文摘

一些自然intergenotypic丙型肝炎病毒(HCV)重组的特征,只有RF1_2k / 1 b展示了广泛传播。长度几乎饱和的基因组序列两例2 k / 1 b重组(CYHCV037和CYHCV093)采样在塞浦路斯是使用毒株特异性rt - pcr扩增和测序获得的协议。序列分析证实了他们的相似性与原RF1_2k / 1 b株来自圣彼得堡,N687。这两个明显隔离导致可用的序列数据在这个重组并确认其日益增长的来自东欧的个体之间的传播,及其与传播协会通过静脉注射毒品。序列的系统发育分析揭示集群重组点3′,5′的拓扑序列未见的,这意味着一个更复杂的进化历史比迄今为止。丙肝病毒重组株的增加情况下强调他们的贡献的要求标准化丙肝病毒分类和命名规则,分子流行病学,诊断和治疗。

1。介绍

丙型肝炎病毒(HCV)是一个单链RNA病毒,积极意义的黄家庭,展品实质性的全球序列多样性(1,2]。丙肝病毒基因组的异质性导致提出的6个基因型的共识(1 - 6)和许多密切相关亚型(a, b, c,)[3]。直到2001年,丙肝病毒被认为发展克隆的方式,通过积累与多样性产生突变。然而,一些事件的国际米兰,intragenotypic同源重组已报告到目前为止从世界的各个部分4- - - - - -12]。大多数的这些菌株似乎是孤立的事件和似乎没有受感染人群的传播。一个2 k / 1 b重组被发现在圣彼得堡,俄罗斯(7),出现了通过同源重组在负链合成通过模板切换(13,似乎是在俄罗斯循环在静脉注射毒品使用者。分离的菌株,贴上RF1_2k / 1 b,还发现了在爱尔兰,爱沙尼亚,乌兹别克斯坦,西伯利亚西部,法国14- - - - - -18]。

在最近的一项研究中丙肝病毒株在塞浦路斯,传播两个假定的重组隔离被发现在HCV感染人群中(19),观察不调和的分类两个截然不同的地区之间的基因组。因此,在这项研究中,使用毒株特异性“准这些菌株的基因组已经测序”的协议,他们已经证实的变体RF1_2k / 1 b,证实这种病毒的广泛传播,并提供更多的序列数据,揭示复杂的进化历史。

2。结果

2.1。rt - pcr和测序

特效病毒基因组扩增和测序协议几乎饱和那样被设计并成功应用于两种接受调查。由于基因变异之间的两个隔离,并不是所有的PCR和测序引物适用于,导致两个略设计(CYHCV037见图1和图2为在网上补充材料CYHCV093 doi: 10.1155 / 2011/710438)。所有生成的序列数据很清楚,这意味着没有样品混合感染的问题。

2.2。描述的重组菌株

在丙肝病毒感染的分子流行病学的研究一般人群的塞浦路斯,两个样本被发现亚型2 k Core-E1地区和1 b NS5B地区19]。样本取自格鲁吉亚两雄(实验室规范CYHCV037和CYHCV093), 32岁和39年的抽样。传播的既定路线是不安全的性实践和静脉注射毒品。

几乎饱和长度序列(nt。87 - 9287年,根据H77职位,加入基因库。NC_004102)成功来源于两个样本5 - 6重叠PCR碎片。特征序列,比较他们分类参考菌株,并研究了事件的复合序列的长度,SimPlot, Bootscan,进行了系统发育分析。Simplot图最初建立在基因层面上使用共识序列来自引用,亲本基因型测定后,在子类型的父母的基因型(图1)。这清楚地表明,这里描述的菌株更类似于基因型2,特别是2 k,基因组5′端,更类似于基因型1,特别是1 b基因3′端,与重组NS2地区,3000年位置后(根据应变H77位置)。Bootscan情节为每个序列构造使用参考序列的亲本基因型1 b和2 k以及可用的只有两个参考序列2 k / 1 b, N687(加入基因库AY587845)和M21(加入基因库FJ821465)(图2)。结果证实菌株CYHCV037 CYHCV093 2 k / 1 b重组菌株,用复合指向同一个基因组位置参考2 k / 1 b隔离。核苷酸和推导的氨基酸序列的两个菌株发现在塞浦路斯是根据原始的俄罗斯N687应变,没有插入或删除。目视检查的核苷酸和氨基酸的分析比对NS2地区横跨所述交叉点显示高度的相似性所有重组菌株在本研究报告和之前报道的(数据没有显示)。这里的两个菌株是相同的俄罗斯N687隔离部分的5′非编码区域。interferon-sensitivity-determining地区(ISDR) NS5A序列、氨基酸序列的两个菌株在这项研究是相同的的N687隔离,因此相同的“野生型”亚型1 b与干扰素电阻(13,20.]。

随后,系统发育树构建区域两侧的重组(图3)。额外的序列来自HCVBLAST密切相关搜索中使用了分析和Acc。不。AY070214和AY070215 2 k / 1 b菌株,用于基因组5′地区的树,和EU155337 EU155333, 1 b,用于树的3′段。这里所描述的两个菌株的部分地区组内2 k和1 b亚型,分别引导价值100。一起2 k / 1 b重组集群在两种树木,亚型组内,引导支持> 98。1 b树(图3 (b))提出了分组CYHCV093与应变N687 CYHCV037应变M21、引导支持的63年和100年,分别,而拓扑的2 k / 1 b 2 k亚型(图中的集群3(一个))不存在任何有统计学意义的子组(引导支持值< 55)。

2.3。加入核苷酸序列号码

基因库加入数字几乎饱和的基因组核苷酸序列这一研究获得的是应变HQ537005 CYHCV037 CYHCV093和HQ537006压力。

3所示。讨论

自然2 k / 1 b重组,RF1_2k / 1 b,于2002年首次发现在圣彼得堡,俄罗斯在五静脉注射毒品使用者(7),其中一个后来测序以及完整的开放阅读框(孤立N687, acc。不。AY587845) [13]。从那时起,其他几个RF1感染已确定个人从国家的东欧和前苏联成员(14- - - - - -16,18]。最近发现隔离(Acc M21。不。FJ821465) [17)和原N687应变是唯一,沿着完整基因组测序。

调查样本的部分序列的hcv感染人口塞浦路斯有两个假定的证据2 k / 1 b重组隔离。详细描述了这些样本几乎饱和基因组测序和分析,通过设计毒株特异性RT嵌套PCR和测序协议。所有生成的序列数据很清楚,这意味着紧张的问题是重组,而不是纯粹的亚型2 k和1 b混合感染的。Simplot和Bootscan分析的结果证实隔离CYHCV037 CYHCV093基因紧密变体RF1_2k / 1 b的重组菌株,交叉点的相同的基因的位置参考N687和M21菌株。

患者的流行病学特征的菌株是派生的类似于个人的特点携带RF1_2k / 1 b菌株发现迄今为止。这些证明和证实这一趋势指向年轻人来自前苏联和东欧国家,和注射毒品的主要风险的行为。因此,RF1_2k / 1 b似乎是流传在小数量比其他任何丙肝病毒重组,一些病例的感染已经被报道。这些菌株在塞浦路斯的发现强调了增加这种类型在不同的欧洲地区的传播。

只有两个RF1_2k / 1 b基因组序列已经提交给基因库日期(13,17),这里描述的序列几乎两倍公开全面这一毒株基因组序列信息。所以很难做出结论关于这一毒株的分子进化,但几乎饱和的两个基因组,假设现在可以开始制定。在进行系统发育分析,重组组织紧密形成不同的父母亚型组内subclusters,展示低之间的分歧,一个进化分离从纯粹的亚型,与之前的研究相一致(15]。然而,RF1还演示了统计学意义biphyletic分离的分离。这是1 b的观察序列的3′端重组,而不是2 k序列在基因组5′的一面。重要的是要注意,并非所有的2 k / 1 b株发现已经完全测序和序列数据的分析不同地区是不一样的,有限的。只有在分析复合序列5′的网站有更多可用菌株比那些一直沿着全基因组测序。从数据可用,因此,观察到不同地区之间的集群行为的复合点之间可以表明原始复合事件发生密切相关的2 k准物种和基因多样性1 b物种主机,现在或许是由于多个点通过不安全的注射毒品感染,或由于1 b准物种多样性,提供一系列的重组事件,传播的两个代表菌株被测序。因此,这两个菌株在塞浦路斯发现不仅提供更多的序列信息2 k / 1 b重组菌株也提供不同的视图的进化历史应变比迄今举行。几乎与增加更多的全面的基因组在这个重组类型,更准确的进化这一毒株的照片会变得更加明显。

两个丙肝病毒的变体的偶然识别RF1_2k / 1 b在塞浦路斯是分子调查的结果几乎饱和的基因组。这项研究的结果强调认为这个丙肝病毒类型的实际患病率一直被低估,其分子进化的假说可能是更复杂的比一个复合点形成一个共同的进化祖先。流行病学、丙肝病毒重组RF1_2k / 1 b似乎蔓延在欧洲和地中海地区,通过静脉注射毒品使用者的人口流动。这种重组是最普遍和广泛分布的丙肝病毒,强调需要更好地研究复合在流行病学研究中,包括在考虑标准的丙肝病毒分类和命名,并给予更多的考虑他们的诊断和临床管理。

4所示。方法

4.1。样品

丙肝病毒感染的分子流行病学研究中塞浦路斯,普通人群的差异被发现的亚型分类为两个样本两个基因组区域,被发现是亚型2 k Core-E1地区和1 b NS5B地区19]。这些菌株被认为是公认的2 k / 1 b重组,因此选择几乎饱和的基因组测序。样本取自两个同意格鲁吉亚男性患者。病人CYHCV037, 32岁2005年抽样时,曾在2003年首次诊断HCV-seropositive和陈述性传播感染的。病人CYHCV093,采样2007年,39岁的时候被诊断HCV-seropositive 2000年和静脉注射毒品的传播路线。两个人过抗病毒治疗时取样。

4.2。实验设计

协议(补充数据1和2)和嵌套引物(补充表1)RT PCR和测序片段重叠设计基于出版协议(11]。PCR引物设计亚型或毒株特异性,通过比对可用2 k / 1 b、2 k, 1 b洛斯阿拉莫斯丙肝病毒序列的序列数据库(http://hcv.lanl.gov/content/index)。内在PCR引物PCR产品被用于测序并进一步毒株特异性序列设计的引物随后被“引物行走”,使用生成的序列。与假设压力会有相同的复合点已知2 k / 1 b重组,交叉点的位置被发现3164核苷酸(根据应变H77编号)13),引物的5′端这一点设计2 k-specific和引物3′端设计成1 b-specific。同时,该地区覆盖这一点从三个不同的PCR测序一个产品,以确保该协议序列。

4.3。RNA提取,rt - pcr和基因组测序几乎饱和

从200年病毒RNA提取μL等离子体之前提取初始抽样的患者(19),使用高纯病毒RNA工具包(罗氏诊断,美瀚,德国),遵循制造商的指示。

最初,一步法rt - pcr反应是使用上标三世一步法rt - pcr系统设置铂Taq高保真(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)和外正向和反向引物(如前所述)(19]。的嵌套PCR反应,1 x铂PCR SuperMix高保真(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)是使用3μL相应的rt - PCR产品,和20 pmol每个内在的正向和反向PCR引物。PCR产品视觉效果在2%琼脂糖凝胶电泳后使用QIAquick和纯化PCR净化设备(试剂盒、希尔登,德国)。

循环测序反应进行1μL的二次PCR产品使用BigDye终结者系统v3.1(应用生物系统公司、沃灵顿、英国)与5 pmol每个测序引物(补充表1),如前所述[19]。人口直接测序是为了获得共识序列反映了每个样本的主要准物种种群。序列读取使用ABI 3130基因分析仪和通过ABI测序分析5.2软件(应用生物系统公司,促进城市、钙、美国)。结果手动看着和多态性,双色谱图的峰出现在同等强度根据标准大学基础代码注释。所有产生的序列的每个应变用于缝合在一起几乎饱和的基因组(nt 87 - 9287,根据应变H77编号)。

4.4。描述的重组菌株

Simplot和Bootscan分析生成的序列上进行想象每个孤立的序列相似性百分比沿着长度的序列和参考序列重组进行调查。几乎饱和的基因组序列与参考株代表所有HCV基因型和所有可用的亚型中相应合适的基因型在每种情况下大型v4 (21)和上传到SimPlot v3.5.1软件(http://sray.med.som.jhmi.edu/SCRoftware/)。分析还包括两个可用2 k / 1 b完整的基因组序列,N687(基因库Acc。不。AY587845)和M21(基因库Acc。不。FJ821465)。进行分析与windows 200基地进行20基地的步骤,使用木村出现距离模型,Neighbour-Joining树模型100引导程序复制。

分别进行了系统发育分析基因组区域两侧的交叉点(87 - 3150和3200 - 9287年,分别地。,numbered according to H77), in order to confirm the classification of each region in the corresponding subtypes, by including reference strains and the most closely related (>90% similarity) sequences derived from an HCVBLAST search (http://hcv.lanl.gov/content/sequence/BASIC_BLAST/basic_blast.html)。序列对齐在大型v4 (21],Neighbour-Joining树构造(如前所述19]。

视觉检查和序列比较,这里描述的毒株的核苷酸序列上传到百万v4,与隔离N687 M21、自动转换为他们翻译蛋白质序列。

4.5。参考序列

的基因库加入数字参考菌株用于上述建设系统发育树中相应的数据在结果部分。Simplot和Bootscan分析,基因库加入数字使用的参考序列如下:1。NC_004102、EF407419 AF511950;1 b。AY587016、D11355 EF032892;1 c。D14853 AY051292;2 a。AB047639、AY746460 D00944;2 b。AB030907、AF238486 D10988; 2c.D50409; 2i.DQ155561; 2k.AB031663; 2k/1b.AY587845; 2k/1b.FJ821465; 3a.X76918, AF046866, D17763; 3b.D49374; 3k.D63821; 4a.NC_009825, DQ418788; 4d.DQ418786, DQ516083; 5a.AF064490, NC_009826; 6a.DQ480513, Y12083; 6b.D84262; 6c.EF424629; 7a.EF108306.

确认

支持的工作是塞浦路斯研究促进基金会批准号埃尼集团X / 0506/34,塞浦路斯大学的基金,桦树生物医学。

补充材料