的抗病毒效果高分子重量Poly-Gamma-Glutamate对新城鸡瘟病毒小鼠巨噬细胞的细胞

文摘

此研究表明,嗯——的能力γpga治疗显著保护小鼠巨噬细胞细胞(264.7原始细胞)对NDV感染。这种保护可以解释为抗病毒HM -状态的感应γpga在原始264.7细胞通过TLR4-mediated IRF-3, IRF-7,干扰素-β所示,IFN-related基因诱导时间的变化mRNA表达经聚合酶链反应(PCR)。此外,目前的研究还表明,嗯γpga可以诱导促炎细胞因子分泌在原始264.7以酶联免疫吸附试验(ELISA)。因此,我们的研究结果表明,HM -γpga可能是一个潜在的抗病毒物质,通过刺激可以抑制NDV感染抗病毒国家264.7原始细胞。这些结果与之前的研究一致表明,HM -γpga 264.7可以保护原始细胞和小鼠抗流感感染。然而,应该注意的是,尽管小鼠巨噬细胞细胞容易NDV,他们不是病毒的自然宿主细胞;从而进一步涉及鸡肉和鸡的体内和体外研究免疫细胞需要充分评估HM -的有效性和适用性γpga家禽业。

1。介绍

鸡新城疫病毒(NDV)属于副粘病毒科属Avulavirus(1,2),目前为禽副粘病毒病毒血清型1 (APMV-1) [3]。根据国际des既往办公室(OIE) 2009年,NDV菌株可以分为五个致病型根据临床症状影响鸡所示,即嗜内脏型velogenic(高死亡率和肠出血性病变),亲神经的velogenic(高死亡率、呼吸和神经迹象),大分子(低死亡率,呼吸道症状,偶尔神经迹象),lentogenic(亚临床或轻度感染)和无症状的肠(亚临床感染肠)的4]。

鸡新城疫仍然流行在世界范围内,尽管许多生活和灭活NDV疫苗来控制疾病(5,6]。然而,目前商业疫苗有其局限性,其中之一是缺乏遗传标记对血清学区分自然接种疫苗和受感染的鸟类。也有报道表明的NDV菌株类型已确定在家禽传播已经显示主要的抗原漂移。因此,需要更好的NDV疫苗可以解决这样的问题,在病毒载体疫苗被证明是一个不错的选择7),以第一个特许商业重组疫苗、重组新城鸡瘟病毒疫苗,使用鸡痘病毒作为载体来表达的免疫原性蛋白NDV [8]。然而,重组疫苗并不是广泛使用的家禽行业由于其不能用于以人群为基础的大规模应用程序和高成本(5]。

此外,目前不能提供足够的疫苗免疫甚至在家禽中使用多个疫苗和疫苗并不能完全预防感染或活病毒脱落(7- - - - - -9];因此天然物质能够抑制或阻止NDV感染可能会提供所需的额外的预防疾病。的一个天然物质广泛研究了它的各种生物功能和应用程序是高分子量聚-γ谷氨酸(HM -γpga) (> 3000 kDa),自然的,可食用,可降解聚合物来自枯草芽孢杆菌无性系种群。chungkookjang(10- - - - - -12]。最近,HM的抗病毒功能γpga与流感病毒通过刺激I型干扰素(IFN)和mx₁蛋白质在体外和在活的有机体内证明(13]。此外,一些研究已经表明,HM -γpga功能比低分子量聚-γ谷氨酸(LM -γpga) (10 - 1000 kDa)在抗肿瘤活性和免疫刺激和当作为佐剂(14,15]。

在这项研究中,HM的抗病毒效果γpga对NDV是评估小鼠巨噬细胞细胞系(原始264.7)。根据研究结果,本研究表明,HM -γpga保护小鼠巨噬细胞细胞NDV I型干扰素诱导感染。

2。方法

2.1。准备HM -γpga

Endotoxin-free保利-γ谷氨酸(γpga)产生枯草芽孢杆菌无性系种群。chungkookjang准备并提供BioLeaders公司(韩国大田市)0.85%无菌生理盐水溶液。简单地说,文化的肉汤枯草芽孢杆菌无性系种群。chungkookjang收集和混合3倍体积的乙醇。沉淀是冻干重组在10毫米Tris-HCl缓冲区(pH值7.5),对蛋白酶K,并在蒸馏水透析。接下来,γpga由阴离子交换色谱法纯化,透析使用Sep-Pak +水Accell + QMA筒与蒸馏水(美国微孔)平衡。接下来,墨盒列控γpga与氯化钠逐步开发解决方案从0.1到1.0米。通过评估的谷氨酸浓度水解γpga使用氨基酸分析仪,的内容γpga由下列公式计算:内容γpga(%) =(大量的谷氨酸/样本)×(一个/B)×100。一个= 129(分子的质量γ谷酰基残留在γpga);B= 147(谷氨酸分子质量)。数量和衡量分子质量(Mn和Mw、职责)以及多分散性(Mw/ Mn)γpga分子通过凝胶渗透色谱法测定使用GMPWXL列(美国Viscotek)和LR125激光折射仪(美国Viscotek)。美国美国聚合物聚丙烯酰胺标准(标准)被用来构造一个校准曲线和多分散性高分子重量γpga测量。高分子质量的内容γpga增加> 99%,多分散性降低阴离子交换色谱法。彻底得到可溶性γPGA, pH值调整到7.0通过添加5 n氢氧化钠(氢氧化钠)解决酸的PGA形式。只有净化HM -γpga在这项研究中使用(16]。

2.2。细胞培养和病毒

264.7原始细胞(写明ATCC矿- 71)在杜尔贝科的修改维护鹰最低基本培养基(DMEM)(美国表达载体)含10%胎牛血清(的边后卫)(美国Gibco)和1%的抗生素/抗真菌的(美国Gibco) 37°C公司为5%₂直到使用。

NDV-green荧光蛋白(NDV-GFP)请提供了荣格的南加州大学博士。病毒被放大在9 - 10天大的受孕的鸡蛋。收集尿囊液离心器在20000 g×2.5小时8°C在20%蔗糖病毒浓度的解决方案。病毒颗粒在PBS和500 ul整除resuspended保持在−70°C到使用。

2.3。抗病毒试验

HM -评价抗病毒效果γpga抗NDV感染,病毒复制的抑制作用。短暂,生264.7细胞培养与一个合适的数量(8×10⁵细胞/)到12-well组织培养(TC)板(Nunc、丹麦)12小时。然后,介质代替了DMEM (w / o治疗和介质处理细胞)和1毫克/毫升HM - DMEMγpga。鼠标重组干扰素- DMEM和1000台β(美国σ)作为阳性对照。12小时孵化后,细胞被感染1感染复数(MOI) NDV-GFP病毒。观察GFP的表达在200 x放大在感染后12小时(hpi) [13]。

细胞通过台盼蓝排斥试验可行性进行了描述。短暂,生264.7细胞治疗1毫克/毫升的HM -γpga,重组干扰素——老鼠β,或者只DMEM(数控和介质处理细胞)为12小时。孵化后,细胞被感染NDV-GFP病毒和细胞生存能力是由现病史在30台盼蓝排斥试验。阐明细胞每组混合0.4%台盼蓝染色(美国表达载体)1:1的比例。染色后,10μL的混合物是应用于血细胞计数器,在可行的细胞的百分比,可行的总数/活细胞每毫升的整除除以总数量的细胞/毫升的整除乘以100。细胞计数是三次完成的。

最后,制造商的指示后,GFP表达水平中等,1毫克/毫升HM -γpga和干扰素-β细胞治疗前12 h NDV-GFP感染测量24 hpi使用Glomax multidetection系统(美国Promega)。简单地说,从每个治疗组细胞分别如上所述收集和离心机在1200转3分钟。结果细胞颗粒在PBS稀释和转移到96 -黑色板GFP检测。测试是一式三份(17]。

2.4。NDV-GFP mRNA表达原始264.7细胞

264.7总信使rna从原始细胞提取并放大为了估计NDV-GFP mRNA表达(18]。简单地说,细胞(8×10⁵/)是培养12-well TC板块(Nunc、丹麦)12小时。然后,媒介是取代DMEM (w / o治疗和介质处理细胞)和1毫克/毫升HM - DMEMγpga。12小时孵化后,细胞被感染1莫伊NDV-GFP病毒。细胞被收集在0、6、12、24小时后感染。264.7总信使rna提取原始细胞使用RNeasy迷你包(美国试剂盒)。逆转录的信使rna进行了使用M-MLV逆转录酶(Enzynomics、韩国),低聚糖(dT) 16-primers和核苷酸(0.5μ米)。M-MLV逆转录酶在72°C 5分钟孵化,37°C为60分钟和晚期灭活通过加热15分钟的72°C。使用特定引物聚合酶链反应(PCR)矩阵基因APMV-1 [19)和小鼠3 -磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)看家基因(内部控制)20.使用翡翠PCR)进行了主混合(美国豆类)每个引物组(表1点1)。互补脱氧核糖核酸是放大30周期优化为每个引物退火温度组。最终在72°C扩展进行了5分钟。等量的PCR产品运行在1.5%溴化乙锭浸渍琼脂糖凝胶并使用GelDoc可视化成像系统(美国Bio-Rad)。另一方面,相对带强度(RBI)的矩阵和GAPDH基因mRNA表达决心使用GelDoc成像系统带量化软件(美国Bio-Rad)。

2.5。刺激一种抗病毒HM -状态γpga治疗

确认upregulation抗病相关基因的信使rna表达水平在264.7原始细胞,月球的方法等。13)是用于一些修改。短暂,生264.7细胞被播种到每一个的6-well TC板(Nunc、丹麦)和培养12小时。此外,细胞治疗1毫克/毫升的HM -γpga与1%的边后卫,DMEM 100 ng / mL有限合伙人在DMEM积极控制、DMEM和1%的边后卫只负控制。治疗细胞收获在0、3、6、12、24小时后处理。之后,准备使用相同的执行总RNA和rt - pcr的方法上面。列出了具体的引物PCR表2(13,20.,21]。

2.6。检测促炎细胞因子诱导的HM -γpga在原始264.7细胞ELISA

嗯——的促炎细胞因子诱导效应γpga在原始264.7细胞是使用商业ELISA试剂盒检测小鼠白细胞介素- 6 (il - 6)、interleukin-12 (il - 12)、肿瘤坏死因子-α(TNF -α)(美国BD生物科学)和小鼠干扰素-β(IFN -β)(PBL干扰素来源,美国)13,22,23]。简单地说,一个合适的数字(2×10⁶/ 264.7)的原始细胞被播种的每个好6-well TC板(Nunc、丹麦)和讲究的。十二小时后,细胞培养基被除去,单层与PBS洗一次。然后细胞治疗100 ng / mL的脂多糖(LPS)来自大肠杆菌0111:B4(美国Sigma-Aldrich)或1毫克/毫升的HM -γpga与1%的边后卫DMEM和孵化37°C公司为5%₂。细胞治疗DMEM 1%的边后卫只担任负控制。上层清液从每个治疗组在0,收获6、12、24和36小时后处理和澄清在2500×g离心10分钟4°C。澄清上层清液被分发到小鼠干扰素-βELISA板的测量分泌鼠干扰素-β,而10倍稀释浮层被分发到鼠标TNF -α涂、il - 6和il - 12捕获抗体ELISA板。测试进行了一式三份。

2.7。统计分析

学生的团体之间的差异进行了分析以及。值小于0.05被认为是重要的和小于0.01被认为是非常重要的。

3所示。结果

3.1。抑制病毒复制的HM -γ264.7 pga在原始细胞

先前的研究显示,HM -γpga有益功能免疫反应(12,14,16]。最近的研究也证实了的角色γpga在诱导细胞因子参与了细胞的抗病毒状态,从而抑制病毒复制的13]。

在这项研究中,HM -γpga 264.7原始细胞表现出显著地降低病毒复制而治疗中治疗细胞展示高水平的GFP表达(数字1(一)和1 (c))。嗯- - - - - -γpga治疗细胞表现出显著减少双重的GFP表达的媒介相比,细胞治疗。

同样,在病毒感染后,HM -γpga治疗细胞显示不到10%细胞死亡而介质处理细胞显示超过50%的细胞死亡30(图的快乐指数1 (d))。此外,失败的NDV-GFP病毒芽264.7成功地从原始细胞,我们选择测量矩阵的mRNA表达基因的病毒通过rt - pcr估计病毒复制(图1 (b))。正如所料,HM - M基因表达γpga治疗细胞相对低于中等细胞治疗感染后6到24小时。中细胞治疗还显示连续M基因的表达在感染后24小时而HM -γpga治疗细胞表明nonincreasing模式开始后12小时。

3.2。抗病毒基因和促炎细胞因子的诱导HM -γpga在原始264.7细胞

确定的机制HM -γ264.7 pga诱发抗病毒在原始细胞,抗病毒药物相关基因表达和分泌的促炎细胞因子HM -后小鼠巨噬细胞细胞被证实γpga刺激。264.7原始细胞治疗1毫克/毫升的HM -γpga并与100 ng / mL的LPS处理细胞。

嗯- - - - - -γpga治疗264.7原始细胞显示增加mRNA的表达干扰素调控转录因子3 (IRF-3)和7 (IRF-7)和IFN-stimulated基因如myxovirus抵抗蛋白1 (mx₁)和干扰素诱导guanylate-binding蛋白1(1)英镑几乎比得上LPS引起的水平开始3小时后处理(图2)。然而,干扰素,β以及干扰素刺激gene-15 (isg - 15) mRNA表达水平没有高达LPS处理细胞相比,虽然仍明显高于与消极的控制。自从mRNA的表达并不一定与分泌蛋白水平,促炎细胞因子分泌后还测量了HM -γ通过小鼠细胞因子ELISA试剂盒(图pga刺激3)。目前的研究表明,HM -γpga生264.7中可以诱导细胞因子分泌细胞可比与LPS处理细胞。

4所示。讨论

NDV的能力导致高度传染性感染导致高死亡率和减少农场效率仍是威胁全球家禽业。目前家禽疫苗不能提供足够的免疫力,即使使用多个疫苗(9];因此有抗病毒活性的天然物质的重要性。的天然物质广泛研究了它的各种生物功能和应用程序是HM -γpga、自然、食用,可降解聚合物来自枯草芽孢杆菌无性系种群。chungkookjang(10- - - - - -12]。嗯- - - - - -γpga的分泌γpga合成酶ABC复杂的墙上枯草芽孢杆菌无性系种群。chungkookjang(11]。这自然分泌HM -γpga是安全可食用的聚合物包含微不足道的毒素不干扰其有利影响/应用,如满意的辅助功能,抗肿瘤效应,先天免疫诱导作用[14,16]。在其生物功能,启动免疫反应的能力在老鼠通过TLR4信号就像有限合伙人让HM -γpga强有力的免疫调制剂与巨大的潜力为治疗的代理(12]。短暂,通常被认为是一个主要组件的模式识别系统检测入侵的病原体识别病原体相关分子模式(pamp)。的研究通常是TLR4。哺乳动物(老鼠)TLR4信号通路首先LPS-binding蛋白的转移(LBP)检测到的有限合伙人的集群分化14 (CD14)炎症细胞的表面。这个反应最终导致有限合伙人的转移地通过骨髓differentiation-2 (MD-2) [24]。成功激活TLR4启动细胞内激活的骨髓分化主要反应蛋白- 88 (MyD88)依赖和MyD88-independent通路。MyD88-dependent途径利用MyD88 Toll-interleukin 1受体(行动)domain-containing适配器蛋白质核factor-K (TIRAP)成功地出口β(NF-Kβ)核启动促炎细胞因子基因的转录,而MyD88-independent途径利用人数/ interleukin-1 receptor-domain-containing adapter-inducing干扰素-β(TRIF)和TRIF-related适配器分子(电)有效地激活转录因子IRF-3以及后续生产IFN -β(25]。虽然促炎细胞因子如TNF -α、il - 6和il - 12是重要的对于一个成功的炎症反应,诱导的I型干扰素抗病毒药物耐药性更被认为是不可或缺的。尽管如此,TLR4 TLR家族中被认为是独特的LPS识别结果在激活MyD88-dependent和有轨电车/ TRIF-dependent信号通路(26]。

在这项研究中,HM -γpga已经测试通过一些实验来评估其应用控制新城鸡瘟病毒复制小鼠巨噬细胞细胞(原始264.7)。自从HM -的刺激效应γpga一直建立在老鼠和小鼠巨噬细胞细胞(11- - - - - -13,16)和先前的研究已经阐明NDV之间的交互和小鼠巨噬细胞21,27),我们决定使用小鼠巨噬细胞对HM -的抗病毒效果进行评估γ对NDV pga。

在预处理抗病毒试验,HM -γpga治疗能够减少对NDV-GFP感染病毒复制原始低264.7细胞所示NDV M基因和GFP表达和更高的感染后细胞存活能力(图1)。然而,病毒coincubation HM -γpga和HM - postinfection治疗γpga不减少病毒的gfp表达(见补充图1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2014/301386)。

基于这些发现,HM -γpga被假设是参与细胞的抗病毒状态通过诱导的I型干扰素。先前的研究表明,抗病毒效应分子的表达蛋白激酶R (PKR), 2′5′-ologoadenylate合成酶(OAS)和Mx, 1型干扰素诱导的,与对NDV感染主要巨噬细胞和macrophage-derived肿瘤细胞(如原始细胞)这些分子抑制RNA翻译过程中关键步骤和/或装配的病毒颗粒在病毒复制21]。此外,isg - 15蛋白质,ubiquitin-like修饰符,I型干扰素刺激后大大表示已被证明调解保护在许多不同的病毒感染模型(28]。

同样,同样的纸也表明,原始细胞干扰素分泌延迟后NDV感染从而使他们容易表示病毒(21]。然而,随着鸡细胞相比,哺乳动物细胞有天生的阻力与V NDV的蛋白质可以阻止干扰素的生产(29日]。另一方面,月球等人表明,HM -γpga可以诱发大量的干扰素-β264.7原始细胞与LPS诱导干扰素-可比β以小鼠细胞因子分泌ELISA (13]。有鉴于此,研究人员推测,I型干扰素的早期诱导抗NDV感染264.7也可以保护原始细胞。在目前的研究中,HM -γpga治疗264.7原始细胞显示转录因子IRF-3 mRNA表达的增加,IRF-7, IFN-stimulated基因如mx₁和1英镑几乎比得上LPS引起的水平开始3小时后处理。然而,IFN-B以及isg - 15 mRNA表达水平没有高达LPS处理细胞相比,虽然仍明显高于与消极的控制。这种观察是按照群野人的结果在2009年,强大的抗病毒基因的表达IRF-3, IRF-7和干扰素-β和视黄acid-inducible基因1 (rig - i)可以提供保护对NDV感染(21]。尽管RIG-1不是测量在这项研究中,强烈的表达IRF-3和IRF-7可以强烈建议抗病毒状态已经取得了HM -γ264.7 pga对待原始细胞由于这些转录因子是不可或缺的I型干扰素诱导的(30.]。

然而,由于mRNA的表达并不一定与分泌蛋白水平,促炎细胞因子分泌也测量。使用商业ELISA试剂盒检测小鼠细胞因子il - 6、il - 12, TNF -α和干扰素-β,目前的研究表明,HM -γpga生264.7中可以诱导细胞因子分泌细胞可比与LPS处理细胞。然而,过度刺激的先天免疫可能导致过度的细胞因子释放,可以损害细胞。本研究也不例外,在治疗后细胞激素风暴的可能性的那些代理,HM -γNDV的pga,感染病毒已知影响细胞因子的异常反应。基于有限的研究结果,NDV前预处理小鼠巨噬细胞的细胞只感染导致细胞死亡不到10%与50%以上的介质处理细胞。假设细胞因子释放的确发生在细胞过度使用HM -γpga,结果仍然表明upregulation细胞因子的研究没有影响治疗细胞相比中等细胞治疗。因此我们可以观察到预处理HM -γpga NDV感染之前在适当的时候提供保护,而不是死亡的敏感细胞。

此外,由于我们没有测试的蛋白质表达水平的干扰素抗病毒蛋白刺激Mx,美洲国家组织,PKR、和研究小组15,我们只能推测,这些蛋白质充分表达,成功地抑制病毒复制;因此病原体识别受体(PRRs)没有最大限度地刺激,防止可能的细胞激素风暴。因此,我们的研究结果表明,HM -γpga,如果在适当的时候NDV-GFP感染之前,可以是一个重要的抗病毒物质,通过刺激可以抑制NDV感染抗病毒国家264.7原始细胞。

虽然实验被NDV在细胞一般不会感染,目前的研究的有前景的结果作为理由进行测试的适用性HM -γpga在鸡的免疫细胞。尽管如此,我们的实验室已经开始评估的anti-NDV活动HM -γpga在鸡肉和鸡的免疫细胞,全面评估的适用性HM -γpga家禽业。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者要感谢BioLeaders公司提供HM -γpga。这项研究是由忠南国立大学的研究基金。

补充材料

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