文摘
六个病毒分离株的基因和症状多样性导致木薯褐色条斑病(摘要)流行(肯尼亚、莫桑比克和坦桑尼亚)和最近流行地区的影响(乌干达)东非进行了研究。五个木薯品种;艾伯特,哥伦比亚,Ebwanateraka TMS60444(敏感)和Kiroba(宽容)嫁接接种每个隔离。基于大量的参数包括叶和根的症状的严重程度,并通过嫁接病毒传播的程度,病毒分为严重或相对温和。这些结果进一步证实了机械接种的13个草本主机毒性隔离导致植物死亡烟草clevelandii和n benthamiana而温和的隔离没有。系统发育分析完整的外壳蛋白基因序列的分离序列一起获得其他14 field-collected肯尼亚和桑给巴尔,样本和参考序列组合成两个截然不同的集群,代表两种木薯褐条病毒。放在一起,这些结果并没有建议协会与当前摘要hypervirulent形式的病毒流行在乌干达。识别的严重的和温和的分离,然而,进一步影响疾病管理和检疫要求。
1。介绍
木薯褐色条斑病(摘要)是流行在印度洋沿岸地区的东部非洲,从东北边境的肯尼亚坦桑尼亚边境的赞比西河在莫桑比克,它是普遍的在马拉维湖的岸边。在流行地区,摘要仅限于海拔低于海拔1000米(1- - - - - -3]。最近,摘要据报道在midaltitude水平(1200 - 1500米以上海平面)在刚果民主共和国(4)、乌干达(5),和坦桑尼亚区湖地区(6,7),不被认为是危险的疾病。这是一个严重关切,因为这种疾病发病率高达100%的记录(8],在敏感品种块茎的疾病导致腐烂,减少块茎可供消费的数量和质量(1,2,9]。中度感染的摘要(10 - 30%损伤根表面积)木薯块茎的市值大幅减少90%,取下每吨5美元,而不是55美元新鲜健康的木薯根(10]。严重患病的根源是完全摧毁,不适合市场或家庭使用。最近的估计表明,摘要造成的经济损失每年高达1亿美元的非洲农民(11),这些可能是低估了,因为这种疾病已经蔓延到新的领域(5,7]。这种疾病现在被认为是最重要的食品不安全的原因在沿海和东部非洲区湖地区。
基于完整的基因组序列,摘要是由两个截然不同的病毒引起的物种。沿海流行病毒被称为木薯褐条病毒(CBSV)和高地流行病毒木薯褐色条斑乌干达病毒(CBSUV)。两个物种属于属Ipomovirus、家庭Potyviridae(12- - - - - -16),是由烟粉虱传播的(烟(寄主植物上的17,18]。
摘要的突出症状出现在叶子不同模式的萎黄病使尼科尔斯(2区分两种类型的摘要隔离)。叶片萎黄病出现在羽毛图案,首先沿着边缘的二次静脉,后来影响三级静脉和可能发展成萎黄病的斑点。或者,萎黄病可能不清楚相关的静脉,但出现在主静脉之间近乎圆形的补丁。有相当大的变化的表达叶症状取决于品种、生长条件(温度、降雨量和高度),年龄的,所涉及的病毒隔离引起的症状。一些品种显示标记叶症状但没有或延迟根症状(例如var Kiroba),和反之亦然。症状的疾病更加难以识别与著名老植物叶子越低症状开始衰老和脱落。新的叶子从这些植物通常不显示症状,尤其是在高温下。症状也可以瞬态当一段活跃增长产生无症状组织(19]。然而,很难解释这些观察正是因为他们已经在现场的情况下不同农业气候条件,在木薯品种不同病毒抵抗水平和作物的年龄,可能感染了不同的病毒株,在自己或组合影响症状的发展。因此,本研究的主要目标是研究症状CBSV的多样性和CBSUV隔离在统一的环境条件下,并确定是否摘要流行病毒的严重形式。因此,六个摘要隔离从流行(莫桑比克、肯尼亚、坦桑尼亚和桑给巴尔)和流行地区(乌干达)接种五个木薯品种与不同级别的病毒宽容。每个病毒对植物生长的影响和症状发展记录在标准条件下温室。症状的多样性也研究了接种实验寄主植物13种。病毒分离株的遗传多样性估计通过克隆和测序完成外壳蛋白(CP)的基因。
2。材料和方法
2.1。木薯品种和摘要隔离
五无病木薯品种茎岩屑Ebwanateraka(来自乌干达)和艾伯特和Kiroba(来自坦桑尼亚)则来自于农民的田地。品种获得了哥伦比亚大学的布里斯托尔英国和TMS60444国际热带农业生物技术实验室(ILTAB),圣路易斯,美国。植物被种植在28±5°C, 50 - 60%的相对湿度隔离温室自然资源研究所(NRI),英国,并观察了木薯花叶病(CMD)和摘要症状。植物virus-indexed使用逆转录聚合酶链反应(rt - pcr)检测和缺乏两种木薯褐条病毒(CBSVs)使用引物设计在这个研究(见下文)以及木薯花叶begomoviruses(招商银行)20.,21]。无症状的植物中没有检测到病毒进一步培养通过节点味蕾的微体繁殖利用组织培养技术(22]。PCR用于组织培养的植物进一步证实CBSVs和CMBs的缺失。由此产生的传染植物被用于随后的病毒接种实验。
六个摘要收集病毒分离株用于这项研究未知的木薯品种的茎岩屑农民的田地(表1,图1在莫桑比克楠普拉,从疾病流行地区(CBSV - [MZ: Nam1-1:07]);Naliendele、坦桑尼亚(CBSV - [TZ: Nal3-1:07]);坦桑尼亚桑给巴尔(CBSV - [TZ: Zan6-2:08]);肯尼亚Mwalumba (CBSUV -[柯:Mwa16-2:08]);基巴哈、坦桑尼亚(CBSUV - [TZ: Kib10-2:03]),从疫区Kabanyoro,乌干达(CBSUV - [UG: Kab4-3:07]) (23,24]。病毒的身份被确认使用rt - pcr、克隆和测序完成的CP基因(见下文)。
2.2。嫁接接种病毒隔离和记录症状严重程度
六个摘要隔离被嫁接到两个健康的五个木薯品种:木薯植物Ebwanateraka,艾伯特,Kiroba,哥伦比亚,TMS60444。植物被保存在恒定环境28±5°C和症状发展50 - 60%的相对湿度。在每周的时间间隔记录各种参数确定摘要症状严重程度对木薯叶和根,草本主机(见下文),嫁接传染,感染的发芽木薯被感染和病毒滴定度在植株。十岩屑是为每个virus-variety组合(6治疗病毒品种×5 = 30)导致300岩屑。数字记录发芽的岩屑测量摘要对发芽的影响年轻的岩屑。
叶症状严重程度得分在三个工厂使用5点量表,1 =没有可见的摘要症状,2 =轻度叶面症状在一些叶子,叶面3 =明显症状,但没有枯萎,4 =明显叶症状可能包括轻微的枯萎的分支,和5 =严重的叶片症状和植物枯萎9,25]。根症状记录约18个月后种植的水平削减块茎每1 - 2厘米。
2.3。Sap-Inoculation草本的寄主植物
十三草本物种/品种测试他们的反应通过sap-inoculations CBSVs(表2)。0.06磷酸钾缓冲准备(80.2毫升的0.6 K2HPO4+ 19.8毫升0.6 KH2阿宝4+ 900毫升SDW)和pH值调整到7.4,热压处理过的。对于每个隔离,木薯叶显示清晰的摘要症状分别收集和地面~ 20毫升的磷酸钾缓冲用杵和臼。叶碎片分离从sap通过无菌棉布挤压。完全开放的年轻草本植物的叶子撒上细600网金刚砂粉和植物sap应用轻轻用棉花垫抚摸叶柄的叶小费。病毒接种叶使用喷射的水彻底冲洗10分钟后的应用sap和植物保持了症状的发展。植物接种缓冲区仅作为控制。
2.4。CBSVs检测和估计病毒滴定度
分开总核酸提取木薯叶片感染每一个病毒隔离使用修改后的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)方法(21,26,27]。为了设计特异性引物,12个完整序列的CBSVs基因库数据库中可用的欧洲分子生物学实验室(EMBL)对齐和最保守的引物设计的3′末端区域的基因组区域。向前一个简并引物CBSVF2(5′应用GGR CCA TAC ATY AAR TGG TT 3′)常见CBSVs设计中间的守恒HAM1h蛋白质约250基地的5′末端上游CP。两个反向引物CBSVR7 (5′CCC TTT GCA AAR CTR AAA TARC 3′)和CBSVR8 (5′CCA竞技场队伍TCT YTC凸轮ADC TTC 3′)具体CBSUV CBSV,分别设计的保守区域(UTR)。3′端非翻译区病毒互补准备两个样品的graft-inoculated木薯植物为每个孤立使用OligodT底漆和rt - pcr进行描述Abarshi et al。27]。估计病毒颗粒的相对浓度,互补是连续稀释:10−1,10−2,10−3,10−4和10−5,用rt - pcr病毒基因组放大。
2.5。病毒外壳蛋白基因的克隆和测序
CBSVF2是与另一个简并引物结合使用CBSVR1 (5′AAY ARA亚美大陆煤层气有限公司得到ATG GAG AAA G 3′)放大的完整CP CBSVs Abarshi协议后et al。27]。CBSVR1旨在保护地区的3′UTR CBSVF2一起,这些引物扩增片段包含约1600基点部分HAM1基因,部分3′UTR,完整的CBSVs CP。被克隆到pGEMT容易获得的rt - pcr扩增子向量(英国Promega)和测序。为每个样本两个克隆测序在两个方向。序列编辑和一致使用软件包MEGA4 [28]。爆炸搜索分析进行了确认序列的身份。最大的吝啬分析和启发式搜索用于生成最吝啬的系统发育树。树的可靠性估计1000引导程序重复执行。所有摘要隔离的CP基因序列与参考序列从EMBL获得数据库(加入数字:FN434109, FJ185044, FN433931, FN433933, FN433932, FJ039520, FN433930, FN434436和GQ329864)。
2.6。CBSV遗传多样性在现场样本
以相关症状变化观察到病毒的遗传多样性,一个迷你调查2008年10月进行了摘要在肯尼亚北部和南部的沿海地区城市蒙巴萨(23]。调查延长以南约120公里处沿着大路向坦桑尼亚边界单元,和蒙巴萨的北B8 Kilifi镇。木薯叶显示摘要症状在农民的田间收集邻近高速公路每间隔15 - 20公里。五个摘要影响叶也采集样本进行分析从农民田地桑给巴尔岛上的同一时期。的基因组CBSVs是从field-collected放大样品使用CBSVF2和CBSVR1引物PCR产品上面的克隆和测序。
3所示。结果
3.1。参数测量估计摘要症状严重程度对木薯
接枝效率传输
30的植物嫁接接种为每个病毒和各种组合,所有的植物接种CBSV - (TZ Nal3-1:07):和CBSV (MZ Nam1-1:07):导致感染(表3)。剩下的隔离的感染效率不同的只有60%的植物感染了艾滋病隔离CBSUV——(UG: Kab4-3:07)。没有观察到显著差异在品种的摘要感染,不同的从77年的87%。
受感染的岩屑的萌芽
在隔离,最大数量的岩屑从传染病隔离CBSUV发芽——(UG Kab4-3:07):(96%)和最少的岩屑从CBSV - (TZ Nal3-1:07):(74%)(表4)。没有观察到显著差异的品种除了TMS60444之间只有67%的岩屑发芽。
叶症状严重程度评分
意味着最大叶症状严重程度得分3.8记录CBSV——(MZ: Nam1-1:07)和最低分数的平均值是1.9 CBSUV - (UG: Kab4-3:07)(表5,图2)。症状严重程度得分为每个品种多样。当多个方差分析进行比较,相当高的差异()观察virus-variety交互症状评分(数据未显示)。
(一)
(b)
相对病毒浓度
在一个连续稀释的病毒cDNA从10−1到10−5折叠、病毒检测在10−5仅从CBSV稀释- [MZ: Nam1-1:07]和CBSV (TZ: Nal3-1:07)隔离。剩下的四个隔离病毒没有检测到10−3或更大的稀释。
根的症状
典型的坏死和感染的块茎的干腐记录所有virus-variety组合除了Kiroba感染CBSUV——(UG: Kab4-03:07),不产生根症状(图2)。
3.2。摘要对木薯症状表型
摘要症状变量,但两个知名的模式出现,相关的病毒种类。
CBSUV症状模式
初期症状的植物感染CBSUV隔离出现微弱的黄色斑点在影响后来发展成明亮的黄色叶子一片片偶尔通常不规则的圆形。黄色的斑块被生动地定义尤其是易感品种(如艾伯特,图2)。与静脉和相关的症状并不总是不是均匀分布在整个传单离开叶的某些部分不受影响。随着症状的发展进一步,大部分症状叶变成了亮黄色,一些地区仍然是绿色的。
CBSV症状模式
初期症状的植物感染CBSV隔离出现微弱的黄色条纹通常沿着三级静脉后来发展成严重的萎黄病和羽毛黄一直延伸到二级和主脉。泛黄的静脉是偶数,分散均匀的影响叶与CBSUV,症状没有发展成同心明亮的黄色斑块(图2)。坏死斑点完全传感的叶子也被认为出现黄色的落叶。
3.3。摘要症状严重性草本主机上
所有六个摘要隔离感染曼佗罗,烟草benthamiana: clevelandii,n .需:烟草nn:烟草神经网络,和n .黄花不同的感染(表2)。所有的植物n clevelandii感染了每个隔离。大多数但并非所有的植物n .烟草神经网络,n .烟草神经网络,n .黄花也感染了每一个孤立。时间第一症状表达这些主机为每个孤立,它依赖于不同植物物种感染。在隔离,CBSV——(MZ: Nam1-1:07)产生症状在一周内所有主机的接种,这是紧随其后的是CBSV——(TZ: Nal3-1:07)。症状表现范围从星期1 - 4为其余五隔离(数据没有显示)。植物物种,n clevelandii最易感,出现症状在周1到3之间的所有植物。
草本植物多样尤其在症状严重程度n clevelandii和n benthamiana。植物感染CBSV - (TZ Nal3-1:07):和CBSV (MZ Nam1-1:07):被发展严重阻碍和随后枯萎叶坏死(图2 (b))。大多数这些植物通常病毒接种后4周内死亡。植物感染其余隔离开发萎黄病的各种模式,静脉清算,叶畸形和发育不良,但不是坏死或死亡。其他主机出现症状也不同,但总体上包括叶片萎黄病,马赛克,斑点状阴影。局部病变被认为n .烟草神经网络、萎黄病/马赛克模式n .烟草神经网络和静脉空地n benthamiana所有的隔离。
3.4。CBSVs检测和病毒的多样性
所有六个摘要隔离使用小说引物被rt - pcr检测。CBSV和CBSUV杰出使用特异性引物;CBSVF2 & CBSVR7和CBSVF2 CBSUVR8,特别是放大CBSV(345个基点)和CBSUV(440个基点),分别为(图3)。没有获得放大RNA提取病毒脱毒植物(健康)。PCR产物测序,确认各自的引物的特异性病毒(数据如图所示)。CBSVs被发现在所有五个坦桑尼亚桑给巴尔样本和两个(Mwatundo和Mwajambo)肯尼亚样本。放大产品包含~ 1600核苷酸序列测序。克隆与大多数样本产生独特的共识序列,和那些有一个以上的单一序列如表所示1(例如,从基利菲得到了三个不同的序列,和两个分别来自Shirazi和Kikonde)。
推导出氨基酸(aa)序列完整的CBSV CP和CBSUV隔离包括378年和367年的基地,分别。这些被用来估计遗传关系一起CBSV的参考序列,CBSUV,黄瓜静脉泛黄病毒(CVYV),南瓜静脉泛黄病毒(SqVYV),甘薯轻微斑点病毒(SPMMV)。最吝啬的分析分组CP aa序列分为两个主要的集群:CBSV和CBSUV(图4)。在field-collected样本,所有肯尼亚序列属于CBSUV组和桑给巴尔和CBSV序列分组。每组内成员与平均守恒的aa CBSV集团的相似性为95.8%和96.6%为CBSUV组相似。两组相似,仅为80.3%。疫情隔离CBSUV - [UG Kab4-03:07):非常类似(CP aa相似性96.9%到99.2%),前面描述的隔离来自乌干达,肯尼亚和马拉维。
4所示。讨论
直到最近,研究摘要多样性/严重程度在很大程度上仅限于观察领域在木薯植物不同的年龄、基因组成,生长在不同农业生态的区域和不同的环境条件和可能感染不同的病毒株,所有这些可以单独或结合影响症状的发展。这使得不同的研究之间的野外观察的比较特别困难的问题是否严重形式的摘要与最新的流行在乌干达一直悬而未决。接种草本宿主植物的各种症状多样性研究人员提供一些统一的条件(29日),但直到最近没有这样的比较用隔离从沿海和内陆疫区流行涉及两个不同种类的CBSVs [15,16]。这是特别困难的结论是否严重的摘要症状观察领域的沿海莫桑比克和坦桑尼亚9),例如,或相对温和的叶症状在乌干达(严重程度得分为2.0分,5])是由于病毒隔离或宽容/易感性的影响木薯品种的种植在这些地区。为了回答这些问题,进行了控制实验环境条件在一个温室使用标准范围的摘要隔离地方病和流行病地区确定分离株的毒力。这是特别相关的理解如果新爆发的摘要在高海拔地区在乌干达和坦桑尼亚区湖地区是由于严重的流行病毒的形式,过程中所观察到的类似CMD流行在乌干达在1990年代早期。
为了研究这个问题,一些参数被用来评估严重性级别之间的一个流行和五个流行摘要隔离包括叶和根的症状五木薯品种感染,病毒对发芽的影响木薯干岩屑,贪污的速度传播,病毒在受感染的叶子滴定度以及症状严重程度对草本植物。在隔离审查,流行隔离CBSV - [MZ: Nam1-1:07]和CBSV (TZ Nal3-1:07):生产最严重的症状与症状严重程度得分3.7 - -3.8分(满分为(9]。相比之下,疫情CBSUV - [UG Kab4-3:07):孤立产生的症状相对较轻,意味着叶严重程度得分为1.9分。这些差异进一步证实在检验的根症状CBSV - [MZ: Nam1-1:07]和CBSV (TZ: Nal3-1:07)感染导致根坏死在所有5个木薯品种多样Kiroba测试包括宽容,然而,这不是CBSUV - [UG: Kab4-3:07](图2)。CBSVs也可以估计的严重程度的能力影响感染的年轻成长味蕾木薯植物(2,30.]。使用这些早期的观察作为线索,疫情的严重程度的差异和特有的隔离是进一步证明当一个更高的岩屑没有发芽的严重流行隔离而温和的流行隔离。22和26%的岩屑之间没有发芽,当感染CBSV - [MZ: Nam1-1:07]或CBSV (TZ Nal3-1:07):只有4%的岩屑是同样受感染CBSUV——(UG: Kab4-3:07)(表4)。这些观察结果进一步支持较高的病毒传播通过嫁接的流行严重的隔离,可能是由于高病毒滴定度(大约1000倍病毒滴定度两个严重流行隔离CBSV - [MZ: Nam1-1:07]或CBSV (TZ Nal3-1:07):相比流行隔离CBSUV - [UG: Kab4-3:07])。观察到一个显著的区别,早期的研究,然而,木薯品种阿尔伯特的感染本研究的所有隔离。在冬天graft-inoculation实验,et al。16摘要]未能感染阿尔伯特的隔离来自肯尼亚,乌干达和马拉维。虽然无法解释这两个类似的研究之间的差异在这个阶段,这些结果却有很大的影响发展疾病管理策略因为艾伯特曾被认为是对摘要在肯尼亚,乌干达和马拉维已被证明是容易受到影响。在坦桑尼亚南部,艾伯特的增长很大程度上放弃了由于其对疾病的敏感性(r . j .山丘,未发表)。
不同的症状也观察到感染草本主机上。相比之前报道n benthamiana(15,16),n clevelandii特别是非常容易CBSV和CBSUV在我们的条件,这可能是一个优秀的微分主机分离严重和轻微的隔离。在n clevelandii,严重隔离CBSV - [MZ: Nam1-1:07]和CBSV (TZ Nal3-1:07):早期症状产生,造成了严重阻碍受感染的植物,叶坏死,通常植物死亡。剩下的隔离包括CBSUV——(UG Kab4-3:07):造成各种形式的叶片萎黄病,症状不严重,不致命的(图2)。相关症状多样性观察到摘要分离株的遗传多样性,完整的CP aa 24隔离比较序列与参考序列基因库中可用的数据库。类似于以前的研究获得的结果(15,16,23),我们的病毒隔离分成两个集群基于两种描述:CBSV和CBSUV(图4)。基于aa序列的身份,乌干达流行隔离从肯尼亚和马拉维非常类似,这表明CBSUV——(UG Kab4-3:07):可能是这些国家形成一个或两个。
放在一起,这些集体观察症状多样性以及遗传差异没有说明该协会在乌干达的严重形式的摘要。这些结果确实符合研究的另一个流行隔离(但)从乌干达16),特别是同意野外观察的最大平均发病的严重程度记录摘要在乌干达只有2.0 (5]。在缺乏一个特别致命的病毒在乌干达,我们的结果,然而,引发严重问题的因素负责目前疫情摘要东部非洲国家。可能的解释是存在异常高的粉虱种群向量(烟粉虱)木薯,负责病毒的快速传播。最近普遍引入CMD-resistant品种,尤其容易受到摘要或两者的结合可能是疾病暴发的一个因素。在乌干达的确证实了这些可能性最近的调查,70%以上的木薯种植在23个地区是CMD-resistant改良品种,都是容易摘要。这些品种也支持高粉虱数,超过200名成年人每五大叶子。尽管这样的精英木薯尚未引入大量湖泊区坦桑尼亚当地土地的高敏感性生长在这个地区的种族,突然异常高的发展对木薯粉虱种群有确保摘要[的传播6,7]。识别的严重形式的CBSVs摘要流行地区尤为令人担忧,因为这些隔离的传播领域的高粉虱种群数量更大可能造成更严重的破坏木薯生产未遇到。我们的研究结果强调需要摘要实施严格的检疫措施防止进一步传播的国家之间的边界,也确定了需要发展与广泛的木薯品种抵抗病毒。
确认
即穆罕默德和m . m . Abarshi科吉州的政府资助,尼日利亚进行这项研究。作者感谢教授迈克打他的评论在纸上,和哈吉萨利赫先生协助收集桑给巴尔的木薯样本。