未能XMRV-Specific抗体检测在慢性疲劳综合症患者的血浆使用高度敏感的化学发光免疫测定

文摘

2009年,Lombardi等人报道了他们惊人的发现全称异嗜性小鼠白血病病毒相关gammaretrovirus逆转录病毒(XMRV)存在于血液样本的67%的病人患有慢性疲劳综合症(CFS),而只有3.7%的健康个体的样本。然而,我们和其他人无法证实这些结果,使用嵌套PCR分析。另一种高度敏感,但contamination-prone,技术是测量XMRV病毒血清学反应。因此,我们测试了血浆样本群CFS患者和健康对照组XMRV-specific抗体的存在。使用两个新的化学发光免疫测定(CMIAs),我们表明,我们的样品都没有任何XMRV-reactive抗体。结合我们之前的调查结果,我们得出这样的结论:XMRV不存在任何人类个体的考验我们,无论慢性疲劳综合症或健康控制。

1。介绍

2006年,Urisman等人发现了一个新的gammaretrovirus前列腺癌样本窝藏被称为病毒防御的突变基因RNASEL(1]。全称异嗜性小鼠白血病病毒相关这种新病毒,逆转录病毒(XMRV),被发现是一个近亲已知小鼠白血病病毒(mlv),是第一个记录例人感染嗜异性逆转录病毒。尽管XMRV最初与变异的变异有关RNASEL基因,进一步的研究无法证实这种联系但确实发现在大约10%的前列腺癌2]。

新病毒能够感染人类的发现铅Lombardi et al。3)检测病毒的病人患有慢性疲劳综合症(CFS)。慢性疲劳综合症是一种病因不明的疾病,表现为神经、免疫、内分泌系统的失常。广泛的病毒进行了调查在过去作为CFS的病原体;然而,结果喜忧参半,没有一种病毒导致CFS的确凿证据牵连(4]。使用嵌套式聚合酶链反应(PCR), Lombardi等人发现,血液样本68 101 (67%)CFS患者含有XMRV病毒呕吐序列,而不是只有8 212名(3.7%)健康人样本(3]。发现的病毒与慢性疲劳综合症重燃激情,导致世界各地的许多实验室测试这种新病毒,但短暂的兴奋。尽管一些支持链接XMRV或mlv和CFS已经发表3,5,6),报告已经盖过了它未能检测到病毒在慢性疲劳综合症患者(7- - - - - -20.),包括美国的一项研究。

在我们最初的论文(17),我们未能找到一个CFS患者和XMRV之间的联系,利用PCR技术。然而,我们确实发现了一些XMRV病毒序列以及其他MLV序列在我们的一些样品。由于XMRV和mlv之间的密切关系,这是目前整个老鼠基因组,我们测试我们所有的老鼠的DNA样本使用TaqMan qPCR测定小鼠线粒体细胞色素氧化酶,cox2(14),以及单一PCR试验高度丰富的脑池内的a类型粒子(IAP)长末端重复序列,由我们组(17]。我们发现每个样本中含有XMRV或MLV序列也是阳性小鼠DNA污染。虽然我们没有声称,我们的研究结果提供了一个完整的解释XMRV的起源,我们提出了一个发人警醒的故事关于老鼠的DNA污染的风险在各种常见实验室试剂。

我们研究的批评之一(17)是我们只有用PCR技术检测XMRV的存在,而原始论文还包括血清学分析(3]。具体地说,一些组织已经开发出小说血清学测试利用西方的屁股和elisa在寻找anti-XMRV抗体,因为抗体的存在不能是由于老鼠的DNA污染(3,8,13,14,20.,21]。最近,两个原型格式直接化学发光免疫测定(CMIAs)开发检测XMRV-specific抗体(22]。两个CMIAs利用直接测定格式重组p15E或gp70蛋白质作为捕获和检测抗原。化验证明优秀的敏感性,早期检测血清转化出血在XMRV-infected恒河猴22]。此外,这些分析也显示检测特定抗体mlv [22]。在这项研究中,我们使用这两个敏感CMIAs屏幕等离子体样品从我们蒙蔽军团XMRV-specific抗体的存在。没有样品从我们的群超过100 CFS患者积极的在这些化验,而两个样品从健康控制队列的阳性CMIA化验;然而,这些样本的反应不是经免疫印迹。因此,这些高度敏感的血清学研究证实了我们之前的结论,积极的XMRV病毒PCR结果老鼠的DNA污染的结果,因为没有抗体XMRV病毒。

2。材料和方法

2.1。样品收集

所有样本收集据塔夫茨大学的制度准则,在收到知情同意。36健康个体(15雌性和雄性21日)被Huber实验室招募在自愿的基础上,在18岁至65岁之间。112年慢性疲劳综合症患者(90女性,男性,3未知),被苏珊•莱文博士在18到65岁之间,居住在美国的东北部。所有患者被诊断为慢性疲劳综合症根据CDC标准,还有很大一部分是完全禁用。组由一个组合的突然和别人逐渐出现症状。

2.2。人类血液和血浆样品的制备

大约30毫升的血液被卷入三肝素化管(Becton Dickinson)并立即运送过夜(CFS患者)或加工(健康对照组)。血液采集管从每个合并成一个50毫升管和PBS稀释,包含氯化钙和MgCl2(σ)1:1的比例。15毫升的聚蔗糖(通用电气医疗集团)被添加到两个新的50毫升管,和25毫升的稀释血液轻轻分层聚蔗糖的顶部,紧随其后的是一个30分钟离心Sorvall RT7 +转子在室温下在2000 rpm。收集PBMCs从旋转后的接口,用于DNA隔离。10毫升血浆也从每个样本收集和储存在−80°C。一毫升的等离子体被送到阿伯特实验室在干冰在一夜之间进行进一步的测试。

2.3。XMRV化学发光免疫测定(CMIAs)

一个详细的过程可以看到22]。简单地说,100年μL整洁的等离子体的抗体筛查XMRV gp70和p15E蛋白质使用两个原型师化学发光免疫测定(CMIAs;雅培诊断,艾伯特公园,生病)。CMIAs利用直接测定格式中大肠杆菌表达了XMRV p15E或mammalian-expressed XMRV gp70被用作捕获和检测抗原。分析积极控制来自XMRV-infected猕猴等离子体在1:1000 (PC1)或1:4000 (PC2)。正常的人类的等离子体作为负控制(NC)和样品稀释剂。截止(CO)的建筑师CMIAs值根据以下公式:计算有限公司= 0.45×(校准器1的意思是相对光单位(RLU))为p15E CMIA和= 0.078×(校准器2意味着RLU) gp70 CMIA。化验结果报告为样本RLU截止RLU的比值(S / CO)为每一个标本。标本和S / CO值< 1.00被认为是不反应的;标本和S / CO值≥1.00被认为是最初的反应。的S / CO值数控,PC1, PC2分别为0.16,12.8,和3.5 gp70 CMIA和0.13,7.4和2.2的p15E CMIA。最初反应性标本在重复测试架构师p15E或gp70 CMIAs。多次反应性标本进行分析1:100稀释通过临床实验的免疫印迹分析使用纯化XMRV病毒溶菌产物以及gp70重组蛋白质。

2.4。免疫印迹分析

免疫印迹(WB)分析使用纯化XMRV病毒溶菌产物以及gp70重组蛋白进行描述(22]。简单地说,病毒溶菌产物(80μg /凝胶(20)或gp70重组蛋白质μg /凝胶)通过电泳分离4 - 12% NuPAGE Bis-Tris进行凝胶(表达载体,加州卡尔斯巴德)的十二烷基硫酸钠(SDS)。乐队的蛋白质在凝胶electrophoretically转移到聚乙二烯二氟化物(PVDF)膜(表达载体)。阻塞后,PVDF膜切成2毫米。条是孵化与人类样本稀释1:100或XMRV-infected猕猴血浆稀释1:200一夜之间在2 - 8°C。删除后的抗体,带与碱性磷酸酶孵化共轭山羊反人类的免疫球蛋白(南方生物技术,伯明翰,阿拉巴马州)在室温下30分钟。条洗,和显色底物的解决方案是补充道。

3所示。结果

148蒙蔽血浆样本我们最初CFS和健康控制军团XMRV-specific抗体的存在进行了分析,使用直接格式建筑师p15E和gp70 CMIAs。没有148血浆样本反应p15E CMIA(图1(a))。的两个148个样本(ID = 137、138)积极在gp70 CMIA(图1(b))。标本都是弱反应性在gp70 CMIA样本/截止(S / CO)值为7.77 (S / o (log N)有限公司= 2.05)和9.02 (S / o (log N)有限公司= 2.20),分别。虽然样本重复反应gp70 CMIA,他们不是被动的白平衡。如图2,两个样品没有可见的世行乐队使用XMRV病毒溶菌产物蛋白质(图2(一个)(图)或重组gp70蛋白质2 (b))。截断符号的样本显示,这两个gp70活性源于两个连续的血液样本集合的一个健康控制(表1)。

4所示。讨论

在我们最初的研究中,我们发现XMRV和CFS没有特定的存在之间的关系(17]。然而,检测外周血淋巴细胞的基因组DNA健康控制和CFS军团,我们做了相同的XMRV检测PCR产物呕吐序列,以及其他MLV呕吐序列。由于大量的MLV老鼠基因组DNA序列,我们发现它谨慎测试鼠标DNA污染在我们的样本。同时使用一个测试开发的瑞士人在疾病预防控制中心实验室小鼠线粒体DNA (14),以及一个测试实验室开发的棺材IAP (17),我们发现每个样本阳性XMRV病毒或其他mlv PCR产品也是阳性小鼠的DNA。尽管这些数据提供了一种解释MLV序列的检测我们的样品,他们不排除XMRV和老鼠的DNA污染的可能性可能会出现在相同的样本。澄清这个问题,我们测试我们的等离子样本XMRV-specific抗体的存在。

最近的动物研究表明,异嗜性小鼠白血病病毒相关病毒感染引起的体液免疫反应在恒河猴22]。受感染的猕猴发达XMRV-specific抗体在两周内的感染和持续超过158天。主要反应在所有三个XMRV病毒结构蛋白:信封蛋白质gp70,跨膜蛋白p15E,衣壳蛋白e [22]。灵敏度p15E和gp70 CMIAs由动物模型验证;CMIAs都能够发现p15E或gp70特定抗体早在感染后9天(22]。相比之下,我们无法发现XMRV p15E或gp70特定抗体112 CFS患者和36健康对照组。尽管2样本相同的健康控制弱反应性在gp70 CMIA,反应不是证实了重组gp70 WB。此外,样品都是不反应的p15E CMIA并没有检测到p15E由病毒溶菌产物和e抗体WB。考虑结合PCR -数据,观察到的孤立和弱gp70反应最有可能代表非特异性反应特异性以来gp70 CMIA报告为99.5% (22]。总的说来,血清学的这一研究获得的数据表明缺乏XMRV病毒感染在慢性疲劳综合症患者和健康对照组。理论上,XMRV病毒复制在非常低的水平在人类和未能诱导体液免疫反应,或者,或者,这是隔离或潜在的和特定的抗体滴度下降到检测不到的水平。虽然这些可能性不能被正式排除在外,他们似乎不太可能观察到其他人类逆转录病毒的反应。消极的结合分子和血清学的数据不支持一个CFS和XMRV病毒或其他mlv之间的联系。此外,最近的示威,XMRV是重组两种小鼠mlv(23)提出了质疑的有效性(24)最初的XMRV声称在CFS (3)。

5。结论

与血清学数据添加到原来的发现,我们可以明确得出XMRV不存在在我们的CFS患者或健康控制群体样本。虽然我们发现XMRV病毒呕吐序列的三个样品,他们都阳性鼠标DNA和XMRV-specific抗体检测呈阴性。实验室老鼠菌株,以及野生老鼠,所有携带大量的内生mlv,就必须采取极端谨慎当murine-related病毒进行检测。

引用

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