文摘
流感病毒的组装和出芽病毒budozone收益,一个域特征的质膜胆固醇/ sphingolipid-rich膜筏。病毒跨膜糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)本质上是针对这些领域,而M2看似针对budozone的边缘。病毒组装是由基质蛋白M1精心策划的,绑定到所有病毒成分和膜。萌芽发展蛋白质和lipid-mediated膜弯曲和粒子分离可能由平方米。在这里,我们总结的实验证据模型强调的raft-targeting特性哈,NA, M2和评论功能筏病毒蛋白质运输领域的重要性,组装和出芽,环境稳定,膜融合。
1。介绍
1.1。流感病毒:分子组成
流感病毒粒子是异构的形状,球形(直径约100海里)或丝状(长度为几微米)。粒子包含病毒基因组,这是划分为8个实体称为病毒核糖核蛋白粒子(vRNPs),每一段病毒RNA组成的复杂的核蛋白(NP)和病毒RNA聚合酶的亚基(PA, PB1和PB2)。vRNPs是由蛋白质包裹层组成的基质蛋白M1,病毒囊膜下也行,应该绑定到所有其他病毒的成分。病毒囊膜是一种脂质双分子层来自受感染细胞的顶端质膜。有三个transmembraneous病毒蛋白质镶嵌在信封:糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA),在病毒表面突出的“峰值”,在小数量,质子通道蛋白平方米。这里,我们将集中在病毒囊膜的形成和蛋白质(HA、NA平方米,M1),图中所示1。
(一)
(b)
哈(蓝色的图1)是一种跨膜蛋白的氨基端信号肽(白图1(一)),这是裂解后cotranslational封存的新生多肽链进入内质网(ER),一个大ectodomain(定位在ER腔和向细胞外环境当位于质膜),一个跨膜区域(咯)约27个氨基酸残基糖基附近的蛋白质,和一个简短的胞质尾(约11残留物)。
HA组装成homotrimer在ER和运输通过质膜的分泌途径,更具体地说的顶端质膜极化(如上皮细胞)细胞,病毒装配和崭露头角的发生(2]。ER和高尔基,HA是ectodomain糖化,通常三个饱和脂肪酸链共价连接到c端半胱氨酸残基(S-acylation)。第一个半胱氨酸残基,在边境咯和细胞质之间的尾巴,与硬脂酸被修改,而其他两个半胱氨酸在胞质尾携带棕榈酸酯(3,4]。
大型ectodomain处理成两个子单元(HA1和哈2)由主机提供的蛋白酶生物;他们仍然与二硫桥(5]。这个蛋白水解成熟是需要启用膜融合施加的HA在病毒进入:疏水部分称为“融合肽”(青色在图1(一))成为暴露在分子的n端公顷2乳沟和插入主机后的膜在激活公顷(构象变化的ectodomain低pH值)。除了膜融合,哈还负责受体识别:HA绑定的口袋里1承认唾液酸半个宿主细胞表面的糖蛋白和糖脂(6]。
NA(绿色在图1)是一种II型跨膜蛋白,它组装成homotetramer。前五个残留的n端形成细胞质尾,紧随其后的是一个跨膜锚包括大约30残留和糖化ectodomain。NA在同一细胞内途径处理哈(ER-Golgi-apical等离子体膜)。蛋白质的主要功能是乳沟终端唾液酸的粘液从聚糖半个主人的呼吸道病毒表面,从而帮助释放新成立的病毒颗粒从宿主细胞。NA是目标的抗流感药物奥司他韦和其他神经氨酸酶抑制剂(7]。
平方米,第三个病毒跨膜蛋白(紫色在图1),也是四聚物的形式一个质子通道激活酸性pH值,这是重要的作用在病毒基因组开箱条目,可以inhibited-at至少在甲型流感病毒毒株,药物金刚烷胺。在每个单体,第一个24个氨基酸形成ectodomain,这不是糖化,以下19残留跨膜区域,其余54残留建立胞质尾。序列后立即咯形状membrane-parallel两亲性螺旋,一个α螺旋和一个疏水的脸(这部分突出到膜),和一个亲水的脸(指向胞质)。半胱氨酸残基的蛋白质是S-acylated的一部分。类似于血凝素和神经氨酸酶,M2沿着分泌途径运送至顶端质膜,但M2的顶端定位信号没有被确认。与其他病毒的跨膜蛋白,然而,M2在很大程度上是排除病毒颗粒(8]。
的基质蛋白M1(红色在图1)与膜结合,但没有跨膜跨度(9- - - - - -11]。M1最有可能附在膜蛋白质的扩展区域或多个结合位点的合作行动12- - - - - -16]。与此同时,大部分的蛋白质被发现被mass-spectrometry-based膜相关结构重建(1]。M1是中央为病毒形态发生应该绑定到所有其他病毒组件包括vRNPs和膜。然而,M1不是本质上针对大会网站,顶端等离子体膜,而是定位核,内部膜和胞质。质膜定位的M1因此很可能由至少一个病毒跨膜蛋白(HA、NA和M2)。M1的胞质尾公顷的交互(11残留物)和NA(5残留物)只有间接证明,例如,通过改变洗涤剂溶解度(17,18)或增加膜协会(19的M1的HA / NA,效果未见的所有研究[15]。相比之下,M1和M2的胞质尾之间的交互(54残留物)良好的文档记录,最确切coimmunoprecipitation [20.,21]。M1有能力oligomerize [16),这应该是集群病毒组件在病毒出芽的网站组织装配过程。
1.2。生物化学和生物物理特性的膜筏
与质膜的经典视图作为一个同质的脂质混合物,现在有确凿的证据表明存在专门的脂质域具有不同的生物化学和生物物理特性。这些膜筏是动态程序集的胆固醇、鞘脂类和磷脂含有饱和脂肪酸。鞘脂类是只存在于质膜的外部传单,而内在的构成传单木筏还不得而知,但它已经表明,胆固醇+与饱和磷脂酰基链是丰富22,23]。
膜筏在模型具有广泛的膜系统。胆固醇/ sphingolipid-rich阶段,(主要是饱和)膜脂的脂肪酸链在流动密集和限制,但仍然能够分散和旋转,形成一个“liquid-ordered”(Lo)相隔离的“liquid-disordered”(Ld),更多的液体膜阶段。Lo和Ld域相分离后,有一个疏水不匹配和两个膜阶段之间的高度差,形成的一个“线张力”界面。这是概念上与表面张力在三维系统中,对于instance-leads的形成一个球形滴水的油性表面最小化的表面的接触面积。因此,线张力导致弯曲木筏的形成阶段由于系统最小化其自由能的倾向(24]。
但是,没有大规模、长期的相分离是在不受干扰的细胞的细胞膜,高度动态(毫秒范围)和非常小的(10 - 200 nm)异构膜组织依赖于胆固醇的存在已经观察到大量使用生物物理方法调查的时间和空间分辨率高25]。
质膜筏域是最好的描述,虽然胆固醇/ sphingolipid-rich域可能已经建立在高尔基体。蛋白质有raft-targeting特性与木筏,最果断glycosyl-phosphatidylinositol (GPI)锚和S-acylation半胱氨酸残基的26]。在某些情况下,例如,在配体绑定和受体齐聚,高度动态的“休眠状态”筏可以合并和稳定满足生物功能(25,27]。一个例子的功能化筏域信号转导过程,例如,免疫突触的形成活化的T细胞(28]。装配和出芽的一些病毒如流感病毒也耦合形成的功能化筏域,这里称为“budozone。”在这种情况下,筏浓缩病毒组件提供一个平台和促进他们的交互,同时剔除细胞蛋白(24,25]。
2。流感病毒蛋白质协会筏和方法来分析它们
流感病毒装配和萌芽与(合并)在顶端质膜膜筏。一般的假定为raft-associated糖蛋白血凝素和神经氨酸酶,而M2本质上被认为是排除在木筏。外周膜蛋白M1是没有膜子域特异性。在接下来的段落中,我们描述的实验证据导致了这个模型。
2.1。血凝素存在于Detergent-Resistant膜
历史上,木筏假说提出的观察,一些地区的生物膜(富含胆固醇和鞘脂类)抵制增溶等非离子去污剂Triton x - 100在冰上和漂浮在密度梯度离心浮力密度较低。这些“detergent-resistant膜”(drm)一直被认为是生物化学相关的木筏。他们被发现含有蛋白质,因此称为DRM-associated和视为筏蛋白质。此外,协会应该敏感的drm胆固醇提取和鞘脂类合成的抑制剂26,27]。
流感病毒的血凝素(HA)是第一个蛋白质被描述为一个组件的drm (29日),已经被评判作为raft-associated范式跨膜蛋白。
洗涤剂提取方法与诱变结合使用来确定分子信号在HA筏本地化。丙氨酸扫描整个跨膜区域(交换一次连续三个氨基酸由标明丙)表明,膜的疏水残基位于外层膜双层负责抵抗洗涤剂萃取(29日,30.),见标签1图1 (b)。此外,S-acylation细胞质和跨膜半胱氨酸残基(标签2)所需的分区HA的drm (30.]。从detergent-extraction实验,得出结论,棕榈酸酯绑定到胞质半胱氨酸救生艇协会更重要比硬脂酸附着在跨膜半胱氨酸(31日,32]。
目前,我们只能推测raft-targeting信号引起的分子机制将HA木筏。原则上,α螺旋跨膜区域和突出的氨基酸侧链应该干扰脂质在一系列领域的紧密包装时不容易适应刚性,笨重的固醇环的胆固醇。然而,直接绑定的胆固醇蛋白可能导致许多目标。等主题的”胆固醇识别/交互氨基酸共识”(坚固,33])或“胆固醇共识”主题(CCM, (31日]),大量脂肪残留物(缬氨酸和异亮氨酸),酪氨酸和苯丙氨酸残基,一个基本的氨基酸(精氨酸、赖氨酸)协调胆固醇如果定位相应的一部分。可想而知,在HA-TMR raft-targeting残留物(valine-isoleucine-leucine /维尔),其中两个(IL)严格保守所有哈子类型,形成胆固醇交互口袋里的一部分。然而,由于原子结构信息的HA-TMR仍然缺乏,目前尚不清楚问题的氨基酸是理想的位置。绑定到胆固醇可能目标HA既存的木筏在木筏的“脂质壳”模型预测蛋白质协会(32]。另外,它最近表明,肽代表哈诱发跨膜区域的高度有序的域模型膜,但只有在存在守恒的亮氨酸残基(34]。假设一个类似模式的行动咯的细胞膜,这将意味着HA诱导形成的许多领域。此外,疏水咯残留的替换少疏水性标明丙可能缩短跨膜跨度的长度。可能需要很长一段咯哈成木筏的分区,这是厚的比其他膜区域由于拉伸脂质脂肪酸的尾巴。
哈,第二raft-targeting特性的存在S-acylation,似乎是一个共同的原则在许多木筏蛋白(35]。可以想象,灵活的酰基链,尤其是跨膜区域的开始,填补空洞的不规则和粗糙表面跨膜域,从而“润滑”地区后续与胆固醇的交互。此外,脂肪酸与HA的胞质尾可能吸引胆固醇,在晶体结构的建议β肾上腺素能受体,胆固醇是可见的共价结合附近的棕榈酸酯。然而,应该指出的是,S-acylation本身,无论是否棕榈酸酯或硬脂酸,不足以造成筏本地化的病毒跨膜蛋白(36]。一个例子是赫夫丙型流感病毒的糖蛋白,与drm不关联,但在跨膜stearoylated半胱氨酸(3,12]。
多次质疑是否与drm反映筏协会在活细胞的蛋白质。组件可能会丰富drm仅仅因为他们拥有共同的生物物理属性。此外,分区detergent-soluble和不溶性的蛋白质的分数很少绝对;有时候,只有很少的蛋白质的人口比例在drm。提取条件没有标准化,因此结果通过使用不同的协议很难相比(37]。因此,随后更复杂的方法被用来确认和描述HA的木筏本地化。
2.2。用高分辨率方法分析HA的分布
在活细胞荧光显微法未能揭示横向隔离HA集群或其他raft-associated蛋白质和脂质,表明木筏在不受干扰的细胞必须小于光学显微镜的分辨率(< 200海里)。然而,当抗体HA和glycolipid-anchored蛋白质应用HA被发现与建立cocluster筏组件。假设哈三聚的交联抗体稳定小筏结构,随后与其他许多领域合并形成大型,可见补丁(38]。然而,这项研究并不能在平静的细胞建立潜在的HA集群。此后,方法与横向分辨率高于常规光学显微镜已经被使用。
Immunoelectron显微镜结合严格的统计分析表明,在转染细胞HA中随机分布的等离子体膜和积累只有在非常小的领域大小的小,动态筏。相反,集群的HA分子在不同长度尺度从20纳米到900纳米。病毒感染过程中,观察HA集群规模增加,表明增加HA-containing域的聚结。自从nanodomains包含神经节苷脂GM1,他们可能来自木筏。然而,只有在纳米HA集群长度范围内,也就是说,与uninduced木筏的大小,可以通过提取胆固醇的分解39,40]。Fluorescence-photoactivation-localization显微镜(FPALM),最近开发了纳米方法具有很高的空间分辨率(40 nm),基本上证实了HA集群不固定的,活细胞(41]。
因此,HA膜的积累在microdomains甚至诱发他们的形成,导致其与细胞蛋白分离。由于HA集群的面积足够大的表面覆盖的球形病毒粒子,这些结构被称为病毒preenvelope或病毒budozone表明他们可能前兆出芽病毒颗粒的39,42]。HA集群的大尺寸显示,它们是由几个小木筏。此外,HA集群不具备轮(周长最小化),但与狭长不规则域边界扩展。这不仅表明HA分割成筏、还有其他机制形成的膜子域可能负责HA集群(39,43]。一个候选人皮质肌动蛋白对于这样一个函数,它生成一个网络内微丝的传单的质膜可能是暂时性的欺骗公顷(44]。此外,皮质肌动蛋白可能会组织的形成和维护筏(45]。这种效应可能是介导的脂质磷脂酰肌醇-(4、5)磷酸(PtdIns P (4、5)2),装配和拆卸的关键调节器的微丝(46]。肌动蛋白细胞骨架也已被证明是功能与筏在病毒感染:肌动蛋白网络的中断导致的重新分配HA和减少萌芽,最贴切地丝状病毒颗粒的情况下,也许因为他们的表面积是高于球形粒子(38]。
福斯特的或荧光共振能量转移(FRET)非常适合展示两个分子之间的密切关联,例如,如果它们填充相同的小木筏领域,甚至在很短的时间内。担心依赖于能量的转移从一个兴奋供体荧光团,如cyan-fluorescent蛋白质(CFP),受体荧光团,例如,yellow-fluorescent蛋白(YFP),如果他们在彼此非常接近附近(< 10海里)。协会的两种蛋白质可以评估在细胞融合他们CFP YFP,分别进行测量。排除烦恼的信号是由于随机碰撞的两个分子,因为它经常可能发生如果两个平面的扩散膜,担心数据必须与探针的表达水平有关。如果担心效率随烦恼的浓度在膜受体蛋白,烦恼是由随机碰撞引起的。相反,如果烦恼是由于聚类两种蛋白质的研究中,担心效率在很大程度上是独立于受体蛋白的浓度和饱和甚至在相对较低的烦恼受主浓度(39,40]。评估数据,双曲函数拟合数据,产生一个“离解常数”KD作为一个参数来评估供体和受体的关联属性43]。流感病毒HA,融合在其胞质尾CFP (42),集群的建立标志内部传单筏、myristoylated和palmitoylated YFP [43]。此外,人造HA-derived担心探针组成的信号肽,荧光蛋白,跨膜的胞质域哈(44),集群glycolipid-anchored蛋白质,木筏外层膜的标志。在这种构造,标记的胞质尾是规避,以避免干扰它在横向组织中的作用。对于HA结构,集群是由胆固醇显著降低木筏解体时的提取和raft-targeting描述的两个信号时被移除。两种信号有一个类似的哈,不影响raft-targeting彼此协同工作。
一个既不担心技术的缺点KD值和FRET-efficiencies可以比较不同蛋白质对,即使它们附加到相同的供体和受体荧光团。担心效率取决于供体和受体之间的距离和它们的相对取向,参数无法测量细胞内。因此不能确定分子的比例与大量标记或定量比较不同病毒蛋白质的救生艇协会。
2.3。HA的扩散流动等离子体膜
被假定蛋白质的嵌入在许多领域导致较慢的扩散non-raft蛋白质相比,分散为单个实体(47]。因此,荧光光漂白后复苏(收紧),补充的速度以前漂白的现货在膜测量,采用哈。超过80%的所有哈分子被证明是移动,表明HA集群不是静态的收紧实验的时间(几分钟)。野生型与删除哈扩散相比有点慢哈raft-targeting信号,但其扩散率升高non-raft公顷值后中断的木筏损耗的胆固醇(48]。然而,HA(有或没有raft-targeting信号)扩散慢得多比的标志内部传单木筏表明他们不分散在一个稳定的木筏复杂(42]。
然而,扩散迁移以收紧是由跨膜锚固的类型而不是筏本地化:蛋白质由脂质(prenylation S-acylation)半个扩散速度比跨膜蛋白无论他们与筏;筏子蛋白质HA显示类似的扩散行为non-raft G水泡性口炎病毒(VSV-G) [49]。
收紧只适用于确定的整体流动性HA的大面积等离子体膜(几个μ米2),它包含筏和non-raft域。解剖的扩散行为HA的非常小的空间和时间尺度上(原状)筏、高分辨率的方法需要使用(50]。事实上,FPALM表明HA纳米方法移动时观察到在高空间分辨率(< 200海里),即在HA集群的维数。得出膜分析HA集群不是由固相,因此允许HA分子扩散并最终离开集群的边界(41]。
没有研究对HA的集群行为在其自然栖息地,两极分化细胞的顶端膜,尤其富含大量脂质和可能大多raft-like;即筏域可能占主导地位的,渗透阶段(51]。在其他膜,木筏被认为是次要的领域,像一艘船在海上漂浮non-raft脂质,一个属性的名字“木筏”。可能不同属性的顶端膜可能影响HA集群和扩散。
总之,这些结果与模型一致的动态分区的HA预先存在的许多领域,允许蛋白质了短暂填充筏域,以及木筏之外进行扩散。另外,哈哈可能是暂时性的诱导形成的木筏,迅速提供进一步的刺激如果没有消散。最近实时研究单个人类免疫缺陷病毒(HIV)的生物起源粒子显示,5到10分钟所需粒子组装和萌芽和释放额外的20分钟(52,53]。假设一个类似的时间框架适用于流感病毒粒子的组装和崭露头角的,目前还不清楚这样不稳定的HA集群可以支持整个装配过程。然而,它是合理的假设在病毒感染的背景下,结合哈M1和随后的寡聚化后者可能会进一步稳定HA集群和作为成核的招聘网站病毒rnp。
2.4。模型膜来分析筏本地化的哈
筏HA协会也被分析在体外使用模型膜,这有一个好处,那就是它们的化学成分可以精确控制。一个合适的系统是巨大的单膜囊泡(爸爸),球封闭独立的影响的大小数十微米的范围,因此细胞样的曲率。当准备从磷脂、鞘磷脂(SM)和胆固醇的摩尔比率1:1:1,“规范筏混合物,”分离的脂质为两个阶段。用荧光显微镜观察阶段可以使用脂质荧光探针,它支持要么liquid-disordered (Ld)或liquid-ordered (Lo), raft-like阶段。膜蛋白、化学标记荧光团,可以还原成爸爸允许直接测试阶段偏好的蛋白质(54]。令人惊讶的是,哈,真实蛋白质纯化的病毒颗粒或肽代表其跨膜区域,只存在于liquid-disordered, non-raft域(55]。然而,只有少数蛋白质视为筏组件在活细胞,例如,GPI-anchored蛋白质,与老爸的许多领域。
使用膨胀过程,人工膜也可以准备从一个细胞的质膜,利益表达荧光蛋白质的构造。同样的老爸,这些巨大的质膜小泡(GPMVs)显示持久,大规模分离成筏和non-raft在冷却阶段,但包含自然细胞膜的脂质和蛋白质的多样性。使用这样的膜,分区的HA(荧光蛋白融合)更多的变量;一个小,但也大量出现在raft-like阶段(55,56]。
筏HA的本地化的差异在细胞膜,GPMVs,老爸可能用的包装顺序上的差异来解释他们的脂质。使用荧光脂质调查,结果表明,筏阶段是老爸最密集,财产可能阻止访问特别是跨膜蛋白(55,57]。此外,老爸和GPMVs缺乏皮质肌动蛋白可能有助于组织在细胞和维护筏域。此外,脂质双分子层的不对称,特点为细胞的质膜,而不是保存在老爸和GPMVs。最后,在一些程序准备公顷或GPMVs,还原剂的二硫苏糖醇(DTT),这是众所周知的,断开thioester-bound脂肪酸。在提到的研究,这可能已经删除了raft-targeting特性和与此同时导致non-raft HA的本地化。GPMV形成的另一个过程,避免了德勤的使用表明,许多蛋白质预测在细胞划分成raft-localized命令阶段(35]。研究还表明,大部分的raft-associated palmitoylated跨膜蛋白,这需要疏水改性筏分区。这将是有趣的,看看HA人工膜系统的行为。
原则上,忠实的病毒蛋白的结合到模型膜可能的第一步在体外系统病毒装配和萌芽,使破译所有必需的组件,也就是说,单个病毒蛋白质和脂质。
2.5。许多其他流感病毒膜蛋白的定位
不太了解筏定位第二糖蛋白的流感病毒,神经氨酸酶NA,这也是DRM-associated和水运输。顶端的信号传输和筏定位都是位于NA的跨膜区域,但只有部分重叠。筏目标映射到咯一半位于外膜传单(标签3在图1 (b)),但分子的原因还未确定(58,59]。Immunoelectron显微镜显示,NA定位相同的microdomains HA在感染病毒的细胞60]。没有功能荧光构造NA描述到目前为止,研究筏协会在活细胞类似于HA的实验,例如,通过烦恼。
的基质蛋白M1不包含一个跨膜域和固定在细胞膜由多种相互作用[14]。M1表示本身并不是与数字版权管理有关,但coexpression HA和/或NA M1(洗涤剂阻力增加17,18]。因此建议M1被吸引到木筏质膜的相互作用与血凝素和神经氨酸酶的胞质尾,但这种交互直接显示到目前为止还没有。然而,病毒缺乏血凝素和神经氨酸酶的胞质尾被发现有严重的装配缺陷,表现出不规则的形态,并有缺陷vRNP包装(61年]。这些缺陷是不太明显,当只有一个细胞质尾巴不见了指示两反面(冗余功能62年]。
第二个接头M基因的产物,M2离子通道蛋白质,与drm(没有联系18]。然而,M2具有两种可能的木筏目标特性,S-acylation [63年)和亲和力raft-lipid胆固醇(64年]。几个重叠CRAC图案,认为调解与胆固醇,和单酰化的网站都是位于胞质尾的两亲性螺旋M2(标签4在图1 (b))。因此建议酰化和胆固醇绑定目标的两亲性螺旋筏域但M2的相对较短的跨膜区域防止蛋白质的完全沉浸在订购越多,因此厚筏域。因此,M2是假设病毒budozone边缘的定位,参与筏聚结和调解捏了质膜的病毒粒子通过曲率诱导wedge-like两亲性螺旋插入膜(64年]。
测试可能筏本地化M2与担忧表明,分子的荧光蛋白(融合)不与double-acylated内在传单木筏的标志(65年]。然而,在GPMVs准备没有德勤,M2(部分)划分为筏域,一个属性依赖酰化,但不是完整的坚固图案。因此,原则上,M2可以筏相互作用域,而是一个浓缩liquid-ordered之间的接口和无序阶段没有被观察到在这个系统66年]。
令人惊讶的是,担心实验的结果指向一个交互(或非常接近colocalization)平方米,哈哈(65年]。烦躁信号M2与HA(荧光蛋白融合)取决于raft-targeting HA的信号和一个完整的肌动蛋白细胞骨架,加强认为皮质肌动蛋白参与的组织病毒budozone。怎么能和好,M2与raft-associated HA集群,但不是double-acylated筏标记?筏标记,表示没有哈,可能是出现在小,如果木筏,M2没有访问。HA组织更大的病毒budozone,筏子标记可以分区;M2显然与这层功能域。因此,M2必须有一个内在的目标蛋白质病毒budozone信号;这个信号可能是相同或相似的顶端(不明)信号的目标蛋白质的。病毒感染过程中,M2增加DRM和那些高胆固醇膜协会(67年]。这是最有可能的基质蛋白M1,桥梁budozone的病毒成分。
有两个报告描述的核蛋白质NP,主要vRNP组件、定位和drm顶端膜和同事,即使没有其他病毒蛋白表达68年,69年]。这个观察意味着NP包含内在顶端交通信号和救生艇协会,虽然蛋白质是亲水的,不是由脂质半个修改。然而,其他人还没有看到极化的本地化NP在转染细胞(16]。
3所示。流感病毒复制的木筏的函数
假设木筏发挥决定性的作用在几个步骤病毒复制,因此对病毒生存能力至关重要。这些步骤包括病毒蛋白的胞内运输(尤其是公顷)大会网站,子代病毒粒子的组装和崭露头角的质膜,环境稳定的病毒粒子,融合的病毒,对病毒进入宿主细胞的膜。
3.1。胞内运输的哈
HA是运送到了顶端质膜通过分泌途径。删除raft-targeting序列的外层膜跨膜区域严重阻碍Golgi-localized处理哈,如收购Endo-H耐碳水化合物和蛋白水解乳沟。相比之下,三聚的分子ER并不证明运输延迟是影响局部的高尔基体(恩格尔,德弗里斯,赫尔曼,Veit提交)。这是符合最近的模型通过高尔基体膜泡运输的组织,预测,每个池的细胞器包含两个脂质阶段,glycerophospholipids“处理域”丰富和一个“出口领域”富含胆固醇和鞘脂类。处理的酶,如糖基转移酶,主要是排除在出口领域,因此仍被困在高尔基体中,而跨膜运输蛋白优先分区到出口领域(70年]。因此,减少访问raft-like出口领域应该减速运输通过高尔基体跨膜蛋白。自第二次信号目标的HA质膜的木筏,S-acylation在胞质半胱氨酸,没有对运输的影响,假定的出口领域的高尔基有别于传统木筏等离子体膜。
膜筏也可能参与哈运输的进一步措施。这是假设在早期trans-Golgi cholesterol-sphingolipid集群形成囊泡的网络(TGN),作为这些脂质载体和裹入蛋白在上皮细胞顶端质膜(71年,72年]。这个模型表明,膜与raft-like顶端运输公顷的先决条件。的确,HA在后期获得耐洗涤剂在其运输到细胞表面,可能在TGN [73年),和降低胆固醇水平块传输的HA TGN细胞表面(74年]。然而,一些突变描述了HA的跨膜区域块与drm协会,但不是顶端运输(75年]。质膜筏的脂质含量可能不同的运输小泡。这可能是决定实验的净化HA-containing运输囊泡和分析他们的lipidome [76年]。简而言之,有证据表明,筏领域参与转发raft-associated货物运输蛋白质如通过高尔基体和TGN公顷。这是伴随着越来越胆固醇含量分泌沿途(ER <高尔基<质膜,77年])。
3.2。初露头角的病毒颗粒
这两个病毒的糖蛋白,血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA),积聚在木筏的质膜。M1然后应该弱结合血凝素和神经氨酸酶的胞质尾。齐聚反应的M1加强弱相互作用与血凝素和神经氨酸酶和吸引病毒budozone M1。平方米,大量表达在质膜上,但在很大程度上排除病毒粒子,傲慢地积累budozone的边缘。最后,vRNPs之间的相互作用和M1开始萌芽和释放的病毒粒子69年,78年- - - - - -81年]。在这个过程中,它必须确保大多数新成立的病毒颗粒包含一套完整的vRNPs。冷冻电子断层扫描显示每个病毒粒子包含一个特定模式的八个,分别明显vRNPs,高度选择性的基因组机制包装是目前支持模式82年]。短核苷酸序列相同的在每一个RNA片段,这是位于5′和3′末端的RNA,形成一个终端包装成rnp所需狭长地带结构,但各个包装信号出现在vRNP仍然需要被识别(83年,84年]。
出芽是membrane-remodeling过程需要膜弯曲曲率(感应),导致一个Ω-shaped芽的形成,紧随其后的是收缩芽的脖子,,最终,粒子的分离(断开)由于非常接近原生和融合的颈膜85年]。在整个发芽过程中,(几乎)平面等离子体膜的一部分转换为球形囊泡(高度弯曲)。自质膜往往持平,这个形状变化是一个积极的过程和所需的能源与蛋白质(必须提供的互动86年]。主要有两种方法如何在细胞膜蛋白可以诱导曲率。本质上弯曲的蛋白质或蛋白质寡聚物可以提供“脚手架”,导致膜弯曲;部分membrane-inserted蛋白质或蛋白质域可以作为“楔形”取代膜脂质双分子层只有一个传单(86年- - - - - -88年]。脂质本身可以本质上支持曲率如果他们“锥形”(如果他们表现出不同的亲水头部的横截面区域组和疏水区域)。此外,由于一个小球形病毒包含大约10%的脂质分子相比,外双分子层内双分子层(86年),浓缩的外层膜脂质(或部分消耗内在传单的脂质)在萌芽网站会帮助膜变形。最后,形成许多领域也可以帮助出芽的过程。在这种情况下,疏水不匹配和域之间的高度差会导致“线张力”域接口。最小化系统的自由能,曲率是budozone诱导的双分子层,这可能启动或支持蛋白质崭露头角的(89年,90年]。
相比其他许多包膜病毒,它仍没有明确界定的流感病毒蛋白为膜变形提供能量。实验确定的驱动力崭露头角的,也就是说,所需的最小集合的病毒蛋白质,蛋白质在细胞和脱落问题表达的“病毒样颗粒”(一种)囊泡含有病毒蛋白表达和拥有相同的密度与实际病毒大量生物化学检测。起初,M1被发现足够的车牌区域生产(91年,92年基于支架),符合一个崭露头角的模型矩阵形成的蛋白质。然而,这可能是一个工件的表达系统;在化学转染细胞,血凝素和神经氨酸酶(93年- - - - - -95年)而不是M1是足够的车牌区域的形成。值得注意的是,人们发现M1人为与脂质锚标记是针对车牌区域形成的等离子体膜,然后充分的(96年]。在病毒感染的情况下,M1可以履行这个功能被运往其他病毒膜蛋白的质膜(见上图)。其中,血凝素和神经氨酸酶也能引发自己车牌区域的形成,虽然效率提高如果M1 coexpressed [93年]。当血凝素和神经氨酸酶胞质尾突变体是包含在一种,M1未能有效地纳入一种,符合模型的糖蛋白控制病毒出芽的排序和脂质筏microdomains招聘内部病毒核心组件。必须牢记,然而,车牌区域很容易形成工件细胞倾向于不断摆脱可能“将囊泡中病毒蛋白(97年]。
木筏的角色为病毒出芽的上下文中也分析了病毒感染。切除raft-targeting信号跨膜区域的HA减少病毒生产,有更少的HA粒子纳入生产。这哈突变是随机分布在质膜,与野生型哈。因此,HA集群的木筏,如上所述,野生型哈,确保其包含在粒子和/或需要高效的萌芽(98年]。
同样,干扰素诱导细胞蛋白质viperin增加HA的横向流动减少救生艇协会和严重抑制病毒颗粒的释放(99年]。许多viperin-expressing细胞的病毒粒子表面上显示“菊花链”结构中,两个或两个以上的病毒颗粒似乎是由一条连接膜连接起来。类似(或其他)异常与删除病毒结构已经观察到病毒的血凝素和神经氨酸酶的胞质尾61年]。病毒包含哈没有两个palmitoylated细胞质半胱氨酸结合减少大量的内部组件NP和M1和还揭示了缺陷病毒释放。令人惊讶的是,交换M1蛋白的不同的病毒与流感病毒株恢复组装nonpalmitoylated公顷(One hundred.]。这个观察HA的链接棕榈酰化矩阵的蛋白质。然而,类似的实验与H7-subtype HA并未揭露一个缺陷病毒出芽,但是在病毒膜融合进入(见下文,101年])。然而,刚刚描述的累积证据清楚地表明,HA(特别是其S-acylated细胞质尾)中扮演一个重要的角色在病毒出芽。
病毒出芽的最终步骤是等离子体的病毒粒子的分离膜。最近的证据表明,这是由两亲性螺旋的M2,可能充当“楔。“代表螺旋肽诱导形成的囊泡从老爸67年]。五个疏水残基的突变影响的两亲性螺旋M2-CT病毒形状和病毒出芽[67年,102年]。然而,CRAC主题隐含在胆固醇绑定和酰化是绝对必要的病毒颗粒的生产:有病毒株的酰化网站或缺乏完整坚固图案,acylated半胱氨酸和重组病毒(103年)或部分CRAC主题(104年)取代增长同样也相应的野生型病毒和删除CRAC主题和酰化网站的同时也不影响病毒生产,至少在细胞培养(Thaa、沃尔夫·赫尔曼,Veit出版)。然而,观察病毒传染性的衰减与nonacylated老鼠对病毒(105年]和CRAC-disrupted [104年)平方米。
此外,细胞蛋白质很可能导致萌芽。endosomal排序所需的复杂的运输(ESCRT),部分参与艾滋病毒等病毒出芽,似乎可有可无的流感病毒出芽[93年,106年]。然而有证据表明肌动蛋白参与特别是丝状病毒颗粒的形成(38,107年]。肌动蛋白的聚合可以提供推力来延长生长芽。此外,内吞作用的回收GTPase Rab11最近被确定为一个崭露头角的代数余子式108年]。它随后表明Rab11(和底层膜泡运输途径)是参与胞质运输vRNPs等离子体膜(109年]。这将是有趣的解读其确切的作用方式以及识别可能的其他细胞出芽的因素。
总之,高效的流感病毒出芽的联合行动似乎是scaffold-based, wedge-mediated, domain-induced流程(见图2)。M1寡聚化可以提供一个支架,M2的两亲性螺旋楔,和两个协同工作HA-induced大规模的形成,本质上弯曲的许多领域。然而,令人惊讶的是,突变在几个蛋白质域建议对病毒出芽是必要的,如血凝素和神经氨酸酶的胞质尾和M2的大部分地区包括其两亲性螺旋,有时没有或只有温和影响病毒的复制61年,62年,103年,104年,110年- - - - - -113年]。因此,初露头角的可以被认为是一个特别强大的过程中,令人不安的影响相对不敏感或失败的众多功能。装配过程的精确性,即如何忠实地病毒所有元素都包含到一个粒子,尚不清楚。绝大多数粒子(90 - 99%)非传染性的发布表明并不是所有病毒元素已经被纳入一个功能活性形式。然而,其他原因未能启动感染,如成功的干预细胞因子,绑定到一个不合适的受体,或缺陷膜融合,当然导致高比例非感染性病毒颗粒。此外,高纯度的病毒颗粒包含各种细胞蛋白证明他们不完全排除在萌芽网站(114年]。可能高错误率的病毒出芽和出芽细胞运输小泡,否则遵循同样的原则(115年]。
(一)
(b)
3.3。病毒囊膜的稳定
早期发现,流感病毒信封包含detergent-insoluble并下令脂质总成(116年]。最近,详细比较的脂质物种存在于病毒粒子和上皮细胞顶膜的宿主细胞显示中丰富胆固醇和鞘脂类病毒膜通过筏域提供确凿的证据表明病毒芽(Mathias j . Gerl Kai西蒙斯,个人通信)。问题出现了大量脂质在信封是否只是一个非功能性的副产品病毒出芽通过木筏或他们是否为一个特定的函数在病毒生命周期的后续步骤。
最近的核磁共振研究的流动在病毒囊膜表明脂质筏脂质可能重要的机载个体间传播的病毒(117年]。脂质形成两个命令(raft-like或固体)以及无序阶段,但它们的相对比例是强烈依赖于温度。在4°C,信封几乎完全是在命令阶段,,然而,仅仅是一个重要的,但小分数在41°C。两个阶段的发生,可能造成不同的脂质总成,也许可以解释为什么血凝素和神经氨酸酶峰值并不是随机分布在病毒envelope-rather,本地集群的NA峰值,周围多公顷,观察到冷冻电子断层扫描(69年,118年]。
因此,包含大量脂质在病毒囊膜装备粒子与一个通用的系统,自动调节膜的刚度以适应各自的生理需求。出院后的病毒粒子从肺部感染者的病毒暴露在较低的温度。这导致凝固病毒囊膜保护的对环境破坏的病毒基因组。依照这个寒冷的条件有利于传播流感病毒解释其主要冬天传播(119年]。在第二个人的身体吸收后,粒子暴露在温度增加“融化”病毒的信封。液膜必须允许病毒颗粒与细胞膜融合。
3.4。膜融合的活动哈
膜融合分为几个阶段:lipid-mixing (hemifusion)和可逆融合孔隙的形成之前的最后合并病毒和细胞的细胞膜。这些事件可以通过加载分别测量红细胞鬼魂与荧光染料,染料与脂质膜或室内与水性染料,和转让后成HA-expressing细胞荧光显微镜(6,120年- - - - - -122年]。
分析可能影响膜融合的木筏,哈哈没有raft-targeting信号是真核细胞中表达,融合活动是记录为合胞体(即形成。之间,与多个核融合细胞)HA-expressing和邻近的细胞。细胞表达HA与删除raft-targeting信号的开始咯能够诱导hemifusion和全面融合,但融合事件的数量减少。病毒颗粒含non-raft公顷的传染性较弱,并且表现出融合活动下降。然而,由于这些粒子包含更少的哈,这是得出结论,而不是融合活动本身是妥协,但木筏HA集中有效融合活动(98年]。
混乱,部分不一致的数据删除酰化的影响网站的融合活动已经出版。据报道,nonacylated H1 - H7-subtype HA和B型流感病毒的HA显示限制融合孔隙形成(101年,123年,124年],nonpalmitoylated HA H2亚型透露受损的合胞体形成的125年]。相比之下,HA脱酰作用突变体相同的H2亚型,但也从H3, H7亚型介导信息融合(126年- - - - - -128年]。同样,镇定的水性染料转移到HA-expressing细胞观察鸟类H7-subtype HA在其他研究129年)和人类H3-subtype公顷(One hundred.]。然而,在所有情况下,产生影响的酰化的膜融合活动报道,已故的事件在这个过程中,也就是说,开幕式,闪烁,和/或扩张融合孔隙的影响。
膜融合被认为继续通过融合茎,脂质与某些病毒囊膜与细胞膜结构连接,脂质膜的外传单之间发生交换(120年]。可想而知,HA-bound脂肪酸可能扰乱组织细胞膜脂质在融合过程的这个阶段,这将加速融合的开放和/或扩张毛孔,让膜融合继续完成。另外,HA-bound脂肪酸可能不会直接在融合过程中,但吸引胆固醇病毒囊膜,在膜融合为一个特定的函数。
胆固醇的直接作用在膜融合在几项研究解决。提取病毒粒子降低了传染性的胆固醇,一大部分原因要归咎于一个抑制膜融合(130年]。HA-expressing昆虫细胞在一个更全面的分析,其中自然包含低胆固醇,富含胆固醇和融合了红细胞(用荧光染料标记)测量。胆固醇增强脂质混合的速度(hemifusion标记)和水的数量和程度染料转移(融合毛孔扩张的标志)。得出结论,胆固醇熔化行为都处于初期阶段,也就是说,之前融合毛孔开放,和融合毛孔扩张期间处于晚期阶段131年]。原则上,胆固醇的fusion-promoting效应可能是由于三个,不是相互排斥的,模式的行动。首先,胆固醇会绑定到HA的跨膜区域从而指导融合所需的构象变化。其次,消极膜引起的自发曲率甾醇可能促进当地的双分子层弯曲发生在膜融合。最后,胆固醇会增加HA的流动所需的膜融合毛孔扩张,增加脂质在液体状态的一部分。
混乱,部分不一致的各种酰化的影响网站上公布的数据删除HA的融合活动表明,方法不适合用于这一目的。值得怀疑的是,合胞体形成和融合HA-expressing细胞和红细胞准确反映流感病毒进入靶细胞。此外,这些方法只是半定量的和动态测量是几乎不可能的。此外,HA的融合活动取决于它的密度在细胞表面(132年),很难准确测量,在传统的表达系统无法控制。它将有助于建立一个实验融合系统组成的紧密控制量的纯化公顷(有或没有raft-targeting信号)重组为脂质囊泡病毒信封和荧光标记的真实成分脂质体作为目标膜定量分析的贡献HA-linked脂肪酸融合孔隙的形成和扩大。
4所示。结论
总之,哈哈可能通过功能在流感病毒复制“筏周期”。在高尔基体,与膜筏HA associates,可能会形成囊泡促进运输裹入顶端膜蛋白质。质膜,HA诱导病毒budozone的形成,膜nanodomain装配的病毒成分和细胞蛋白质发生排斥。所有病毒组件组装后,哈哈可能导致膜的弯曲和M2,理应吸引病毒budozone的边缘,可能调解捏的病毒颗粒。出芽病毒颗粒的混合物通过一个适当的脂质筏装备粒子从对环境的危害和保护粒子,在胆固醇的情况下,可能会促进病毒膜融合在条目。因此,木筏在功能上是不可或缺的流感病毒的复制周期,因此也许可能抗流感药物开发的目标。
确认
作者的实验室里做的功是由德国研究基金会(DFG), SPP项目1175年SFB 740和141/10,欧盟委员会第七框架计划,居里夫人初始培训网络“Virus-Entry。”