文摘
自1971年的第一识别病毒,犬冠状病毒引起的疾病(CCoV)没有被充分研究,和病毒犬肠道疾病中所扮演的角色还没有被很好地建立起来。后才出现在2002年的“非典”在人类新的关注一直专注于冠状病毒。由于RNA-positive链病毒的突变频率相对较高,CCoV已经进化,生物分子技术的发展在过去的二十年里,新的病毒株,血清型和亚型已确定感染的狗。考虑狗CCoV感染人群的普遍性质,几项研究已经开展,聚焦在这些病毒的流行病学意义,强调需要进一步调查的生物学CCoVs感染的发病的作用。本文报道的进化过程CCoVs注意到最近的诊断方法。
1。冠状病毒:基因组和结构
冠状病毒(x),一个属Coronaviridae家庭,订单Nidovirales大包围,RNA病毒,引起高度流行的疾病在人类和家畜。浸是球面包围粒子直径约100 - 120 nm封顶,腺苷单链,积极意义基因组RNA 27.6 - 31 kb的长度,最大的RNA病毒基因组。基因的5′末端由65到98元序列,称为领袖RNA,这也是目前的5′末端subgenomic mrna。一个翻译区(UTR) 200到400元的遵循这个领袖序列。3′末端的RNA基因组是200到500元的另一个UTR后跟一个保利(a)可变长度的序列。5′和3′-UTRs对RNA复制和转录很重要。剩下的基因组序列包括不同的开放阅读框(orf),明显在冠状病毒数量不同,元序列,基因秩序,并在表达式的方法。在每个基因的5′端,所有浸有共同的基因间序列的7基地对subgenomic rna(的形成至关重要1]。
第一个三分之二的基因组包含两个部分重叠的羊痘疮,ORF1a ORF1b。这些子翻译成一个多蛋白前体的病毒依赖RNA的RNA聚合酶和蛋白酶。3′末端的三分之一的基因组包含主要的结构蛋白,orf编码(S),信封(E),膜(M)和核衣壳蛋白(N)。这些羊痘疮穿插几个orf编码不同的非结构蛋白,其中大部分是未知函数(图1)。
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S糖蛋白,形成大的表面上,峰值virus-neutralizing抗体的主要诱导物,扮演着一个重要的角色在生物学和CCoV感染的发病机理,同时诱导融合病毒囊膜与宿主细胞膜和细胞间的融合。在大多数phylogroup 2 x (Betacoronavirus,见下文),180 kDa S蛋白裂解病毒成熟期间或之后的细胞蛋白酶增强细胞融合活动或病毒传染性。phylogroup 1 x的S蛋白(Alphacoronavirus,见下文)不是裂解,尽管其中一些病毒可以诱导细胞间融合(2]。小包膜蛋白E,这是9 - 12 kDa,最近被证明是与病毒相关信封,和M蛋白,需要病毒出芽[3]。第三M膜蛋白,一种糖蛋白,是在只有一个短的伴域特征暴露在病毒囊膜的表面。此域名正在后跟triple-membrane-spanning信封内域和羧基末端域(4]。虽然主要归因于S蛋白免疫作用,M蛋白的MHV抗体可以中和病毒传染性,但只有在补充的存在(5]。核衣壳蛋白N是一个基本的50 - 60 kDa磷蛋白质结合病毒RNA,提供结构基础(螺旋状核衣壳6]。N在病毒RNA合成过程中发挥作用,与M蛋白相互作用导致病毒颗粒的形成。额外的orf编码非结构蛋白在浸基因组(公认的7,8]。这样的功能未知基因在大多数情况下,大多数人都不是病毒复制所必需的,但可能在毒性和宿主范围9]。
目前,Coronaviridae家庭是bigeneric包括属冠状病毒和Torovirus。在根树木,冠状病毒属成员一致形成三个不同的单元组,在两两比较,他们形式三个健壮的不重叠的集群。这个星座系统很容易被识别,在出版物,这些三组一直被称为phylogroups 1, 2, 3。Phylogroup 1 x和包括人类冠状病毒hcov - 229 e和HCoV-NL63猫科动物冠状病毒(FCoVs) 1型和2型猪传染性胃肠炎病毒(TGEV),猪呼吸道冠状病毒(PRCoV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和犬冠状病毒(CCoVs)。最近,雪貂冠状病毒已被确定为一名phylogroup 1 (10]。Phylogroup 2的哺乳动物x是分成两个子组,bovine-like子群和类似非典子组2 b。2组包括牛冠状病毒(BCoV),鼠肝炎病毒(MHV) sialodacryoadenitis病毒(SDAV)中发现老鼠,猪血凝性脑脊髓炎病毒(PHEV),人类冠状病毒(HCoV-OC43和HCoV-HKU1),人类肠冠状病毒(hecv - 4408),和新认识的马冠状病毒(ECoV) [11)和犬呼吸道冠状病毒(CRCoV) [12]。发现后不久,冠将定义一个新的第四组(13]。然而,基于序列比较和观察的区域ORF1a冠包含领域独特的组2冠状病毒,有人建议,更直接关系到phylogroup 2。因此,冠已经放在群2 b一起类似非典浸隔绝蝙蝠和野生食肉动物(14,15]。第三个phylogroup包括两个禽冠状病毒、传染性支气管炎病毒(IBV),和土耳其冠状病毒(TCoV)。
然而,鉴于最近的新发现的冠状病毒的数量增加以及随之而来的争论和困惑在文献中关于冠状病毒分类,coronaviridae研究小组的成员(CSG)已经开发出一种框架一致的分类和建立了明确的属,species-demarcation标准。的国际米兰组两两氨基酸身份分数的真正的冠状病毒与计算结构和非结构蛋白不同属其他RNA病毒科(例如,Potyviridae,引起)[16]。拟议的分类学修订的ICTV执行委员会Coronaviridae的组织still-to-be-established亚科Coronavirinae基于扎根发展史和两两比较使用吗Coronaviridae采用保守域复制酶多蛋白(ORF1ab),以及结构蛋白S E M, N (16- - - - - -18]。在此基础上事实上的标准,CSG ICTV执行委员会制定分类建议,从而直观地遵循非官方(但被广泛接受的)命名,将phylogroups 1到3转化为属指定α- - - - - -,β-和Gammacoronavirus分别(图2)。病毒目前公认属形式不同的分组monophylogenetic集群,但是不共享其他明显的特征(主机取向、器官取向和类型的疾病),建议一个公分母。
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2。犬肠冠状病毒:进化
CCoV家畜流行病期间第一次描述了1971年在德国犬部队(19]。从第一个报告,CCoV一再被隔离受影响的狗今天似乎是地方性动物病在世界范围内,和狗的品种和年龄似乎容易感染(20.- - - - - -26]。
而致命的感染是不寻常的,除非其他病原体混合感染或过度拥挤和不卫生的条件下,CCoV仅是一个重要的犬类病原体负责传染病之一(27]。然而,疾病引起的CCoV尚未充分调查,和它在犬肠道疾病的作用,不是建立在细节。自1971年首次隔离,CCoV发展,在过去的二十年间,研究人员关注CCoV菌株的基因组变异,确定新的基因型/类型。
2001年,由CCoVs序列分析收集的粪便样本中发现腹泻的狗在意大利南部,多个nt替换积累观察M基因的片段(28]。影响M基因的点突变后来观察CCoVs序列的两个自然感染的粪便中发现幼崽在后期长期病毒传染。这些CCoVs从1971 -像CCoVs不同,表现出明显的遗传漂变向FCoVs 2型,它是假定两只狗可能被混合感染人口CCoVs基因不同,或者病毒中发现幼崽都是基因突变的结果/重组事件(29日]。
这些初步观察了有意义的研究CCoVs基因进化的冲动。广泛的序列分析在多个地区(特别是ORF1a、ORF1b ORF5)病毒基因组的CCoV-positive粪便样本,提供强有力的证据存在的两个独立CCoV的基因簇。第一个集群包括CCoVs混入参考CCoV菌株,如Insavc-1 K378,而第二个集群将分别与CCoVs,据推测,代表一个遗传异常值称为FCoV-like CCoVs [30.]。一个可能的解释不同的种族隔离是在自然条件下高度同源浸之间的同源重组事件,如CCoV FCoV,经常发生。重组发生是未知的,但众所周知,CCoV能够使用猫氨基肽酶(fAPN)糖蛋白作为细胞受体(31日),在实验条件下,猫可以感染CCoVs [32]。这意味着频繁的种间流通的CCoVs FCoVs的狗或猫可能发生,因为混合感染需要产生重组事件。另一个假设是,重组事件发展在许多其他比猫或狗,如野生食肉动物,或野生食肉动物可能拥有CCoV的直接祖先。分析x和rna从各种野生食肉动物隔离可以阐明这些假设。根据这些猜测,限制网站的重组,如地区很高nt身份之间高度同源浸浸的基因组中可能存在。这个解释假设浸在食肉动物具有一种“动态”的基因组(30.]。
考虑到遗传漂变对FCoV观察M基因的FCoV-like CCoVs,这些不同菌株之间的遗传差异和典型的参考CCoV菌株ORF2序列进行评估,以变化更明显。nt的区域序列包含大约80%的S基因的其中一个FCoV-like CCoVs,应变艾尔摩/ 02,清楚地表明,小说CCoV类型、高度不同的参考CCoV菌株FCoV 1型密切相关,狗之间的循环。推测的氨基酸序列比较显示约81%的身份FCoVs 1型和大约54%的身份FCoVs 2型和CCoV参考菌株。的基础上明显和重要的身份之间艾尔摩/ 02应变和FCoVs 1型,新菌株艾尔摩/ 02被指定为新认可的基因型1的原型(CCoV 1型),并被指定为CCoV 2型参考菌株(33]。氨基酸组成的散度高和潜在糖基化的得失网站相比最密切相关的冠状病毒(FCoV 1型、FCoV 2型和典型CCoV),强烈建议艾尔摩/ 02应变与其他冠状病毒抗原不相关的食肉动物。图3报告的S基因的系统发育关系从不同的人类和动物浸。系统发育分析清楚地表明,CCoV 1型、应变艾尔摩/ 02,负责隔离FCoVs 1型,而不是参考CCoV 2型菌株和FCoV 2型菌株。此外,存在的基本残留RRXRR表明存在潜在的乳沟的蛋白质。类似的基本主题是,大约在同一位置,在所有betacoronaviruses和gammacoronaviruses识别和分类。最近,Lorusso et al。34]还描述了一个附属基因,ORF3、624元长度、独特CCoV 1型(图1)。假定的编码蛋白质,预测分子量约24 kDaa,长207氨基酸,和没有跨膜区域的观察发现表明,从感染的细胞分泌的蛋白质。
所有这些数据的意义尚不清楚,但它提出了几个问题关于CCoVs的生物学。文献CCoVs-induced疾病提供很少或没有有用的信息,尽管近年来阐明额外重要的数据就越模糊方面的感染,几项研究需要执行扩展这两个CCoV基因型的知识。数据获得的基因组进化肠CCoVs和聚焦于重要的流行病学状况,预防和病毒进化。因此,两种病毒的血清学关系需要进一步研究,和几个问题关于CCoV病理学的1型和当前可用的功效CCoV疫苗只包含CCoV 2型仍有待回答。
3所示。肠CCoVs:病理学和流行病学
调节过程中自然因素引起的肠道疾病CCoVs并不好理解。狗CCoVs负责肠炎,从轻度至中度感染的迹象可能不同,但他们更严重年轻小狗或结合其他病原体。常见的症状包括软粪便或流体腹泻、呕吐、脱水、食欲不振,,有时候,死亡。由CCoV双重感染犬细小病毒2型(CPV2)尤其严重感染时同时发生(35),但CCoVs还可以提高顺序CPV2感染的严重程度(36]。
自然粪口传播途径,和病毒在粪便是主要的感染源。在新生儿狗,病毒复制主要出现在绒毛的小肠导致的肠上皮细胞裂解性感染其次是脱皮和绒毛缩短,导致腹泻18 - 72 h后感染(37]。生产当地的iga限制病毒的传播在小肠和逮捕感染的进展。因此,受感染的狗可能摆脱病毒只要6个月后临床症状已经停止29日,38]。
最近广泛收集的粪便样本的生物分子分析受感染的狗在意大利发现CCoVs感染非常普遍,通常表现为同时发生两种基因型(39,40]。CCoVs 1型和2型在澳大利亚被发现是常见动物收容所CCoV 1型是普遍的(41]。还发现了CCoVs在西欧的狗的数量42]。他们一直在所有欧洲国家检查,发现,除了英国,CCoV 1型的患病率低于CCoV 2型(25]。广泛的报道CCoVs来自瑞典(21)和中国(43]。Soma等。24)报道,CCoVs也流传在日本,和狗年龄在1年以下的检出率为66.3%,两种类型的同步检出率高达40%。
这些数据提出了若干问题,更深入的病理学调查CCoVs 1型和2型是必需的。因此,故障隔离CCoV 1型在体外(40阻碍了收购的关键信息在狗CCoV 1型的发病的作用,防止一个真正的免疫学特性的评价这一新的基因型。
4所示。散度菌株和泛嗜性CCoV的出现
CCoVs,像其他浸,显示突变频率相对较高,近几十年来,不同的菌株被描述。第一个观察是卫斯理,(44)表明,尽管大多数CCoV序列是谁FCoV-like, S基因的n端CCoV应变UCD-1 TGEV密切相关。
小说的识别CCoV、应变UWSMN-1从幼崽肠胃炎致命病例的繁殖地报道2001年在澳大利亚(23]。序列分析和聚合酶基因片段的证实,澳大利亚隔离从CCoV发散和FCoV古典菌株,在比较751 nt 3′S基因区域,发现UWSMN-1 21独特的网站,有112株地点不同于至少一个其他菌株进行了分析。这些差异似乎随机散布,证明不同的5′S基因区域UWSMN-1可能不是FoCVs和CCoVs之间的重组事件的结果,作为将表示如果S基因共享块FoCV或CCoV S基因的同源性。相反,UWSMN-1似乎通常发散由于逐渐积累在其基因组的突变,这可能是反光的孤立进化在澳大利亚45]。
2002年,家畜流行病爆发的腹泻发生在一个小猎犬育种在英国殖民地。一个新的CCoV,应变BGF10孤立和特征。病毒显示高度发散区域伴域的M蛋白和非结构蛋白3 b 250氨基酸与其他浸毒力有关46]。
2005年,小狗被描述在意大利,一个致命的疾病的致病变种CCoV,应变CCoV类型2 cb / 05,隔绝所有组织检查除了大脑(47]。3′末端的序列的基因组的泛嗜性CCoV应变表现出高度的氨基酸与CCoV 2型身份,除了S蛋白显示身份FCoV 2型最高,菌株79 - 1683(图3)。E蛋白的最高身份获得对TGEV应变普渡的集群毒性CCoV发现下降发展史。N蛋白,这是长383氨基酸,被发现密切相关TGEV应变普渡序列分析和发展史。有趣的是,非结构蛋白3 b(22个氨基酸)短于预期48]。在最近的一次实验研究,Decaro et al。49)表明,应变CCoV类型2 cb / 05能够感染犬血清反应阳性的肠CCoV,能够诱导病毒剂量的临床体征无论挑战狗。受感染的狗显示淋巴细胞减少,病毒RNA检测胸腺、脾脏、淋巴结和一些受感染的狗,展示新菌株的lymphotropism CCoV类型2 cb / 05。研究也提供了证据,免疫力自然接触引起的肠CCoVs不能完全预防应变CCoV类型2 cb / 05。这个重要的数据突显出一个事实:与肠CCoV狗接种疫苗可能会收购亚临床感染CCoV类型2 cb / 05-like病毒,导致淋巴细胞减少,诱发机会主义病原体和/或更严重的犬细小病毒引起的疾病。
最近,CCoVs与一个潜在的双重组起源与TGEV被确定通过部分e基因交流胃肠道和内部器官的小狗死于急性胃肠炎(50]。一个TGEV-like CCoV、应变UCD1前所述,但只有部分e基因序列测定,从而防止一个完整的基因组特征(44]。新的CCoV菌株是严格相关TGEV n端结构域的蛋白质,而其余的基因组显示更高的遗传相似度CCoV 2型隔离。相关抗原之间的差异观察参考CCoV 2型和重组TGEV-like CCoVs可能对预防项目,像狗管理经典CCoV疫苗可能容易受到感染引起的重组病毒。
5。呼吸犬冠状病毒
犬冠状病毒的进化的一个例子明显,点突变的积累的结果,小插入和删除在基因组的编码和非编码区域,最近一种新的冠状病毒的鉴定,犬呼吸道冠状病毒CRCoV,在组织样本收集的呼吸道病狗。在调查建立犬传染性呼吸道疾病的原因在一个大的收养狗在英国待得时间更久,CRCoV被隔离在气管和肺样本在狗轻微的临床症状。病毒关系密切betacoronavirus最高的聚合酶和基因,与相应BCoV蛋白质和氨基酸的身份证明是肠CCoVs远亲。通过序列比较分析251个基点的互补脱氧核糖核酸聚合酶序列,身份是HCoV聚合酶基因BCoV为98.8%和98.4%,而只有68.5% CCoV, 1 - 71。当比较获得的氨基酸序列的翻译cDNA序列从CRCoV BCoV的氨基酸序列,HCoV-OC43, 1093年重叠和肠CCoV峰值蛋白质氨基酸,身份是96%,95.2%,和21.2%,分别为(图3)。此外,他基因的存在,这是一个蛋白基因特征的成员betacoronaviruses已经证明,在CRCoV基因组12,52]。自2003年发现以来,CRCoV被发现出现在狗在欧洲其他国家,以及在加拿大和日本53- - - - - -58]。的演变betacoronaviruses密切相关,它已经表明,这些病毒分享最近的共同祖先。CRCoV也分享这祖先或可能源于一种转移BCoV狗。为了确切回答的问题是否CRCoV最近才出现,更多的存档材料需要测试。此外,将需要更多的从CRCoV毒株序列信息进行系统分析,进一步证实了他们的起源。
6。在诊断的新进展
相关的临床症状最常见的肠CCoVs不易区分从那些与其它肠病原体如CPV2或犬轮状病毒、犬腺病毒。因此,CCoV诊断需要实验室确认。CCoVs的诊断技术用于检测粪便样本包括电子显微镜(EM),在细胞培养病毒隔离(VI),生物分子分析。EM负染色检查粪便悬浮液和免疫电镜快速检测冠状病毒程序,似乎有价值的诊断工具59]。然而,coronavirus-like粒子在肠道的内容往往类似于冠状病毒(60),和EM考试所需的专业实验室和技术人员。VI是最常用的技术诊断CCoVs感染(45),但更复杂,更比其他方法耗时且不敏感。CCoV 2型生长在几个细胞系的犬和猫起源、分离和识别需要中和细胞病变效应和/或参考血清或单克隆抗体免疫荧光试验。故障隔离CCoV 1型细胞培养(40)减少的变化识别多种形式的病毒引起的肠炎,所以CCoV 1型疾病的频率可能是低估了。这些困难和限制防止真实评价的免疫学特征这一新的基因型和阻碍收购在狗在其发病的关键信息的作用。
在过去的十年中,几个pcr进行检测方法已经开发CCoV RNA在狗的粪便,允许检测病毒隔离被克服的局限性。PCR已被确认为金本位制,因为改善的敏感性和特异性相比传统方法(20.,23,61年,62年]。因此,没有一个发达pcr定量设计。此外,常规PCR包含一个特定风险的延滞污染由于post-PCR操作和第二个嵌套PCR扩增一步系统,特别是当一个高样品处理量是必需的。相反地,实时TaqMan rt - pcr使一个敏感的和特定的病毒RNA定量(63年- - - - - -66年]。Decaro et al。67年)开发了一种实时fluorogenic rt - pcr、简单、快速、检测和定量的和可再生的方法CCoV RNA在受感染的狗的粪便,基于TaqMan技术。相比传统的rt - pcr, fluorogenic试验是一个封闭的系统postamplification管从来不开,排除交叉污染的可能性。fluorogenic染料系统的主要优势包括量化CCoV RNA数量在粪便样本高度的再现性和精确定量凝胶相比,PCR检测(68年,69年]。
最近,两个genotype-specific fluorogenic rt - pcr检测化验了,歧视,定量CCoV 1型和2型rna CCoV在狗的粪便与腹泻。分析显示高特异性、灵敏度和重现性,允许一个精确的定量CCoVs RNA在线性范围约8个数量级,从101到108本标准的RNA。的genotype-specific fluorogenic分析可能是有用的病毒含量的检测和测量从狗自然或收集粪便样本实验感染1型,2型,或两个基因型39]。
7所示。结论
RNA最有趣的特性之一是它能够携带遗传信息,尽管其不稳定的性质。浸在RNA病毒在许多方面中是独一无二的生物。他们的特点是一个非常大的基因组,通过嵌套组subgenomic mrna,不连续的转录机制和高频率的RNA重组事件因为错误频率高的RNA聚合酶(70年]。基因重组产生新基因是一个重要的机制可能比父母的基因组有选择性的优势。进化的RNA病毒,病毒RNA重组是一个普遍现象,形成了通过重新安排病毒基因组或传播功能模块在不同的病毒(71年]。尽管nonsegmented基因组的RNA病毒一般展览,重组频率很低或者检测不出来,再组合为整个浸基因组已高达25%(计算72年]。RNA重组的高频x可能是冠状病毒的独特机制综合的结果,其中包括不连续的转录和聚合酶跳跃。可能是病毒聚合酶与不完整的新生的RNA,分离其模板在随机点,和交换机同源站点在不同的RNA模板完成样板选择机制(RNA合成的73年]。根据修复机制的精确性,修复基因组可能类似于父母的基因组,或它可能包含更多的突变。这说明在RNA序列生成的序列多样性基因重组可以涉及总值变化和小突变。内的遗传差异alphacoronavirus是由线性进化以及突然戏剧性的变化由RNA删除或重组74年]。
RNA重组已经发展成为一个强大的遗传工具所需的RNA序列引入到浸基因组,表现出浸自然进化的一个重要机制。例如,新株IBV家禽的结果自然不同领域之间的重组菌株。FCoVs出现2型FCoV 1型之间通过重组事件,完全猫科动物,和CCoV,导致FCoV基因组组成的基因和从CCoV相邻基因的一部分75年]。重组可能也扮演了一定的角色不同的冠状病毒进化的物种,也可以解释他的收购基因的mRNA丙型流感病毒的起源betacoronaviruses(1]。S蛋白的PEDV占有HCoV 229 e和TGEV之间的中间位置76年),而S蛋白PRCoV TGEV高度相关,但是却有一个很大的删除的n端氨基酸(超过200),可以解释病毒的病理学的变化(77年]。非典成为人类疾病相关的肺炎在广东省,中国,2002年11月。非典的病因剂似乎是一种动物病毒对人类了。29-nt删除序列的存在野生哺乳动物的基因组浸证实了这种新病毒对人类的适应(78年]。
由于突变频率相对较高,RNA病毒有可能迅速适应某些负面压力,比如提出的免疫系统。复合事件影响CCoVs可以澄清进化过程导致的扩散新病毒株,血清型,和亚型,发生冠和应变CCoV类型2 cb / 05。尽管CCoVs进行一些研究,有很多方面有待澄清:同时感染的意义通过CCoV 1型和CCoV 2型,真正的致病的作用这两个病毒,免疫反应对CCoV 1型和CCoV 2型,和评估CCoV 2型CB / 05-like病毒分布狗人群。
确认
作者感谢公共卫生部门的研究人员和动物科学部分“传染病”——其研究活动必不可少的犬冠状病毒研究和审查的准备的礼物。作者还要感谢安东尼绿色审查和帮助提高英语论文的。这项工作是支持由意大利卫生部Ricerca Finalizzata 2008项目”哺乳动物冠状病毒分子流行病学、疫苗开发和对动物和人类健康的影响”。