TLR2的可能作用在慢性乙型肝炎患者Precore突变

文摘

识别的先天免疫反应机制有助于改善免疫治疗策略HBeAg-negative慢性乙型肝炎(慢乙肝)。toll样受体2 (TLR2)是先天免疫的重要组成部分。在这项研究中,precore突变的频率的乙型肝炎病毒(HBV)和血清TLR2慢性乙肝患者进行评估。51慢性乙型肝炎患者,- e抗原和检测HBV DNA,检查是否存在突变的核前地区乙肝病毒基因组通过直接测序。血清TLR2通过酶联免疫吸附试验测定。截断e抗原和TLR2蛋白质的相互作用与分子对接软件进行评估。G1896A核前突变被发现在29(57%)显著相关的血清浓度较高的TLR2相比,病人没有这个突变(4.82.9与3.42.2 ng / mL,)。也有血清ALT和TLR-2之间显著相关(;)。对接结果说明残留在截断e抗原分子的n端和TLR2,这可能会促进这些蛋白质之间的相互作用。这些发现显示的主导地位G1896A核前乙肝病毒变异的突变与血清TLR2这个社区。此外TLR2对炎性细胞因子诱导至关重要,因此ALT升高。

1。介绍

乙型肝炎病毒(HBV)感染是一个重要的原因的慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌(HCC) (1]。乙肝病毒的传播从受感染的母亲对新生儿造成持续感染2]。慢性乙型肝炎病毒感染是一个全球性的健康问题。然而,患病率和乙型肝炎病毒基因型的分布是不同的地理区域(3]。大多数的慢性乙型肝炎患者失去HBe抗原(e抗原)和开发anti-HBe抗体,这通常与降低血清HBV DNA水平,逐步积累precore或核心启动子突变(4]。HBeAg-negative慢性乙型肝炎的主要类型是慢性乙肝在地中海的居民3]。两种类型的precore和核心启动子乙肝病毒突变,减少e抗原形成更加频繁的地区,患者主要是感染乙型肝炎病毒基因型D [4,5]。感染乙肝病毒的野生型菌株常常引发轻微的症状和干扰素α治疗反应良好,但是病人感染precore突变体变异可能显示或波动ALT升高的临床证据和乙肝病毒DNA (6]。precore负突变体之所以成为主要在一些患者慢性乙型肝炎感染并不清楚。然而,宿主的免疫系统功能作用的选择precore乙肝病毒突变株,和他们的外表可能反映免疫控制的感染(7,8]。

被感染的肝细胞被有力的CD4 +和CD8 + t细胞的反应,和那些有足够的细胞免疫反应将持续慢性感染(9]。先天免疫的影响在肝损伤也已被确定在几项研究[10,11]。toll样受体通常描述一群模式识别受体(PRRs)扮演重要角色在宿主先天免疫反应(12]。这些蛋白的进化果蝇对人类和适应性免疫反应的重要控制激活(13]。各种表达式(通常表现出不同的模式14]。Overactivation通常扮演一个重要角色的各种急性和慢性炎症的发病机制条件(13]。一项研究报告说,主人的e抗原会使抗病毒防御(15),在缺乏e抗原,乙肝病毒的复制与upregulation TLR2通路,导致TNF -增加生产(16- - - - - -19]。广泛的微生物和病毒成分以及一些内源性TLR配体被TLR2 [14]。这在外周血白细胞受体表达,主要在单核细胞在淋巴结、骨髓和脾(20.]。TLR2也正常发布的单核细胞,存在于血清和其他生物体液主要包含TLR2细胞外域(20.,21]。

多样化的重要性通常为“在活的有机体内“乙肝病毒的复制和发病机制已经证明在几个报告(16,17]。然而,没有报告e抗原阴性的血清TLR2慢性肝炎B。在这项研究中,血清协会TLR2在慢性乙型肝炎患者临床表现患者尤其是G1896A终止密码子突变已被调查。

2。患者和方法

2.1。病人

共有51慢性e抗原阴性的患者可检测HBV DNA和一系列正常的ALT升高是12个月的评估期间。他们位围产期获得慢性感染有明显的家族性乙型肝炎病毒感染史,没有合并感染人类免疫缺陷病毒(HIV),自身免疫性肝炎和其他肝炎病毒。采集的血液样本在初步评估肝脏活检。血清样本存储在−70°C。之前没有病人接受anti-HBV治疗肝脏活检。的协议医院伦理委员会批准沙里亚梯是研究之一,德黑兰大学医学科学。

2.2。临床评估和病毒dna定量

HBsAg, e抗原、anti-HBeAg anti-HCV, anti-HDV,和抗艾滋病病毒测定与商业分析工具环评,迪亚。箴诊断,意大利。血清TLR2是衡量toll样Receptor2酶联免疫试剂盒(Uscn生命科学、武汉、中国)根据制造商的规格。TLR2 ELISA的敏感性为0.312 -20 ng / mL。

从200年乙型肝炎病毒DNA提取μL使用QIAamp血清DNA的血液迷你包(美国试剂盒),筛选了50μL(洗脱缓冲,然后测量Light-Cycler(罗氏)RealARTTM HBV LC PCR(试剂盒、希尔登,德国)根据制造商的指示。这10测定的线性范围²-10年⁹拷贝/毫升。从所有患者肝活检评估等级的组织活动和纤维化阶段使用修改后的组织学活动指数(HAI)评分系统(22]。

2.3。Precore G1896A突变检测和直接测序

分析了precore地区hemi-nested PCR根据Gan et al。23]。感觉底漆PC5 5′tcg猫GGA广汽CAC CGT GA-3′(nt。204 - 223年)和反义底漆PC2 5′ggc AAA AAC GAG AGT AAC TC-3′(nt。540 - 559年)进行了第一轮引物。额外hemi-nested一轮放大是通过使用2μL(第一轮产品527模板和反义引物5′侠盗猎车手行动CCA CAG摇CTC颈- 3′(nt。528 - 546年)。底漆核苷酸的编号组织是根据基因组序列HPBADR1CG [23]。PCR产物纯化使用PCR从莫生物实验室净化设备有限公司(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)根据制造商的说明和筛选了100年μL(洗脱缓冲。PCR产品的排序是通过大染料终结者循环测序反应准备工具包3.1版(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)。

2.4。统计分析

正常的数据使用一个示例Kolmogorov-Smirnov测试评估。变量之间的相关性进行了分析使用皮尔逊相关系数()。独立样本以及用于比较意味着±标准差(SD)的数据。的Mann-Whitney测试是用来测试患者平等之间的TLR2和ALT G1896A precore突变和病人没有突变。一个值< 0.05被认为是显著的。

2.5。e抗原和TLR2交互分析

为了确定e抗原的功能密切相关,蛋白质相互作用e抗原之间的映射和TLR2的解决方案。截断e抗原氨基酸的序列,因此终止密码子的位置创建28 e抗原和基因突变的基地1898乙肝病毒,是提取UniProt (P0C6H9)。截断e抗原的三级结构是由Pepstr [24]。Pepstr服务器预测三级结构的多肽序列长度不同的7到25(残留物http://www.imtech.res.in/raghava/pepstr/)。TLR2的x射线晶体结构(2 z80a)从PDB(蛋白质数据库)检索25]。的PatchDockweb服务器和细化FireDock评估两种蛋白质的分子对接(26,27]。

3所示。结果

3.1。人口统计学和临床特点的病人

人口特征和频率的G1896A precore突变以及研究对象的临床和生化资料表进行了总结1。有51名患者(平均年龄16年),包括女性和男性35。乙型肝炎病毒DNA的量化在日志拷贝/毫升的平均值和29例(57%)患者显示G1896A precore突变。坏死炎性组织年级的总分和纤维化阶段测量基础上修改后的海系统和血清ALT和分别IU /我。血清TLR2的平均浓度ng / mL。

3.2。临床意义的G1896A Precore突变和血清TLR2

血清的浓度TLR2在G1896A更高precore突变体比野生型感染患者(与ng / mL,)(表1)。没有明显关系G1896A突变变异没有年龄和性别。病人感染了病毒载量的野生型HBV透露类似的均值相比G1896A precore突变患者(与日志拷贝/毫升)。更有可能的是,患者存在precore突变株有更高水平的血清ALT和HIA得分相比,患者感染乙肝病毒的野生型菌株,然而这不是统计学意义(与国际单位/我和与)(表1)。血清TLR2和ALT显著相关(;)在G1896A突变患者更明显(;)(图1)。此外,日志HBV DNA之间有显著关联与血清ALT和HIA评分(;和;)。血清ALT和乙肝病毒DNA与年龄的关系不显著,性别和总成绩的组织活动和纤维化阶段。

3.3。TLR2和截断e抗原交互

在这个实验中,e抗原的蛋白质对接和TLR2 PatchDock生物信息学研究了对接工具。然后,高通量细化FireDock对接被选中的(图2)。蛋白质对接和互动模拟披露氢和离子键。氨基酸残基Cys14、Pro15 Thr16, Val17和Gln18 HBVD-truncated e抗原连着Asp58, Leu59, Ser60, Asn61, Asn62 Arg63 TLR2,分别。

4所示。讨论

慢性乙型肝炎病毒感染的动态是由于病毒和宿主免疫反应之间的相互作用(3]。因此,在乙型肝炎病毒感染的自然过程不同阶段。患者免疫宽容阶段通常有高病毒载量和正常的血清ALT水平。然而,在免疫清除期,患者有中等水平的乙肝病毒复制和ALT水平升高3,28]。提出了e抗原作为病毒诱导免疫耐受的方法。precore和基本核心启动子(BCP)基因变异的乙肝病毒导致e抗原损失和anti-HBe血清转化(4,29日]。的终止密码子突变主要基地1896年创建截断precore肽可能代表了一种适应免疫压力(30.]。先天免疫反应的功能作为第一道防御病毒感染以及与适应性免疫的合作可能诱发precore突变的发展变异的乙肝病毒(11,31日,32]。因此,这些突变的临床意义似乎与宿主免疫系统的功能。

本研究的结果显示乙肝病毒变异的存在57%的anti-HBe-positive precore突变患者解释缺乏e抗原的合成。precore突变患者有更高浓度的TLR2相比,野生型乙型肝炎病毒感染的患者。此外,增加TLR2与血清ALT浓度G1896A precore突变的病人。血清ALT的增加可能反映了对乙肝病毒肝炎活动和宿主的免疫反应,诱发细胞凋亡和坏死3]。这些发现符合协会的一项研究报告乙肝病毒复制和激活的TLR2 precore突变患者(17]。家庭成员通常在先天免疫识别起着必不可少的作用12,16),是调节响应微生物组成33,34],至关重要的发展有效的免疫(14]。TLR2的差别是对这些受体在慢性患者的外周血单核细胞e抗原阳性感染变异之前的研究已经证实,(17]。Visvanathan等人报道,野生型(HBeAg-positive)和precore终止密码子(HBeAg-negative)乙肝病毒变异对TNF -有不同的影响生产。此外,他们显示的表达肝细胞TLR2,枯氏细胞,外周单核细胞显著增加在HBeAg-negative慢性乙型肝炎(17]。丽安等人也发现TLR2的表达显著调节患者的肝硬化和慢性乙型肝炎患者9]。有趣的是,治疗由Isogawa TLR策略等人发现,通常配体除了TLR2能够诱导抗病毒细胞因子(干扰素/)在乙肝病毒复制的网站16]。因此我们推测,增加血清TLR2水平在我们的病人可能对应于高表达的细胞TLR2和因此升高TLR2信号导致促炎细胞因子的表达,解释的慢性乙型肝炎病毒感染,通常也伴随着ALT的增加。

总之,我们的数据表明,血清TLR2的浓度明显高于e抗原阴性的患者G1896A突变进而与更高的血清ALT在这一组。这些结果表明交互precore乙肝病毒和TLR2的突变株。需要额外的纵向随访研究对象确定TLR2在e抗原阴性的精确影响慢性乙型肝炎。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

所有作者的贡献的研究和讨论,他们阅读和批准最后的手稿。

确认

本文的作者借此机会感谢所有的病人参加了这个研究项目。这项研究是由消化系统疾病研究中心的资助,德黑兰大学医学科学。

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