抑制Indoleamine-2 3-dioxygenase (IDO)胶质母细胞瘤细胞通过溶瘤单纯疱疹病毒

文摘

成功的溶瘤病毒治疗恶性多形性成胶质细胞瘤取决于广泛的肿瘤特异性裂解病毒复制和逃离减轻感染的先天免疫反应。在这里,我们描述一个新的HSV向量,JD0G,删除ICP0和联合序列分离病毒基因组的独特的长期和短期的元素。我们观察到JD0G复制是增强在某些胶质母细胞瘤细胞系与HEL细胞相比,这表明一个向量骨干删除ICP0可能有用的胶质母细胞瘤的治疗。先天免疫反应的病毒感染可能会阻碍溶瘤细胞的载体复制在人类肿瘤。Indoleamine-2 3-dioxygenase (IDO)表达了对干扰素的回应γ(干扰素γ)与抗病毒功能和肿瘤细胞的免疫逃逸。我们发现干扰素γ治疗人类恶性胶质瘤细胞诱导IDO的表达,这种表达是平息由感染与野生型和JD0G病毒。被罩在抑制病毒复制的作用,这种蛋白质的连接的肿瘤细胞逃避免疫监视的差别表明我对这些HSV感染可能JD0G等提高向量的溶瘤细胞的活动。

1。介绍

多形性胶质母细胞瘤(GBM)是最常见的原发性脑肿瘤的发病率大约3例每100000人每年在美国(2004 - 2005,http://www.cbtrus.org/)。目前的治疗方式为“绿带运动”通常是手术切除肿瘤,其次是放射治疗和辅助化疗与temozolomide [1]。肿瘤的渗透性的性质使完整的手术切除困难,和肿瘤复发是常见肿瘤的边缘。GBM患者的生存中值通常是不到两年,尽管治疗。显然,新的和有效的治疗方法是必要的。

溶瘤细胞的向量(ov),专门设计进行溶解性复制的病毒在肿瘤细胞中,为其提供一种全新的治疗方法治疗“绿带运动”。单纯疱疹virus-based溶瘤细胞的向量(oHSV)在早期阶段临床试验用于多种肿瘤包括复发性“绿带运动”。最近试验使用转基因HSV病毒G207 HSV1716,NV1020一直在鼓励,证明这些病毒相对无毒的正常组织和显示实例的病人反应(2- - - - - -6]。然而,尽管他们的抗癌潜力,这些向量的整体效果是有限的。这个观察权证的探索其他变异向量脊椎可能改善肿瘤cell-dependent向量复制。

oHSV向量所依赖的工程需要删除病毒基因有效地完成正常细胞中的病毒生命周期,但所补充的基因改变,通常发生在肿瘤细胞。ICP0蛋白是一个有吸引力的目标设计的溶瘤细胞的向量。ICP0是不必要的,立即早期基因产品,执行各种功能等病毒复制的重要抵消干扰素反应(7- - - - - -9),维持病毒基因组转录活跃状态(10- - - - - -12),和针对特定细胞蛋白质通过蛋白酶降解,包括蛋白质重要的调节DNA修复途径,细胞凋亡,细胞循环发展13- - - - - -19]。重要的是,缺乏ICP0蛋白突变体在低增长受损感染复数(MOI)在大多数细胞系(20.),而有力的复制已经观察到肿瘤细胞系如U2OS骨肉瘤细胞(21,22]。它最近被证明其他肿瘤细胞系增强ICP0-deficient向量的复制,和一个1型单纯疱疹病毒变异缺乏ICP0蛋白表达增加生存在模型小鼠乳腺腺癌(23,24]。肿瘤特异性复制ICP0-deficient HSV表明这突变可能代表一种新的支柱oHSV向量有用的“绿带运动”治疗。

先天免疫反应的病毒感染可以抑制病毒复制和传播。例如,自然杀伤(NK)细胞招募HSV感染的网站发布干扰素γ(干扰素γ)细胞因子触发多个下游通路,可以抑制病毒复制25]。干扰素的生产γ已表现出抑制复制某些oHSV在体外和病毒基因表达在活的有机体内(25,26]。当地生产的干扰素γ诱发的合成indoleamine-2, 3-dioxygenase (IDO),一种酶,这种酶催化降解的必需氨基酸色氨酸生产犬尿氨酸和多个下游代谢物。随之而来的损耗色氨酸的细胞和它的环境阻碍病毒复制(27]。此外,犬尿氨酸和其他副产物有关的肿瘤细胞逃避免疫监视(28- - - - - -30.]。因此,我可能存在障碍OV复制和免疫清除肿瘤细胞。

在这个报告中,我们描述一个ICP0-deficient oHSV向量,JD0G [31日),复制能力的缺失和胶质母细胞瘤细胞的干扰素γ。我们表明,JD0G病毒复制在胶质母细胞瘤细胞系增强与HEL细胞相比,表明前补ICP0蛋白的损失。科斯野生型病毒和JD0G适度对干扰素敏感γ在低我在胶质母细胞瘤细胞产生影响,大幅减少莫伊更高。此外,胶质母细胞瘤细胞系被罩蛋白质与干扰素刺激时产生γ,我归纳了对病毒复制的影响很小。这一观点可能与我们发现干扰素γ全身的被罩水平显著降低了神经胶质瘤细胞感染科斯或JD0G

2。结果

2.1。JD0G结构

创建JD0G,内部重复序列“联合”从应变KOS 1型单纯疱疹病毒基因组中删除,修改,删除一个副本的每个伽马34.5基因和立即早期基因编码ICP0 ICP4。切除联合提高向量稳定通过消除内部基因组重组时产生的异构化(38]。联合删除删除一个地区跨越位置从116982年到132605年的HSV基因组(基于NC_001806核苷酸位置)。其余副本ICP0然后删除,eGFP表达构建由人类巨细胞病毒()血巨细胞病毒插入主要即早期启动子。突变病毒的结构由PCR证实,测序,印迹分析。图1显示了JD0G基因组的结构相比,野生1型单纯疱疹病毒科斯。

2.2。胶质母细胞瘤细胞系支持JD0G病毒的复制

成功的溶瘤病毒治疗GBM需要高效、肿瘤细胞的肿瘤特异性复制和细胞溶解。我们比较JD0G复制科斯与野生型病毒和另一个溶瘤细胞的向量,MGH2,导数研究向量G207 [32]。MGH2缺乏的表现γ34.5和产生的非功能性ICP6蛋白融合GFP39轨迹。此外,MGH2携带两个基因编码药物前体激活酶,CYP2B1(细胞色素p450),shiCE(人类肠道羧酸酯酶分泌)。ICP0-deficient病毒受损等以低莫伊在细胞复制人类胚胎肺成纤维细胞(HEL细胞),而某些肿瘤细胞系已被证明,允许有效的复制(22]。评估人类胶质母细胞瘤细胞系的能力支持病毒复制,冥界,SNB19,和U251胶质母细胞瘤细胞被感染的莫伊0.1(基于U2OS浓度),上层清液收集在24小时postinfection (hpi)和病毒收益率衡量滴定U2OS细胞。感染科斯始终生成病毒HEL细胞收益率略高于两个神经胶质瘤细胞系(图2(一个))。相反,神经胶质瘤细胞JD0G病毒感染产生平均滴度是10倍高于来自HEL细胞(图2(一个))。类似的比较MGH2浓度在细胞系证明MGH2能够在HEL细胞复制时,它的复制是远远比受损JD0G两个胶质母细胞瘤细胞系(图2(一个))。这些结果表明,这两种胶质母细胞瘤细胞系JD0G增长提供了一个增强的环境,而不是MGH2,这些肿瘤细胞部分补充ICP0赤字。

然后我们检查的能力JD0G MGH2溶瘤病毒导致肿瘤特异性细胞死亡。冥界,SNB19 U251细胞被感染的莫伊0.1,和幸存的细胞数在48(图的快乐指数2 (b))。相比mock-infected HEL细胞,JD0G感染HEL细胞的数量减少了不到2倍。相反,神经胶质瘤细胞的数量幸存感染JD0G降低了10倍或更高。MGH2感染并没有表现出相似的肿瘤特异性杀细胞活动,导致在冥界细胞系细胞死亡超过神经胶质瘤细胞系。因此,JD0G溶瘤细胞的向量表现出比MGH2更好的肿瘤的复制概要文件和证明清楚glioma-specific细胞死亡。

2.3。干扰素γ治疗MOI-Dependent地抑制病毒的复制

干扰素γ提出了一种病毒在肿瘤细胞复制的潜在障碍在活的有机体内。评估科斯的敏感性和JD0G II型干扰素,SNB19 U251细胞与干扰素治疗γ24 h和感染科斯或JD0G莫伊的0.1或10。病毒在24日收益率hpi被滴定U2OS细胞评估。结果(数据3(一个)和3 (b)科斯)显示,(我)的增长和JD0G被干扰素抑制γ在低我两个细胞系;(2)JD0G比科斯有点更敏感;(3)两种病毒在低我过敏的干扰素γ对U251细胞;及(iv) high-MOI感染最小化干扰素γ敏感度。这些结果表明ICP0不足有一个温和的对干扰素(≤5倍)的影响γ灵敏度较低的我,一个条件可能的模型在活的有机体内培养细胞的感染比high-MOI实际感染。此外,数据表明,干扰素的抗病毒反应γ和的贡献ICP0病毒逃避这种反应在高莫伊不同胶质母细胞瘤。

2.4。干扰素γ全身的被罩蛋白对病毒复制的影响很小

当地生产的干扰素γ诱发的合成indoleamine-2, 3-dioxygenase (IDO),一种酶,这种酶催化降解的必需氨基酸色氨酸犬尿氨酸生产。我生产对干扰素的回应γ与HSV复制的抑制在特定细胞系在体外(27]。为了确定本研究中使用的胶质母细胞瘤细胞产生活跃的被罩蛋白结构上或对干扰素的回应γ,IDO-enzymatic活动评估通过测量的犬尿氨酸水平干扰素的上层清液γ处理细胞。犬尿氨酸水平增加剂量依赖性的方式以应对增加的干扰素水平γ(图4(一))。这些数据表明积极被罩蛋白质产生干扰素γ治疗胶质母细胞瘤细胞。

我们使用语言活动的小分子抑制剂,1-methyl-tryptophan (1-MT),评估被罩在观察到病毒产量减少胶质母细胞瘤细胞用干扰素治疗γ之前low-MOI感染(图4 (b))。U251细胞的干扰素γ科斯和减少JD0G收益率超过100倍,以及1-MT持续减少这个损失约15倍;1-MT独自没有影响病毒增长(数据未显示)。相比之下,1-MT没有明显改变的存在降低了收益率的科斯和JD0G干扰素γ对待SNB19细胞。这些数据表明,语言有助于干扰素γ超敏反应的两种病毒对U251细胞,但不降低SNB19敏感细胞。然而,在两种情况下,干扰素的主要作用γ似乎是通过不同的通路介导。

2.5。病毒感染可以减少干扰素的被罩信使rna和蛋白质γ处理细胞

尽管活跃被罩蛋白质产生干扰素γU251和SNB19细胞,上述1-MT实验表明,被罩活动没有显著影响病毒的复制在至少一条线,SNB19。这可能表明,1型单纯疱疹病毒能抵消IDO路径允许病毒复制。被罩蛋白水平在U251 SNB19细胞干扰素后测量γ治疗和病毒感染(图5(一个))。未经处理的细胞和细胞感染病毒就没有显示可检测水平的被罩蛋白质在12和24(图的快乐指数5(一个))。细胞用干扰素治疗γ生产被罩细胞株蛋白质。然而,细胞用干扰素治疗γ然后感染科斯或JD0G病毒显示大量减少被罩蛋白(数据的数量5(一个)和5 (b))。在现病史24,不到20%的被罩蛋白质留在SNB19 U251细胞中细胞和不到30%(图5 (b))。这些数据,代表三个独立的实验,表明与1型单纯疱疹病毒感染的细胞被罩的差别会导致对这些蛋白质。

Downregulation被罩的应对病毒感染可以发生在蛋白质或mRNA水平。因此我们测量被罩mRNA表达定量rt - pcr在病毒感染后2和8小时的干扰素γ处理细胞。结果(图5 (c))表明,被罩mRNA水平降低早2小时postinfection与科斯或JD0G病毒相比mock-treated控制。这些数据表明,与HSV感染胶质母细胞瘤细胞的结果减少了被罩mRNA和蛋白的表达,从而最小化这种蛋白在病毒复制的抑制作用。

3所示。讨论

减毒病毒的发展适应优惠复制在实体肿瘤是一个有吸引力的方法治疗恶性肿瘤,更多的标准治疗无效的或难以适用。HSV-1-oncolytic向量用于早期阶段临床试验治疗“绿带运动”取得了一些成功的没有严重的副作用(33,34]。肿瘤特异性可以通过删除病毒基因,允许在肿瘤细胞突变病毒复制而深刻影响病毒的复制在正常宿主细胞(1]。向量的原型是G207,删除γ34.5和产生一个非功能性ICP6-LacZ融合蛋白(35]。ICP6的大亚基编码病毒核苷酸还原酶,蛋白质,允许病毒:增长细胞通过维护核苷酸池,γ34.5抵消PKR通路的激活占据。更先进的溶瘤细胞的向量检查在这项研究中,MGH2,源自G207代替lacZ与eGFP ICP6轨迹和插入两个抗肿瘤基因,CYP2B1(编码细胞色素p450)和shiCE(编码分泌人类肠道羧酸酯酶)32]。这些酶激活抗癌药物环磷酰胺和伊立替康,分别,这两者都是有效的肿瘤的有毒产品。在一项研究中,MGH2显示溶瘤细胞的活动在活的有机体内只有增加环磷酰胺和伊立替康32),这表明MGH2向量并不能作为一个有效的OV支柱。一些证据表明,矢量在某些肿瘤细胞可能需要复制γ34.5活动和oHSV容易先天免疫反应,可能限制的有效性和其他oHSV向量(36]。因此,我们试图检查其他突变可能克服这些限制的骨干。

在这项研究中我们描述一个oHSV向量(JD0G)删除病毒基因组的ICP0和联合元素。1型单纯疱疹病毒突变体缺陷ICP0蛋白的生产提供一个有吸引力的替代MGH2向量骨干。ICP0-deficient向量是受损的增长在低莫伊在多数细胞系,而复制优先发生在某些肿瘤细胞系(22,23,37]。此外,无角的和他的同事们报告说,一个1型单纯疱疹病毒双突变体缺乏VP16和ICP0蛋白表达复制有效地在各种肿瘤细胞来源于前列腺癌、肺癌、结肠癌、与溶瘤细胞的活动的证据和乳房癌动物模型(24]。使用JD0G骨干,我们试图确定的独特交互ICP0-deleted与肿瘤细胞可以利用向量开发新颖的溶瘤病毒适合治疗脑部肿瘤。我们的研究结果表明,JD0G复制U251显著增强,SNB19胶质母细胞瘤细胞系与HEL细胞相比,MGH2复制高度受损时,显示2 - 3成胶质细胞瘤行收益率低于JD0G日志。这些发现指出,胶质母细胞瘤相关基因变化的可能性发展缓解ICP0表达的需要和允许JD0G复制,而突变MGH2不利于向量增长而不是补充这些线。此外,复制这两个向量之间的差异最为明显较低的多样性(数据未显示),一个条件可能更相关的情况在活的有机体内比high-MOI感染细胞培养。oHSV向量可以复制有效地从一个小数量的初始感染性粒子是最有可能有效的肿瘤。

很可能的肿瘤特异性复制JD0G向量可以归因于ICP0不足而不是删除病毒基因组的联合组件。HSV基因组包含两个独特的元素(U_l和你_年代),都是在重复序列(ab / b′′;c′′/ ca)(图1)。这种安排一起创建了两个末端重复区域包含ICP34.5基因的一个副本,ICP4, ICP0, latency-associated成绩单(LAT),内部重复元素(联合),包含第二个的基因拷贝。因此,联合建设删除生成JD0G删除每个基因的一个副本,减少但不能消除基因表达。这一修改最小影响病毒的复制(未发表的观察,38])。该删除的好处是,它消除了基因组的可能性通常发生异构化事件重复元素之间的病毒基因组并生成四种可能的HSV同分异构体。因此,JD0G基因组在科斯野生型基因增强稳定性。

接种后oHSV体内,干扰素γ可以由居民小胶质细胞,招募巨噬细胞、树突和NK细胞在生长肿瘤部位(25,39]。为了应对干扰素γ树突状细胞、肿瘤细胞可能会产生油,其酶活性导致色氨酸的退化和犬尿氨酸等有毒副产物的生产和quinolinate40]。此外,肿瘤细胞已报告包括胶质母细胞瘤细胞表达语言没有干扰素γ感应(41]。色氨酸损耗可以阻碍病毒蛋白质的生产,加上犬尿氨酸,可以诱导效应t细胞无力30.]。因此,干扰素γ可以影响溶瘤病毒复制和肿瘤特异性免疫在几个水平。虽然干扰素γ介导抑制oHSV复制部分可能克服政府等免疫抑制药物环磷酰胺,这种方法的一个缺点是,它也会抑制肿瘤特异性免疫的感应。

针对这些因素,并探讨可能的肿瘤变化影响先天免疫反应的病毒感染,科斯和JD0G病毒复制在胶质母细胞瘤细胞对干扰素敏感测试γ治疗。我们的数据表明,这两种病毒对干扰素敏感γ在低我,但干扰素的能力γ为了控制病毒复制在高架莫伊在很大程度上失去了。然而,我们观察到显著区别胶质母细胞瘤细胞系的干扰素γ灵敏度的病毒复制和被罩的参与活动的抑制病毒复制。SNB19细胞产生低水平的语言比U251细胞的蛋白质,和病毒复制SNB19细胞干扰素不敏感γ治疗。在干扰素γ过敏的U251细胞,科斯和JD0G发现表达下调,但不能消除,被罩mRNA和蛋白,IDO抑制剂1-MT能够提高病毒复制的效率。相比之下,科斯和JD0G感染几乎消除了语言表达干扰素γ对待SNB19细胞,1-MT没有提高病毒的复制。在一起,这些结果表明,语言表达高于一定水平可以抑制病毒复制的胶质母细胞瘤细胞,而且大多数的干扰素γ全身抑制病毒复制时通过不同的途径。被罩的有限作用在控制病毒复制的差别可能归因于virus-mediated对这些伊多观察在感染科斯和JD0G。不仅可以允许差别这对这些向量复制干扰素的存在γ,但也减少负面影响抗肿瘤免疫力。因此,我们建议vector-induced可能差别我对这些的一个重要方面的治疗潜力oHSV向量。

4所示。方法

4.1。细胞系和病毒

人类胶质母细胞瘤SNB19和U25142),骨肉瘤U2OS(写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国),胚胎肺赫尔(写明ATCC),维罗细胞和猴肾(写明ATCC)培养的标准方法。HEL细胞保持在RPMI补充10%胎牛血清的边后卫。所有其他细胞保持在杜尔贝科修改鹰介质(美国正在亚特兰大生物制剂,GA)补充10%的边后卫在37°C公司5%₂。野生型病毒1型单纯疱疹病毒(科斯)的股票在维洛细胞准备。

JD0G突变1型单纯疱疹病毒被删除派生的ICP0的混合感染/转染与质粒共同删除向量28 e3。为了获得28 e。3we initially deleted the fragment StuI/HpaI from the plasmid 28.1 (which consists of the Dra I fragment of psg28 [43),和一个Bgl II连接器插入到这个网站。质粒28 e3是由克隆Bgl II片段包含eGFP表达构建从pEGFPN-1血巨细胞病毒(美国Clontech,帕洛阿尔托,CA)的Bgl II网站28 b。

JD0G病毒股市准备U2OS细胞。MGH2病毒被安东尼奥Chiocca请提供(俄亥俄州立大学)。比较的目的,通过在基于病毒滴度决定U2OS细胞。

4.2。病毒的增长

110⁵细胞被播种在24-well菜之前感染。汇合的单层膜的细胞被感染的莫伊0.1血清DMEM(亚特兰大生物制剂)2 h。上层清液收集在24 hpi,病毒滴度测定连续稀释U2OS细胞。斑块被结晶紫染色可视化。

4.3。干扰素γ治疗

710⁴细胞被播种在24-well菜肴和预处理或模拟治疗24小时与500 U /毫升的重组人干扰素γ(美国细胞科学,广州,MA)。IDO抑制剂1-methyl-L-tryptophan(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)是300年在最后一集中使用μ在适当的莫伊m .预处理细胞被感染血清DMEM的2 h,病毒被移除,这些细胞被美联储与新媒体+干扰素γ。上层清液收集在24 hpi和病毒滴度测定连续稀释U2OS细胞。斑块被结晶紫染色可视化。

4.4。定量rt - pcr

细胞被播种在6-well菜肴和预处理或模拟治疗20 h和500 U /毫升的干扰素γ。进行预处理细胞被感染的莫伊20与科斯或无血清DMEM JD0G 2 h,病毒清除,用干扰素和新媒体γ被添加到井中。细胞收获在指定时间postinfection(2或8 h),和总RNA提取使用RNeasy工具包(美国试剂盒,瓦伦西亚,CA)。2μ克总RNA被用来合成第一cDNA链使用上标第一链合成系统(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。如前所述(执行定量聚合酶链反应44]。平均伊多值与平均归一化值GAPDH和数据被绘制为褶皱的变化相对于未经处理的,mock-infected控制使用方法(45]。以下引物和探针获得体育应用生物系统公司(美国CA福斯特城):前轮驱动,被罩GGTCATGGAGATGTCCGTAA;被罩牧师,ACCAATAGAGAGACCAGGAAGAA;被罩探测器,6 fam-ctgttccttactgccaactctccaagaaactg-tamra;GAPDH-FWD CCCCACACACATGCACTTACC;GAPDH-REV CCTACTCCCAGGGCTTTGATT;GAPDH-Claw-Probe 6 fam-aaagagctaggaaggacaggcaacttggc-tamra。

4.5。犬尿氨酸测定

310⁴细胞与不同浓度的干扰素进行预处理γ(0 - 500 U /毫升)在100年媒体补充μg / mL色氨酸。经过3天的孵化,上层的收获犬尿氨酸含量的测定。160年的样品μL孵化了10μL 30%的柠檬酸为30分钟50°C和离心机在3000 rpm在室温下20分钟。100年μL(每个样本与同等体积的埃利希的反应试剂在室温下(σ)10分钟,和OD_490年使用标仪测量。

4.6。免疫印迹

310⁵细胞被播种在6-well菜肴和预处理或模拟治疗20 h和500 U /毫升的干扰素γ。进行预处理细胞被感染的莫伊20与科斯或无血清DMEM JD0G 2 h,病毒清除,用干扰素和新媒体γ被添加到井中。细胞收获在指定时间postinfection(12或24小时),200年resuspendedμL裂解缓冲(10毫米三pH值7.4,150毫米氯化钠,5毫米EDTA pH值8日Triton-X 0.1%, 1毫米德勤,PMSF 1毫米,1毫米衣饰归宿₄,0.2%的蛋白酶抑制剂鸡尾酒(σ)),在冰上和孵化了30分钟。5μg总蛋白质的8% sds - page凝胶和转移到解决Protran 0.45μm硝化纤维素膜(绘画纸,皮斯卡塔韦,新泽西,美国)。膜被1 h在室温Tween-20-free奥德赛阻断缓冲区(美国东北LI-Cor生物科学,林肯)和孵化一夜之间在4°C 1: 5000稀释alx - 210 - 429只兔子anti-IDO抗体(Alexis生化药剂,瑞士洛桑)和1:20000稀释的鼠标反α微管蛋白抗体(T6074σ)1 x Tween-20 PBS / 0.05%。膜与1 x PBS / 0.05% Tween-20洗,孵化1 h与山羊在室温下anti-mouse IRDye800CW-green和山羊anti-rabbit IRDye680-red二级抗体(来自LI-Cor),和洗1 x Tween-20 PBS / 0.05%。膜与奥德赛红外扫描成像系统(LI-Cor)和分析奥德赛3.0软件,由制造商指定的。

4.7。细胞死亡

110⁶细胞被播种在6-well菜肴和感染24小时后在无血清DMEM莫伊0.1(亚特兰大生物制剂)。媒体被新鲜血清取代1.5 h和48 h后postinfection可行的细胞和锥虫蓝染色和统计。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者感谢大卫·克林肯伯格和Qiwei汉技术援助和大卫·克劳森和比尔戈因qPCR分析。这项研究是由国家卫生研究院的基金支持NS040923 CA119298 j . c . Glorioso,和p .大人物从科普兰基金会的资助。b•莱因哈特(carmen Reinhart)是由一个奖学金支持从美国国立卫生研究院培训项目在分子微生物持久性和发病机理。

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