抗病毒和杀病毒的活动(N)-Cocoyl-L-Arginine乙酯

文摘

各种氨基酸acid-derived化合物,例如,Nαalkyloxyhydroxylpropylarginine -Cocoyl-L-arginine乙酯(CAE),精氨酸cocoate,和cocoyl甘氨酸盐钾(Amilite),检查他们的杀病毒的活动对单纯疱疹病毒1型和2(1型单纯疱疹病毒和HSV-2),甲型流感病毒(IAV),和1型脊髓灰质炎病毒(PV-1)相比,苯扎氯铵(1)和钠dodecylsulfate (SDS)作为阳离子和阴离子控制洗涤剂和其他商用消毒剂。虽然这些氨基酸acid-derived化合物都对1型单纯疱疹病毒和HSV-2有效,CAE和Amilite是最有效的。然而,这两个化合物对IAV有效,另一个包膜病毒,如对HSV。细胞毒性的CAE弱;细胞被杀死的为0.012%,只有5%的条件下,100%的细胞被SDS或1。除了这些直接的杀病毒的影响,CAE抑制1型单纯疱疹病毒的增长——甚至PV-1-infected细胞为0.01%。这些结果表明潜在的应用CAE作为治疗或预防医学在身体对感染HSV肤浅的表面。

1。介绍

最近有越来越需要大量的准备对抗传染病。每年我们遇到新兴传染病和重现。虽然接种疫苗是一个主要的策略来克服病毒性疾病(1],许多病毒和疫苗并不容易获得,即使可以,每个人都无法访问,因为各种原因(如成本、分配和政治)。病毒感染的另一个复合问题是抗病毒药物不能用于很多病毒性疾病(2]。在身体表面消毒,如手卫生处理,一直是一个有效的措施预防与病毒性疾病,甚至适用于某些病毒性疾病的治疗,提供其组织毒性可以容忍3]。

大量的化合物,包括有机溶剂和洗涤剂,众所周知,灭活病毒(4]。然而,大多数这些消毒剂一般有毒的细胞和组织,当接触到皮肤,特别是黏膜表面,限制他们在活的有机体内应用程序。我们发现,精氨酸水溶液不同包膜病毒灭活,虽然需要相对较高的精氨酸浓度(5- - - - - -10]。增强病毒失活的精氨酸被认为是适用于清除污染病毒在生物制药产品。抗病毒活性的精氨酸打开一个窗口为局部应用对肤浅的传染病,杀病毒的抗病毒活动可能会减少受感染的粘膜细胞的病毒载量。这里我们有进行一个系统的氨基酸衍生化合物的筛选寻找有效、无毒的抗病毒和杀病毒的药物,既可用于手卫生处理在身体表面和肤浅的感染。几个可用的测试化合物的影响失活的单纯疱疹病毒、流感病毒、脊髓灰质炎病毒和对培养细胞的毒性,而商用消毒剂。

2。材料和方法

2.1。细胞和病毒

MDCK HEp-2,维洛细胞生长在鹰的最低基本培养基(MEM)含5%胎牛血清。单纯疱疹病毒1型、株F(1型单纯疱疹病毒),单纯疱疹病毒2型,菌株186 - 2),流感病毒A /爱知/ 68 (IAV)和1型脊髓灰质炎病毒(PV-1),萨宾疫苗株,被用来在整个实验(11- - - - - -13]。病毒的传播在维洛细胞(1型单纯疱疹病毒、HSV-2和PV-1)在MEM补充0.5%胎牛血清(的边后卫)或在MEM MDCK细胞(IAV)补充0.1%牛血清白蛋白(BSA)和乙酰化胰蛋白酶(4μg / mL)。病毒是储存在−80°C到使用。每个病毒的数量来衡量一个空斑实验如前所述[11- - - - - -13]。

2.2。试剂

盐酸精氨酸(称为精氨酸),butyroyl-L-arginine (ButArg), Nα-cocoyl-L-arginine乙酯(CAE)、N - [3-alkyl (12、14) oxy-2-hydroxypropyl] -L-arginine盐酸盐(Amisafe LMA-60),精氨酸cocoate (Aminosoap AR-12),钾Nα-Cocoyl-L-glycinate (Amilite GCK-12K)、苯扎氯铵(1),钠dodecylsulfate (SDS),钠Nα-dodecanoylsarcosinate (LS)、葡萄糖酸氯已定(CHX) ethylalchol (EtOH)、聚维酮碘(π)和次氯酸钠(NaOCl)提供的生化研究等级和亲切的味之素有限公司公司(日本东京)。商标的化合物用作化妆品原料。每个溶剂的pH值调整到所需的值使用pH电极6378型和酸度计类型F-54 (Horiba;日本京都)。酸度计是手动校准每2 h在准备测试的解决方案。

2.3。测定杀病毒的活动

所有的原料都存储在冰前病毒失活实验。过量体积的解决方案是混合病毒股票这样的pH值和浓度测试解决方案不会影响:190μ收到了10 L整除的解决方案μL整除的病毒制剂(大约10⁷~ 10⁸点状(PFU)单位/毫升)。这种病毒是在指定的温度孵化准备5分钟。孵化后,测试混合物在冰水里冷却,并且立即整除的病毒样本100倍稀释与冰冷的杜尔贝科的磷酸盐(PBS)没有Ca^{2 +}和毫克^{2 +}含有0.1% BSA IAV或0.5%的边后卫其他病毒停止病毒失活。产生病毒病毒进一步稀释计数适合测量,在制备治疗和传染性病毒的数量是衡量一个空斑实验维罗(1型单纯疱疹病毒,HSV-2, PV-1)或MDCK细胞(IAV)。在PBS几乎没有病毒失活,因此在PBS传染性病毒的数量被用作控制计数(14]。

2.4。试剂对病毒的增殖的影响

单层细胞35毫米菜被病毒感染,以表示感染复数(MOI)。受感染的细胞进一步孵化37°C(1型单纯疱疹病毒、HSV-2和IAV)或35.5°C (PV-1)表示时间的无血清MEM (pH值7.4)包含0.1% BSA和指定的测试化合物的浓度。这些化合物被添加在孵化的爆发。对流感病毒的实验,乙酰化胰蛋白酶(4μg / mL)也添加到媒介的蛋白水解活性病毒传染性。在表示时间,培养基总子代病毒的收获和文化决定如前所述[11- - - - - -13]。

2.5。分析的细胞毒性

汇合的层的维洛细胞孵化在0.85%氯化钠溶液(pH值5.5)包含20毫米MES (2-Morpholinoethanesulfonic酸)和不同浓度的每个测试化合物在室温下15分钟。确定细胞死亡的区段,单层细胞使胰蛋白酶化获取单个细胞悬液。后添加含10%小牛血清的MEM悬挂中和胰蛋白酶和稳定细胞,活的还是死的细胞的数量是由台盼蓝染料排除方法如前所述[15]。

3所示。结果与讨论

3.1。氨基酸衍生化合物对DNA和RNA病毒的传染性

我们检查了精氨酸和氨基酸衍生的化合物的杀病毒的活动(即。,0.5 M arginine, 0.5 M ButArg, 0.2% CAE, 0.2% Amisafe, 0.2% Aminosoap, and 0.2% Amilite) on viruses of three completely different kinds; that is, HSV-1 and HSV-2 (Family of Herpesviridae), IAV (Family of Orthomyxoviridae), and PV-1 (Family of Picornaviridae). Both HSVs and IAV are large enveloped viruses and need the cell nucleus for the virus multiplication: the former has a double-stranded DNA genome, and the latter has a segmented negative-stranded RNA genome [16,17]。对比这两种病毒的病毒的家庭,PV-1小nonenveloped病毒携带positive-stranded RNA基因组和复制在感染细胞的胞浆18]。

图1显示了这些化合物的影响1型单纯疱疹病毒的传染性,当病毒在30°C孵化5分钟。控制,病毒在PBS孵化,计算每个化合物的相对剩余传染性的传染性病毒数量除以PBS的测试解决方案的控制。如图1这些化合物,1型单纯疱疹病毒敏感Amisafe除外;病毒的传染性减少低于或接近(10的检测水平⁻⁵的控制)。Amisafe的情况下,减少病毒的传染性略小于PBS中孵化。这些结果清楚地表明,精氨酸、氨基酸衍生化合物(Amisafe除外)可以有效地灭活1型单纯疱疹病毒,在实验条件下包膜DNA病毒,。尽管pH、离子物种或离子强度的解决方案会影响病毒失活的程度(14],我们展示了在这之前1型单纯疱疹病毒相对稳定pH值4.8和pH值的影响4.0以上就远远弱于pH值的联合效应和精氨酸或ButArg [5,6]。结果与商业消毒剂(即。,0.1% BKC, 0.2% SDS, 0.2% LS, 0.5% CHX, 70% EtOH, 0.23% PI, and 100 ppm NaOCl). These commercial disinfectants also showed strong virus inactivation on HSV-1 (Figure1),尽管π的影响可能是由于低pH值(即完全。,pH值3.5)。对洗涤剂包膜病毒,敏感,从而扰乱,在病毒囊膜溶解脂质影响。同意这个,HSV-2,不同血清型和致病性的另一个人类疱疹病毒,也显示出类似的敏感性资料这些氨基酸衍生品和消毒剂(数据没有显示)。

接下来,我们测试了这些化合物在图1反对IAV,另一种病毒的包膜病毒的家庭。如图2(白列),概要文件是完全不同于观察1型单纯疱疹病毒(HSV-2)。ButArg, CAE、Aminosoap 1 EtOH,π,NaOCl减少IAV传染性低于检测水平(10⁻⁵的控制)。精氨酸、Amisafe Amilite、SDS、LS和CHX显示不同程度的杀病毒的活动,Amisafe是更有效的,类似于它对1型单纯疱疹病毒的影响,CHX至少有效(白色列在图2)。之前,我们已经表明,pH值IAV的失活是复杂的(14),至少一部分的失活低pH值样本(精氨酸、ButArg和π)是由于pH值,但这pH值无法解释强烈的失活精氨酸和ButArg [5,6]。有趣的是,添加0.1% BSA导致抑制,至少部分,IAV的失活,CAE Amisafe, Amilite, 1、SDS和LS(黑列在图2)。这可能是因为BSA与病毒之间的相互作用,因为它并不影响病毒的传染性在PBS。最有可能由于BSA的结合脂肪酸(19),因此这些化合物极性的根。

观察到的这些化合物对IAV的影响表明,潜在的失活机制。比较精氨酸、ButArg CAE、Aminosoap 1 EtOH,π,NaOCl,显示对这种病毒强大的杀病毒的影响,表明没有独特的图案与化合物的结构。精氨酸和ButArg抑制蛋白质相互作用,可能与蛋白质交互(通过他们的能力20.- - - - - -22]。CAE、Aminosoap和1有表面活性剂的性质。EtOH是一种有机溶剂。这些化合物不仅可以与蛋白质,而且脂质膜。π和NaOCl是强氧化剂,可以与大多数组件交互的病毒颗粒。相反,似乎有一种独特的结构模式,更少的活性化合物,即Amisafe, Amilite, SDS, LS, CHX。这些都是清洁剂,这意味着detergent-like属性不足的有效病毒失活。然而,这些洗涤剂对1型单纯疱疹病毒是有效的,证明杀病毒的有效性是依赖于病毒的。相比这些包膜病毒,脊髓灰质炎病毒是由这些氨基酸衍生化合物抗失活,失活的只有微不足道的程度是观察(图3)。甚至pH值4.0和精氨酸或ButArg是不够的。缺乏敏感性PV-1可能表明1型单纯疱疹病毒(图的失活1)和IAV(图2),这些化合物需要目标的存在结构上的脂质包膜病毒。它应该值得注意,尽管这些化合物作用于脂质,它并不一定意味着增溶脂质双分子层的信封。这些实验中使用的洗涤剂的浓度(0.2%)低于临界胶束浓度(cmc)。虽然离子的cmc洗涤剂通常影响洗涤剂的pH值的解决方案,他们被认为是在~ 10毫米的范围在实验条件下(大约0.4%)。低于CMC,洗涤剂不太可能破坏膜结构的能力。

在这些化合物中,CAE和Aminosoap显示显著的杀病毒的活动。据报道,考虑到CAE一直bacteriocidal活动(23),我们进一步CAE的杀病毒的活动特点。

3.2。描述CAE的杀病毒的活动

图4显示了CAE的影响浓度的1型单纯疱疹病毒失活,HSV-2 IAV, PV-1。CAE是更多的可溶性酸性pH值,我们在这些实验使用pH值5.0。这pH值就小失活引起hsv(失活不到20%,如果有的话)和PV-1(几乎没有失活),但对IAV显著失活(50 ~ 70%失活)14]。这可能是由于HA高峰段构象改变蛋白质存在于IAV信封(17]。在浓度范围(0.001 - 0.04% CAE), PV-1显示只有一个边际损失的传染性,而IAV显示一个小,但显著(60%减少0.04% CAE),减少传染性与CAE浓度增加。相比这两个病毒1型单纯疱疹病毒和HSV-2显示传染性急剧减少,导致10⁴倍减少CAE 1型单纯疱疹病毒和10 ~ 0.02%³在0.01% CAE HSV-2倍减少。虽然病毒1型单纯疱疹病毒和HSV-2属于同一家庭,HSV-2显示显著高于1型单纯疱疹病毒在低浓度CAE失活。这CAE略杀病毒的活动,但值得注意的是,增强通过降低pH值4.0或4.5的测试解决方案;例如,1型单纯疱疹病毒失活或HSV-2 CAE只有边际在pH值为5.0 0.005%,但增强的10倍(对于1型单纯疱疹病毒)或100倍(HSV-2) 4.0 pH值在同一CAE浓度。

为了进一步描述CAE的杀病毒的影响,这是与SDS相比,一个阴离子洗涤剂,和1阳离子清洁剂,中性ph图5显示了这样一个比较对HSV-2杀病毒的活动。1和SDS显示显著影响(减少超过2 log) HSV-2传染性即使在低浓度,例如,在0.002%和0.003%,分别在CAE需要更高浓度达到类似水平的这些条件下失活。

3.3。细胞毒性的试剂

上述三种化合物然后比较了细胞毒性。如图61显示,一个强大的杀细胞的效果。当层的维洛细胞孵化等渗缓冲溶液在不同浓度的CAE的存在,1和SDS在室温下15分钟和数字的死和活细胞和台盼蓝染料排斥试验,测定1显示死细胞的数量在急剧增加,浓度在0.002%以上。所需的浓度在有效的杀病毒的效果(0.003%),1 10%以上的细胞死亡。与1相比,细胞死亡的SDS和CAE发生在2.5 -高10倍的浓度,表明其较低的细胞毒性。应该注意的是,SDS可溶性细胞的质膜细胞毒性浓度在CAE或1没有(数据未显示),导致可能低估的分数SDS-treated菜的死细胞。结果表明CAE 0.01%,大约2%的细胞被化合物(图6),而超过99%的病毒灭活(图5)。

3.4。通过CAE抑制病毒增殖

结果在图1- - - - - -5显示在体外病毒失活。相同的化合物是否能产生减少病毒增殖在活的有机体内实验然后检查治疗受感染的细胞。图7显示了CAE和1的结果相对病毒1型单纯疱疹病毒(圆)的产量或PV-1(三角形),感染病毒的细胞孵化时在中含有不同浓度的CAE(打开符号)或1(封闭的符号):注意,仍低于使用的最高浓度浓度用于病毒失活。这两种病毒的增殖比CAE更强烈抑制汉堡王。然而,他们对这两种病毒的影响是不同的。即CAE更强烈地抑制比1型单纯疱疹病毒产量PV-1,对面1。的比较结果如图6表明,这些病毒的抑制乘法CEA或汉堡王并不是由于感染细胞的死亡。这些结果表明,1和CEA抑制两种病毒的增殖广泛不同的方式复制和转录的病毒基因组(即发生。细胞核或在感染细胞的细胞质)。有趣的是要注意,1、CAE均无效甚至在灭活PV-1 0.2%和0.1,可以抑制相同的病毒在感染细胞的生长。很明显的降低病毒在感染细胞产量PV-1(也许1型单纯疱疹病毒)不仅仅是由于病毒失活。

一般来说,virus-inactivating代理(消毒剂)显示毒性细胞和组织,限制了他们的应用程序。我们进行一个系统的氨基酸衍生化合物的筛选寻找有效、无毒virus-inactivating代理和发现,对1型单纯疱疹病毒和HSV-2, CAE有显著的活动灭活细胞外的传染性病毒颗粒,抑制病毒增殖感染细胞的浓度与可容忍的细胞毒性效应。这些结果可能支持未来的潜在应用CAE的治疗或预防医学在身体对感染HSV肤浅的表面,如角膜疱疹和生殖器疱疹。

利益冲突

作者没有商业或其他关联,可能构成利益冲突。

确认

作者感谢Daisuke Ejima博士(味之素)对他的刺激讨论和味之素有限公司检测试剂的慷慨的礼物。

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