陀螺病毒成为一个亚科，陀螺病毒亚科，在anelloviridae家族内[2]．

2011年初，Rijsewijk等人[3.]报道在巴西病鸡中发现了CAV的远亲，即禽旋病毒2 (AGV2)，与CAV的同源性仅为40%。同年晚些时候，Sauvage等人[4]鉴定出一种与人类皮肤上的陀螺病毒(HGyV1)关系非常密切。随后又描述了其他4种新型的陀螺病毒。病毒宏基因组学在智利患有急性肠胃炎儿童的粪便和鸡肉中发现了Gyrovirus 3 (GyV3) [5]．通过454焦磷酸测序，还在人类粪便样本和鸡肉中发现了一种系统发育上不同的陀螺病毒(GyV4) [6]．在突尼斯腹泻儿童的粪便中发现了另外两种不同的陀螺病毒，GyV5和GyV6 [7]．

CAV是家禽养殖业中一种经济上重要的病原体，可导致缺乏保护性母体抗体的2-3周龄雏鸡严重贫血和免疫抑制[8]．在成年鸡中，CAV感染是亚临床的，但由于不增重和对继发感染的易感性，家禽养殖户可能会蒙受经济损失。

许多研究人员已经探讨了CAV在非洲家禽环境中的作用[9- - - - - -16]．在尼日利亚、埃及、中非共和国和喀麦隆，根据鸡的年龄，血清流行率从37%到89%不等。此外，在大多数血清阳性鸡(77%)中可检测到CAV DNA，表明在存在抗体的情况下，病毒持续脱落。迄今为止，只有一份关于南非鸡体内CAV的简短报告[17，其中3只肉鸡血清阳性。

这项研究的目的是确定一些新的陀螺病毒和CAV是否存在于南非种群和该地区的鸡中。

2.材料和方法

2．1．临床样本

49名6-36个月的健康儿童的匿名粪便样本在获得crèche家长/监护人同意的情况下获得了两个时间段:夏季(2006年2月/ 3月)和冬季(2006年7月/ 8月)。我们亦对2006年同期送交病毒学及微生物诊断实验室的腹泻病人粪便样本进行化验(）.

246份来自1-60个月大的儿童的鼻咽呼吸道样本曾接受7种常见呼吸道病毒(腺病毒、人呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒、甲型及乙型流感、副流感病毒1-3及人鼻病毒A)的测试，其中152份呈阴性，其余样本()对上述一种病毒呈阳性反应。

鼻拭子()也筛查了2004年5月6-25个月患有急性喘息的儿童。已获得家长或监护人的知情同意。

hiv感染患者血浆中存在陀螺病毒()的评价为Maggi等[18]在一名意大利患者身上发现了HGyV1。CD4 /μL计数范围为13 ~ 1065，平均值为397。

对94例疑似脑膜炎患者的脑脊液样本进行筛查。

2．2．鸡肉

人类消费的新鲜鸡肉于2012年8月从南非开普敦的4个零售店购买。这些包括4个大腿和4个鼓槌，其中3个储藏室中的3个和4个大腿储存。

用无菌手术刀从每个样本中取出一小块皮肤和下面的肉。将其置于1.5 mL无菌Eppendorf试管中，在−20℃保存直至提取。

2．3.DNA提取

根据制造商说明(罗氏诊断公司，Penzberg，德国)，使用MagNA Pure LC自动提取法从鼻咽呼吸样本中提取总核酸。使用QIAamp DNA粪便迷你试剂盒和QIAamp DNA迷你试剂盒从粪便、鼻拭子、脑脊液、血浆和鸡肉样品中提取核酸，并按照制造商的说明采用适用于体液或组织的方案(Qiagen, Hilden，德国)。

２.４.陀螺病毒或CAV的PCR检测

如Phan等人所述，采用针对回旋病毒CAV、AGV2/HGyV1、GyV3和GyV6保守VP2区域的共识引物作为外引物[5]．选用CAV (CAV F1n 5’GGCAGTGAATCGGCGCTTAGCCG和CAV R1n 5’AGTCGCTTGAGGTGGTGCCACCG)或AGV2/HGyV1和GyV3 (ConGy F1n 5’GGCAGTGAATTGCCGCTTAGGC和ConGy R1n 5’CGCAGTCTGTGTCTCCAGTGC)的嵌套引物以提高灵敏度。PCR产物大小约550 bp。第一轮PCR条件为:95°C变性3分钟，95°C变性15秒，45°C变性25秒，72°C变性35秒，40个循环，最后72°C延伸7分钟。第二轮放大同上，退火温度提高至55℃。PCR产物通过2%琼脂糖凝胶电泳、溴化乙啶染色和紫外线照射可见。GyV4、GyV5、GyV6未被嵌套引物扩增，因此本研究未测量其患病率。

2．5．桑格测序

利用CAV和GyV嵌套式PCR引物，从两个方向直接测序VP2扩增子。使用BigDye终止周期测序试剂盒(Applied Biosystems, Foster City CA, USA)。利用ClustalW将VP2基因与GenBank中的参考序列进行比对[19]和使用MEGA 5.05构建的系统发育树[20.用1000次bootstrap重采样。还进行了BLAST分析。

通过使用Natesan等人之前描述的引物，对VP1的1349 bp和重叠VP2和VP3基因进行扩增，以提高CAV阳性样本的系统发育分辨率[21和Eltahir等人[22]．通过设计嵌套式VP1正向引物(5'CCGCAAGAAGTATAAGAC)，提高了敏感性。

3.结果

3．1.临床样本中的陀螺病毒

健康儿童(17/49,34.7%)和腹泻患者(22/149,14.8%)的粪便中均检测到AGV2/HGyV1或GyV3(表)1）.呼吸道病毒的检出率较低，普通呼吸道病毒阴性的为1.3%(2/152)，阳性的为1.1% (1/94)1）.在后一个样本中，副流感1-3以前使用Seeplex RV7检测(Seegene，首尔，韩国)。在急性喘息患儿的鼻腔拭子、hiv感染者的血浆和疑似脑膜炎患者的脑脊液中均未检测到AGV2/HGyV1或GyV3。

3．2．粪便样本CAV

51%(25/49)健康儿童粪便样本中检出CAV, 16.1%(24/149)腹泻样本中检出CAV(表)1）.鼻咽部样本、鼻拭子、hiv阳性血浆和脑脊液未筛查CAV的存在。

健康儿童和腹泻患者的粪便中分别有10/49(20.4%)和8/149(5.4%)双感染CAV和AGV2/HGyV1/GyV3。CAV与AGV2/HGyV1/GyV3共检测无统计学关联(）.

3．3.鸡肉中的CAV/Gyrovirus

对28份鸡样本进行CAV DNA或AGV2/HGyV1/GyV3 DNA检测，结果显示，与CAV(1/28, 3.6%)相比，gyrovirus(20/28, 71.4%)的流行率明显更高。从一家店得到的C、7/8份样品中，陀螺病毒和CAV均为阴性，而从其他3家店获得的鸡肉中，AGV2/HGyV1呈阳性，只有一份样品同时感染了CAV(见表)1）.

3．4．系统发育和氨基酸分析

对测序成功的样本VP2区域进行系统发育分析，发现仅存在AGV2/HGyV1序列，其中56.3%(18/32)的样本与AGV2序列有关，43.5%(14/32)的样本与HGyV1序列有关(图)1(一)）.未检测到GyV3。3例呼吸样本均为AGV2序列聚类。在测序成功的鸡样本中，6/9的样本与HGyV1序列同源，其余3个样本与AGV2序列同源。

CAV的VP1区域为分离株的不同基因型分类提供了系统发育信息(图)1 (b)）.1349 bp区域分析显示，6/7株cav阳性菌株属于D型，特别是来自美国、日本、马来西亚和澳大利亚的D2菌株。其余样本聚集在基因型A内，但形成了一个独立的高bootstrap值的谱系(数据未显示)。对截断的VP1区域(481 bp)进行系统发育分析，允许包含来自巴西的VP1序列(AY855079-88)，保留了使用更大的VP1区域确定的系统发育，但现在显示，所有南非分离株与基因型a或D的巴西序列聚在一起(图)1 (b)）.

分析推导出410个氨基酸的蛋白VP1 CAV显示没有南非的特征氨基酸分离,尽管脯氨酸(P)在286位置被发现在所有序列和与2隔离来自日本和来自澳大利亚和马来西亚各1人。毒性区域负责毒性的区域[23在394位点显示谷氨酰胺(Q)而不是组氨酸，表明这是一种高毒性菌株(数据未显示)。

4.讨论

最近在人群中发现了新的陀螺病毒，这导致了对来自南非的病人和健康儿童的一系列临床样本的筛查。本研究证实该区域存在AGV2/HGyV1和CAV。未检测到GyV3，本研究未检测GyV4、GyV5和GyV6。由于目前对健康人和病人陀螺仪病毒的研究有限，其发病机制和临床重要性尚不清楚。HGyV1可能是皮肤病毒群的成员[4，尽管Chu等人[6]无法在健康个体的皮肤拭子中检测到陀螺病毒。在患病率为1-9.3%的腹泻病人的粪便中检出新型陀螺病毒，而在健康人士的粪便中未检出陀螺病毒[5，6]．目前的研究表明，腹泻患者粪便中陀螺病毒(AGV2/HGyV1)的患病率更高(15%)，而35%的健康儿童也有AGV2/HGyV1 DNA的证据。Chu等人[6研究表明，陀螺病毒在年龄小于20岁的患者中更常见。

在粪便样本中发现的病毒也可能在呼吸道和全身性疾病中发挥作用。通过筛查因呼吸系统疾病住院的年轻患者和因急性喘息在门诊就诊的儿童的呼吸道样本进行调查。在3例住院患者中检测到AGV2，其中1例患者同时感染副流感病毒1-3。还需要进一步的研究来确定陀螺病毒是否会引起需要住院治疗的呼吸道感染。

在艾滋病毒感染者的血液中未检测到陀螺病毒，尽管其他研究报告了在血液健康的献血者中患病率较低[24]及免疫功能受损的爱滋病病毒抗体阳性及肾脏移植病人[18]．我们的结果可能反映了筛选出的样本数量较少。

圆环病毒能够穿过血脑屏障，引起中枢神经系统感染。猪圆环病毒2型感染仔猪导致小脑血管炎[25]，而在人类中，亚急性痴呆、不明原因截瘫和病因不明的急性中枢神经系统感染患者的脑脊液中发现TTV和新型循环病毒[26- - - - - -28]．对可能脑膜炎患者脑脊液样本的筛查显示没有陀螺病毒感染的证据。

在健康儿童(>50%)的粪便中检测到CAV的频率高于腹泻儿童(16%)。Phan等人先前的研究[5和Chu等人[6]也报告了健康捐赠者粪便样本中CAV的高患病率，分别为25%和53%。这种高检出率表明，食用受感染鸡肉可能起到一定作用。然而，在本报告中，从研究区域的许多不同商店购买的新鲜鸡肉的筛选不支持这一假设，因为只发现了一个CAV阳性样本。相比之下，鸡肉中AGV2/HGyV1阳性比例显著。这种差异可能是因为只筛查了2012年购买的新鲜鸡肉，而临床样本是在2004-2006年进口冷冻鸡肉产品更容易消费的时候采集的。

目前有许多CAV减毒活疫苗可供家禽养殖业使用。然而，这种做法在南非家禽行业发生的证据并不容易获得。如果这样做，种鸡将接种疫苗以获得高水平的循环抗体，这些抗体可以传递给后代，防止CAV引起的早期感染和疾病(南非家禽协会，Nkuna博士个人交流)。

自2001年起，大量带骨冷冻鸡从巴西进口，2010年巴西占南非鸡进口市场的70%以上[29]．自2012年引入更严格的反倾销立法以来，这一比例大幅下降。这些进口产品比当地采购的鸡便宜得多，可能是南非很大一部分人口优先购买和消费的产品。Simionatto等[30.]报告说，从巴西不同地区的商业种鸡、肉鸡和散养鸡采集的野外样本中，90%的样本检测出CAV。这些鸡是自然感染CAV还是通过疫苗接种程序感染CAV尚不清楚。

VP1区系统发育分析进一步证明本研究检测到的CAV可能起源于巴西。所有南非分离株，无论是D型还是A型，都与巴西分离株聚集在一起。2013年，无法从较早采集的人类样本中寻找进口鸡肉产品，以确认这一关联。

5.结论

陀螺病毒在人类疾病中的作用和临床相关性需要进一步的研究。需要对各种医疗条件的患者进行更大规模的研究，以阐明陀螺病毒感染的发病机制。

利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

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