文摘

hiv - 1亚型C V3环共识序列展览增加抵抗anti-V3抗体介入中和而亚型B共识序列。的动态三维结构C V3环冠共识,可视化从头开始折叠,建议阻力来源于结构刚性和非β链的氨基端链蛋白质二级结构β发夹V3循环的王冠,这是大多数已知anti-V3循环抗体结合。刚性或非的观察β链结构在这个地区与观察抗抗体介入中和在一系列的嵌合pseudovirus (psV)突变体。结果表明存在一个epitope-independent, neutralization-relevant antibody-targeted地区结构差异之间的V3环冠亚型C和B亚型不同,我们假设可能导致这些亚型之间的全球传播的不同模式。作为一个变量循环抗体最近被确定为逆相关的感染艾滋病毒的风险,本研究讨论的结构关系可能与艾滋病毒疫苗研究。

1。介绍

C亚型感染现在占全球绝大多数hiv - 1感染(1),建议大在活的有机体内宿主-病原体健身或。相比之下,直接在体外竞争分析,R5亚型B隔离战胜R5 C亚型分离(2),建议大在体外感染性健康。因此,更迅速在活的有机体内C亚型感染的传播可能发生尽管明显更大在体外健身的亚型B。

人类抗体介入中和的敏感度可能导致不同的区段不同亚型之间的全球传播。V3循环通常被称为hiv - 1病毒的主要中和行列式的几种早期和近期的研究描述人类抗体能够中和hiv - 1是由anti-V3循环抗体(3- - - - - -6]。事实上,一些观察结果表明构象或功能不同亚型B和C亚型V3环(7),但尚未阐明的本质区别。V3环也是CCR5和趋化因子受体CXCR4参与的网站,一个必要的行列式病毒入口(8- - - - - -13]。因此,抗体中和决定因素和感染性因素一致相同的位置在hiv - 1包膜糖蛋白表面,和干扰可能会影响其他。

比较SF162嵌合抗体介入中和的psv携带共识亚型C V3循环序列(浓缩的)共识的亚型B V3环序列(conB)由两个不同的广泛中和anti-V3循环单克隆抗体(mab)先前表明,浓缩的更多的中和抗体介导的阻力(图1)[14]。每个马伯(即。,2219 and 447-52D) has been crystallographically confirmed to have distinct V3 loop binding modes [15,16]。差特征和可变V3环表面接触的特征是控制在这些实验使用先前建立方法构造psv表达不同序列的V3环在同一个SF162 Env背景(17]。SF162敏感抗体介入中和在这个设置提供了一个相对稳定的V3环接触和最小Env可变性背景不同的嵌合埃因霍温。中和两个突变体之间的差异不同只在V3循环序列应该由V3环本身的结构差异引起的。因此,一部分C亚型病毒的抵抗anti-V3抗体介入中和映射到V3环本身,而不是结构效应在V3循环或外表面接触不同亚型B和C亚型。

前面分析的3 d交互表面2219和447 - 52 - d绑定到V3环将V3循环划分为氨基酸位置组成Ab“抗原决定基”和那些不14]。抗原决定基或Ab-bound表面的三维结构可以分为两个功能不同的类别。第一类是氨基酸被发现包括中和表位:这些被定义为紧(通常是静电),substitution-intolerant口袋抗体表面之间的互补性,V3和特定的氨基酸侧链限制抗体的中和活性。这些氨基酸被确定为447 - 52 - d和R18 K10-I12-Y21抗体2219 (14),每个氨基酸后数量单字母的名称是指在V3环氨基酸的位置从disulfide-bonded半胱氨酸作为1号。这些氨基酸侧链的突变破坏Ab-mediated中和强劲。

第二类是其余的抗原决定基或Ab-bound 3 d分子表面:mutation-tolerant之间联系松散V3侧链或V3环骨架的表面抗体绑定依赖的整体三级形状约束V3环构象。我们定义这些区域突变不敏感,“epitope-independent”位置在本研究中,虽然技术上所有原子联系Ab组成表位,这些位置可以间接影响抗原决定基。

浓缩的序列与conB序列的不同之处在于前者,substitution-intolerant类型的接触。因此,用的时候出现在浓缩的与R18 ConB,嵌合psV携带浓缩的循环显示是可以预见抗抗体447 - 52 - d (20 ug /毫升测试,图1)。然而,当这个重要的联系被废除conB序列(由R-to-Q突变位置18 (R18Q),抗体介入中和减少但不能废除,表明观察到抗抗体介入中和并不完全取决于这个特定的中和表位(图联系1)。相反,浓缩的序列不不同于conB序列抗体的中和表位联系人2219 (K10、I12和Y21),但conB 2219抗体介入中和而浓缩的敏感部分耐药。该epitope-independent电阻为2219的大小大约是相同的大小,推断447 - 52 - d。为抗体,因此,大量epitope-independent结构机制,在浓缩的但不是conB,似乎背后抵抗anti-V3抗体介入C亚型病毒的中和。

因此,我们假设,我们可以想象epitope-independent微分电阻的3 d结构基础观察亚型B和C亚型V3环之间的关联以前公布的psV中和测量与动态三维结构可视化的几个精心构建V3环突变体。为了做到这一点,我们需要至少2 Abs与结晶学确认差异有针对性的V3皇冠抗原表位,所以Abs 447 - 52 - d和被选出的2219位宾客,但我们希望这些结果普遍适用于所有V3 crown-targeted Abs。

2。结果

2.1。在位置12到14段共识C V3环冠刚性,非β链构象

最近的一些研究可视化快照V3环的3 d结构的核磁共振和晶体学15,16,25]。马伯的一个常见特征2219和447 - 52 - d是绑定位置12到14 V3环的反平行的β表时尚。这个结果可能是适用于最广泛中和anti-V3-loop抗体,作为他们的线性抗原表位重叠,在大多数情况下,在氨基β链(位置12至14)V3的循环(m . Gorny个人通信)。的β链的位置12 - 14 V3环似乎是一个共同的结构特征识别和所需的函数anti-V3抗体。以来,这一地区是主要骨干(non-side-chain)接触V3抗体,这个地区的蛋白质骨架构象(例如,α螺旋,β链等)可能会影响anti-V3抗体介入中和。因此,我们仔细检查本地区骨干构象差异neutralization-resistant浓缩的和neutralization-sensitive conB。从头开始多肽折叠算法以前被证明是能够预测的灵活性和构象偏好V3环冠,概括晶体形式(见补充图1在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2012/803535),并证明V3环冠位置10 - 22的V3循环行为作为一个自动折叠,但灵活,域(18- - - - - -20.]。折叠肽的序列相同的浓缩的V3皇冠职位10 - 22日表明,肽骨干喜欢严格的,非β链结构在12到14(图位置2)。相比之下,肽与氨基酸序列相同的10-22 conB V3皇冠骨干采用灵活的构象与清晰β链12到14字符位置和整体清晰β发夹褶皱(图2)。conB序列一贯采用的关键职位ϕ- - - - - -φ角的典型的II型beta-hairpin V3 GPG序列,而这些都是浓缩的。刚性和非β链结构的12 - 14 C亚型V3皇冠的V3段可能存在一个充满活力的障碍肽抗体介入中和所需变形,特别是弯曲结构的中和相关β链构象。因此,这些结果显示以下epitope-independent结构活性关系:anti-V3-loop-antibody-mediated中和取决于一个灵活β链在V3环位置12到14。

2.2。替换的V3抗体结合位点影响刚度和β链构象

我们开始通过专注于突变的结构性影响的关键职位13和14 C亚型V3环通过折叠一系列V3环冠在这些位置与点突变(表1)。位置12避免了因为它是2219年的中和表位的一部分,因此这样的突变体排除一个标准化的评估non-epitope-dependent在突变体的影响。从头开始折叠的浓缩的变异在14 V3环的位置从Ile相遇(I14M)轻度增加了V3皇冠但保留了强大的灵活性β发夹构象。从头开始折叠的I14V浓缩的突变体恢复完整的灵活性和2/3β链的角色这个局部地区。I14L表现出非折叠β链,部分α螺旋构象。有趣的是,我们以前证明α螺旋构象在这个区域足够颠覆性废除传染性的病毒(20.),这表明I14L在这个数据集拥有最强的抗抗体,但也可能是最感染性构造。I14F重新建立的三分之二β链在12到14地区,但没有保留β发夹的c端链V3皇冠不接触氨基链和总体结构仍有些僵硬。

比较与中和数据从这个折叠的数据在体外嵌合psv相同的突变表明损失2219抗体介入中和与双方的损失β链特征和结构的灵活性,同时减少2219中和与损失相关联的独立因素(表1)。如前所述,所有测试嵌合psv表1保持2219绑定抗原决定基侧链的关键控制特性,所以增加抗抗体介入中和似乎与损失β链或β发夹V3环和/或损失的构象结构灵活性在12到14 epitope-independent地位置。

突变在V3皇冠可以影响整个皇冠的折叠,以及这种模拟进行突变位置以外的13和14。在网上突变在职位18 - 22 conB没有显著改变折叠(表1)。一个浓缩的T19A在网上突变并有所改变整体折叠,导致部分恢复弹性和完全恢复β链在12 - 14字符。这些结果也与前面提到的阻力在体外嵌合埃因霍温2219抗体介入中和,所以关键Ab-targeted地区外的变化可以间接影响折叠,观察到的效果是三级和没有特别依赖于任何氨基酸的位置。

2.3。Epitope-Independent效应可能一般各种Anti-V3抗体

当测试14广泛中和抗体anti-V3来自捐赠者感染亚型A和B,浓缩的嵌合埃因霍温是中和抵抗所有的马伯更大程度上比conB嵌合psV(表2)。一个non-V3 Ab-b12-did没有显示相同大小的影响。面板,447 - 52 - d和2219是已知不同的抗原表位,并很可能许多其他的马伯也不同的抗原表位。的共同抵抗浓缩的所有这些不同的抗体表明一个epitope-independent结构抵抗中和驻留在V3循环。

3所示。讨论

这里所描述的实验结果表明,很大比例的anti-V3抗体介入中和阻力的浓缩的序列的抗体结合域直接映射到V3皇冠。此外,epitope-independent结构特征的C亚型V3皇冠抗拒中和抗体由多种anti-V3似乎是一个僵化的氨基端非β链构象的位置12到14 V3循环。这种效果是更常见的独家观察抗体逃避机制,也就是说,突变的主要中和抗原决定基侧链,比如447 - 52 - d R18Q我们展示了结果区分,antibody-specific阻力。的组合的损失主要中和抗原决定基氨基酸侧链刚性或非β链结构导致的总电阻psV轴承这些V3环属性中和抗体的问题。因为这些V3循环序列的内在特性,这种现象将适用于循环病毒轴承这些属性在V3循环,特别是C亚型病毒。我们解剖单一V3环点突变的影响表明,每个点突变的影响是复杂的,和骨干作用组合同时所有V3环的位置。因此,没有一个氨基酸的位置是单独负责浓缩的结构现象。的融合三个完全独立的数据——(1)已知晶体V3肽结构绑定到抗体,psV中和(2)模式,(3)验证从头开始折叠模拟强烈支持这些结论。

我们的观察表明,一个灵活的,β链结构位置需要12到14 anti-V3抗体介入中和,事实上这个地区是受许多anti-V3抗体。然而,这不能只认为抗体绑定基础结构活性关系。中和抗体绑定是一个多步骤的过程,只有一个步骤。可以想象一个刚性V3环皇冠的形状是完全互补的抗体结合位点,因此结合抗体在体外,但是病毒可能耐不过是中和由于这种完全相同的刚度的影响在中和其他步骤的过程。例如,neutralization-relevant V3循环与其他表面gp120的互动可能会影响到V3环的刚度。由于这个原因,有可能是结构刚度V3环冠也可能影响由non-V3-targeted中和抗体通过抑制中间涉及一系列构象的V3环的构象变化,可能占整个中和过程。事实上,浓缩的psV展品轻度增加抵抗non-V3 Ab b12(表2)。

浓缩的独特的抵抗各种各样的子类型和亚型B派生anti-V3抗体可能知情的观察低变异性的共识序列循环亚型C株(26]。如果中和通过V3环是一个强大的选择压力循环C亚型病毒,然后感染性V3循环序列窝藏抵抗anti-V3-loop-antibody介导中和可能以更高的速度观察和表现出更少的逃避突变序列(变化更少)。作为一个推论,a和B亚型派生anti-V3抗体可能不会像疫苗非常有效的工具来应对C亚型,一个曾被建议的观察B亚型(27]。不同的策略来审问C亚型感染HIV阳性血清可能需要揭示小说,有效中和抗体反应,此子类型。另一方面,V3环序列的多样性存在于C亚型除了占主导地位的浓缩的和conC-like序列。我们观察到的效果是不太可能普遍在C亚型,和一些C亚型毒株可能出现V3循环灵活性或编码补偿变化的其他部分gp120负担由anti-V3有效中和抗体。

埃因霍温中和数据与折叠模拟的结果强烈相关。这种关系扩展以前的观测表明12β发夹残留物(职位10 - 22)V3 crown-including目前已知anti-V3抗体结合站点——是怎样足够灵活的原位V3循环行为本质上是自由肽或自动折叠子域名(18- - - - - -20.]。从头开始折叠模拟V3环冠可能会因此可视化在低分辨率的动态结构整体一些V3环冠在网上,一个重要的潜在的高通量功能结构映射——(中和)活动关系在V3环冠。应该注意的是,两个属性的识别更容易评估在动态的许多conformations-secondary结构和rigidity-facilitated折叠的比较我们图书馆的解释数据。观察结构趋势在一个非常具体的location-positions 12到14 V3循环也促进了研究。更微妙的和全球结构模式,包括整体褶皱的分配和绝对的精力充沛的稳定对于整个领域,可能更难以辨别和评估不同的褶皱为目的的相关性实验。

埃因霍温的强相关性中和折叠模拟的测量与观察到的结构特点也建立了SF162嵌合psV系统提供,甚至高分辨率、一致的病毒学背景跨多个实验和V3循环序列变化。嵌合psV中和测量的组合从头开始折叠模拟允许详细的量化动态structure-neutralization活动关系映射的V3循环。这样的研究将与晶体学是很困难的,这是低吞吐量和不评估动态结构。

抗体抗原表位V3循环可能发生广泛的hiv - 1病毒,但是这些抗原表位抗体似乎有限访问可能由于“掩蔽”聚糖和附近的影响变量域(17]。在这部作品中,比较与折叠模拟中和测试可能会显示一个名不见经传的结构性原因epitope-independent抗体介入中和的变化。这一事实的一些抗抗体介入中和抗体绑定直接映射到V3环的面积影响的观点掩盖:V3循环抗原表位的一些观察到的屏蔽可能V3环本身固有的,不是由于外部因素,如聚糖和其他变量的循环gp120尽管这两个因素都有可能手术不同程度在任何给定的压力。这里描述的方法可以被修改以“本地化”V3循环抗原决定基的屏蔽主要hiv - 1隔离,至少V3循环或“outside-V3循环”位置,通过识别anti-V3循环antibody-resistant初级分离序列这种“地方屏蔽”出现了。

hiv - 1病毒进化部分面具受体相互作用的表面以隐藏那些脆弱的表面感染性免疫系统贸易损失的效率增益的伪装保护。巧合的因素感染(趋化因子受体结合表面)和免疫检测(广泛中和抗原表位)V3循环可能需要这样一个权衡最佳病毒健身。因为各种anti-V3抗体似乎坚持这里描述抗体抵抗机制,表明这种权衡是完成工作在C亚型的部分采用V3环结构形状,是低效的,抗体介入中和和coreceptor绑定刚性非β链构象。相同的病毒机制产生的这一特性V3环产生其他四个变量的结构特点循环,很可能相同的权衡是利用病毒进化功能区域的V1 / V2, V4, V5-loops。如果anti-variable循环抗体发挥足够重要的作用在人类保护性反应循环HIV - 1菌株,这里所描述的现象我们可以解释观测到的并发不同的健身(贫穷受体使用)降低,增加自然传播(成功的免疫逃避)亚型c .的确,最近anti-V2循环Abs作为唯一的识别已知的感染艾滋病毒的风险表明逆关联变量循环抗体的确扮演了一个重要的角色在人类从循环HIV - 1病毒保护性反应28]。

4所示。方法

4.1。动态的结构表征V3皇冠

为了有效地关联与中和模式三维结构,各种突变体的可视化动态构象景观V3循环的皇冠在网上是必要的。有趣的是,相同的序列已经被解决在复杂的两种不同的抗体,采用不同β链结构两个不同的环境,尽管相同的序列。这些本质上代表的许多生物相关的两个构象的快照动态构象合奏。我们以前报道,最先进的从头开始多肽折叠算法可以准确地揭示了构象景观和动态V3环冠的三级结构分析的两种不同的形式的晶体结构戒律(18]。从头开始折叠的残留10 - 22 V3皇冠重现了两种形式,证明了它们之间的关系(2219年的形式是低能量更普遍的形式)。由于折叠的输入氨基酸序列,该算法至少可以隐约看到在网上任何V3环冠的生物相关的动态整体序列从位置10 - 22所示。由一个独立的集团(此功能后来验证19]。这个结果也表明,V3皇冠的这一部分的行为类似于一个自动折叠,自由,不受约束的肽,因为没有限制使用的折叠模拟肽和折叠的两个茎定性实验重现看到一种形式在[gp120原位V3环6]。最后,这种技术被用来工程师一名α螺旋V3环冠和证明它失去传染性20.]。从头开始折叠的残留10 - 22 V3皇冠的psv因此用于这项研究是用来评估的灵活性和构象偏好V3环冠结构在网上。

所有折叠和ICM进行模拟和分析软件(美国MolSoft LLC,拉霍亚,CA)如前所述[21]。该算法曾被预测实验证实肽结构可达23所示内残留的长度误差精度限制(22]。为每个折叠运行作为起点,充分扩展构象full-atom(包括氢)模型的每个表示V3环冠序列(职位10-22)生成的。能源评估MC运行期间的总数是基于自由变量的数量(数量的免费标准扭转角)。每个MC运行2 - 3小时了CPU时间3.00 Ghz双核英特尔至强处理器。确切的脚本的褶皱和所有可用的折叠数据要求从相应的作者。

所有数据在嵌合psV建设和中和化验以前发表在文献[14,17),除了那些重复确认在本研究中或在表2。在所有情况下,使用相同的方法。简单地说,每个嵌合psV构造了包含不同的V3环序列嫁接取代V3环SF162 Env, V3环的相对可访问(“揭露”)17]。因此,观察到的差异引发的psV中和每个马伯映射到不同的V3环序列。V3嵌合SF162 psv与V3突变引入了表示文本的共识B亚型共识或C亚型V3循环,或V3嵌合SF162 psv建造的SF162 V3环取代了V3环共识序列从亚型A1, B, C . mab的中和447 - 52 - d和2219,以及其他Abs、每个psv的评估使用[描述方法之前23]。短暂,中和活动决心用一个单循环传染性试验使用psv的生成env缺陷luciferase-expressing pnl4 - 3. -卢克。re / v -质粒(24准型与上述SF162 V3变体。孵化了埃因霍温系列稀释的马伯1.5小时37°C,然后添加到CD4 + CCR5 + U87镀靶细胞在96 -孔板的聚凝胺(10毫克/毫升)。24小时后,细胞被裁判RPMI中含有10%的边后卫和10μg / mL聚凝胺,其次是一个额外的24 - 48小时孵化。荧光素酶活性测定48 - 72小时用微量滴定板postinfection光度计(HARTA, Inc .)使用从Promega化验试剂,Inc .几何平均滴度为50%中和(格林尼治时间₅₀)从中和由插值曲线和平均至少有三个独立的化验。

缩写

艾滋病毒:

人类免疫缺陷病毒。

确认

作者要感谢博士卡塔琳娜州Hioe,亚伯拉罕博士品特,詹妮弗·福勒博士编辑方面付出了大量努力。品特博士还负责数据表的贡献2先前发表的观察和额外的验证性实验。这项工作是由比尔和梅林达•盖茨基金会支持的(没有。38631年),美国国立卫生研究院,包括DP2 OD004631 (t·卡多佐)R01 AI084119 (t·卡多佐)AI36085 (s . Zolla-Pazner) HL59725 (s . Zolla-Pazner)和AI27742(纽约大学艾滋病研究中心),美国国家科学基金会,包括没有。0333389培训支持d .杏仁,从退伍军人事务部的统计和研究资金。

补充材料