文摘
尝试开发溶瘤细胞的病毒主要基于合理的设计。然而,这种方法已经会见了有限的成功。另一种方法使用定向进化作为一种生产高度选择性和强有力的抗癌病毒。在这种方法中,不同病毒生长的情况下,最大化多样性条件下然后通过旨在模仿那些在人类癌症中遇到微环境。病毒进化选择压力下茁壮成长是孤立和测试来识别那些增加力量(即。,复制和传播的能力)和/或增加(即治疗窗口。,differentiated replication and spread on tumor versus normal cells), both of which have potential value but the latter of which defines an oncolytic virus. Using ColoAd1, an oncolytic virus derived by this approach as a prototype, we highlight the benefits of directed evolution, discuss methods to “arm” these novel viruses, and introduce techniques for their genetic modulation and control.
1。介绍
随着我们了解癌症的增加,这种疾病的复杂性往往涉及多个突变,重叠的信号通路,适应能力和对各种疗法产生抗药性变得更加明显1- - - - - -3]。这样一个复杂的疾病需要同样复杂的疗法溶瘤病毒(4]。根据定义,这些病毒感染和选择性地在肿瘤细胞复制导致最终的细胞溶菌作用。这个复制和细胞溶解是根除目标肿瘤细胞而放大tumor-dependent的方式治疗,同时保留邻近正常细胞。不幸的是,溶瘤病毒代理的承诺,选择性地找到并杀死肿瘤细胞尚未完全实现(5- - - - - -8]。这个事实可能部分是由于一些偏见被研究者在他们追求溶瘤细胞的病毒。例如,大多数的溶瘤病毒目前研究基于Ad5为主,因为Ad5广泛的特点和方法对其基因操作,使其成为实用的大多数研究的起点。然而,没有明确的理由为什么会Ad5优越的溶瘤病毒与其他血清型的广告或其他病毒类。此外,今天的病毒的基因操纵为了提高选择性和或效力可能误导由于我们知识有限的根本原因和性质的癌症。因此,肿瘤的可塑性和复杂性可能阻碍的理性设计溶瘤病毒(9]。
为了规避这些问题,研究人员开始探索使用定向进化作为一种利用自然选择和获得理想的属性,而不用关心负责这些属性的机制(s) (10- - - - - -12]。定向进化在病毒学领域并不是一个陌生的概念,利用作为一种调节病毒载体,提高基因传递。这些实验主要侧重于加强传染性或调制取向改变病毒外套(13,14]。溶瘤细胞的病毒,目标显然是不同的,即驱动病毒进化环境最优扩散的肿瘤。通常情况下,病毒感染正常细胞。对腺病毒,这是通过口服或鼻路线的入口和涉及上皮衬里的鼻子,喉咙,和/或肠道导致呼吸道和/或胃肠道感染(图1(一))。癌症治疗,目的是开发选择性的病毒感染截然不同的一组细胞,即改变了上皮细胞和肿瘤相关的内皮位于不同的位置在整个身体,其中大部分在典型的腺病毒感染中不常出现。研究人员因此问溶瘤病毒有效,有选择地杀死细胞,他们通常不会被暴露(图1 (b))。必要的生物改变需要达到这一目标是复杂的,但不像自然进化需要一段时间适应导致新的和可取的特征积累,定向进化可以迅速导致小说的兴起“物种”。重要的是,定向进化是依赖于两个因素这两个是完全在研究者的控制,也就是说,需要多样化开始池(1))和(2))选择压力设计来支持一个特定的结果。开始最大化多样性,研究者有无数的选择从单一突变整个病毒血清型类。此外,病毒发生重组的能力在一定条件下可以增加这个开始的多样性。同样,导演的结果(增加肿瘤扩散)是由设定的选择压力实验装置,可以调节以多种方式包括肿瘤细胞的来源和发展条件。
(一)我们有自然病毒感染正常细胞的环境中自然感染途径
(b)我们want-oncolytic病毒攻击肿瘤细胞转移的主要和相关网站
2。ColoAd1
人类腺病毒是由56个血清型,分为组g。这些血清型不同在很多方面(例如,病理学,红血球凝聚属性,用于条目)和细胞受体有助于区分和确定其组织关系。尽管人类腺病毒的多样性,绝大多数的溶瘤病毒Ad5-based离开其他血清型及其溶瘤细胞的尚未开发的潜力。探索这些替代血清型的一个方法是通过“定向进化”。在这种方法中,广告血清型,代表了不同的广告组,在通过连接池在高感染复数在人类肿瘤细胞系的代表目标指示。这个过程邀请重组和创建选择压力,产生很强的病毒变种。
当这种方法应用于结肠癌细胞系,HT29,结果是ColoAd1,第一个non-Ad5-based和第一directed-evolution-derived溶瘤病毒(10]。色谱和序列分析显示,ColoAd1 Ad11p, B组病毒,用一个近乎完整的E3区域删除,删除小E4地区和嵌合Ad3粉/ Ad11p E2B区(10,15]。体外研究显示ColoAd1 2 - 3日志更强大的比其母血清型(Ad11p和Ad3粉),标准Ad5,或临床上最先进的溶瘤细胞的广告,缟玛瑙- 015 (10,16)重要的是,这力量增加癌细胞没有转化为增加正常细胞产生效力的治疗窗3 - 4日志大于Ad5或缟玛瑙- 015。这些在体外支持的结果在活的有机体内研究在结肠癌肝播种和异种移植模型体外结肠癌患者的肿瘤组织隔离。平行研究确定CD46 Ad11p受体细胞依恋,父ColoAd1病毒(17,18]。有趣的是,免疫组织化学染色研究CD46表情结肠癌切除材料,正常肝组织和正常结肠组织透露,强烈CD46染色一直在结肠癌组织但缺失或弱在正常结肠和肝脏组织10]。这表明CD46表达可能是一个因素ColoAd1的观察肿瘤选择性。重要的是,CD46过度被描述为许多不同的癌症迹象(19,20.),支持这个溶瘤病毒的治疗价值。从理论上讲,CD46筛选肿瘤组织可以帮助医生确定哪些患者应该接受这个代理。
3所示。操纵和控制的新型病毒
溶瘤细胞的病毒可以被用来提供外源遗传物质,给他们急需的灵活性和复杂性作为癌症治疗和增加他们的潜在可行的癌症治疗(21]。工程师的能力复制病毒的基因组携带异物被称为“武装”。这种策略被用于各种各样的方式改变病毒选择性,效力,安全,实用程序(22,23]。
像当时病毒,早期的武装溶瘤病毒控制表达的外源基因通过使用外源性本构或条件的启动子。这种方法允许高水平的表达,在有条件的情况下启动子,某种程度的特异性。先进领域,研究者证明外源基因的表达可以通过使用病毒本身的内源性表达机械(24- - - - - -26]。这后一种方法被证明有一些优点,第一是它降低外源DNA的大小,可以插入到病毒基因组中。这一结果是有益的,因为病毒基因组大小限制,大大影响包装效率。第二个优势利用内源性表达的机械是取决于所使用的内源性启动子、时机和外源基因的表达水平可能是控制(24- - - - - -26]。这不仅允许高效表达外源基因,但可以作为一个额外的安全措施。因为表达的水平可以根据使用的内源性启动子进行调制,研究者和临床医生可以更好地控制武装治疗/外源基因的水平。此外,通过利用一个内生晚期启动子,可以限制表达的基因在病毒周期末,据推测,永远无法达到一种溶瘤病毒的非许可的细胞(正常细胞),因此,限制言论只针对癌细胞。重要的是,一个武装治疗病毒可以表达多个基因(27),可能会增加病毒的治疗效益和/或使治疗医生有机会追踪病毒的位置(例如,通过成像(28])和生存能力(例如,通过一个蛋白质的表达,可以发现在治疗病人的血液或分泌),来更好地理解当额外的治疗是必要的。
武装传统上是由操纵病毒基因组特征,通常要求一个系统。定向进化所带来的新型病毒会使理性插入治疗半个极具挑战性,尤其是当一个人认为他们不会想这些病毒的复制功能产生负面影响的临床效益至关重要。显然,创新方法将需要采取为了操纵病毒以这种方式导出,以确保这不会发生。采取这样的方法使用一个transposon-based方法“扫描”病毒基因组插入网站兼容的病毒生命周期(29日]。这种方法可以手臂这些小说从外国病毒与外源基因表达启动子或包含拼接受体的内源性启动子(30.]。虽然这种方法,像许多溶瘤细胞的领域的发展,最初是在开发的腺病毒,它可以扩展到任意数量的病毒物种的基因组可以克隆质粒。
考虑到可能获得有效的新型病毒的定向进化的方法,牢记安全是非常重要的。如果这些新的病毒提前治疗,控制自己的复制能力的病人治疗是至关重要的。为此,两种方法与ColoAd1拍摄。首先是研究影响ColoAd1两个临床抗病毒药物批准,ribovirin(单体饭店和cidofovir (CDV),第二个是基因引入药物敏感性的病毒将HSV TK基因插入到基因组ColoAd1使用转座子方法(31日]。
虽然并没有批准anti-Ad治疗,各类单体和CDV实验被用来治疗Adenoviral感染(32- - - - - -34]。从这些研究中,各类单体被发现有效的C组广告但不所以B组广告35,36]。毫不奇怪,ColoAd1,源自2 B组病毒是耐火材料各类单体治疗。CDV已被证明有更好的Anti-Ad活动比各类单体和用于治疗ColoAd1时有效地抑制病毒复制和传播肿瘤和正常细胞线。有趣的是,ColoAd1 CDV治疗更敏感比2亲代菌株,Ad11p或Ad3粉建议增加CDV灵敏度是一个定向进化过程的结果,而不是简单地一种遗传特征(31日]。批准了抗病毒药物的使用另一种方法是HSV TK基因插入病毒基因组创建敏感性批准药物更昔洛韦(GCV) [37]。这种方法,由转座子的方法武装成功地抑制ColoAd1感染肿瘤和正常细胞(29日,31日]。潜在的使用TK表达式来追踪病毒也使得这种方法吸引(38]。从这些研究,证明ColoAd1可以通过外部干预控制。
价值来源于ColoAd1超越一个有前途的治疗经验,因为它验证溶瘤病毒的新方法。定向进化方法导致ColoAd1可以应用到其他类型的癌症和其他病毒的家庭。利用这种方法,研究人员也不再局限于系统特点。此外,减轻病毒的分子操纵不需要进行的决定性因素。尽管腺病毒已经覆盖在这篇文章中,这种方法可修正的所有病毒的家庭和打开的可能性,利用固有的和小说从众多的人类病毒溶瘤细胞的属性。与更故意设计方法不同,定向进化利用肿瘤的复杂性,可以指向一个结果,主要取决于研究者的选择压力。类似Ad5-based溶瘤细胞的病毒,可以手臂这些小说病毒而不干扰其生命周期,从而释放潜在的调节特性或效用。因为这些病毒可能是高度有效的开发方法来控制他们的复制应该优先考虑。