文摘

人类呼吸道合胞体病毒(HRSV)是一个组装的包膜RNA病毒从感染细胞的质膜和味蕾。核糖核蛋白复合物(RNP)必须与病毒基质蛋白和糖蛋白形成新萌芽之前感染性粒子。病毒蛋白参与HRSV组装和出口主要是未知的。我们调查的糖蛋白是否HRSV参与病毒复制的后期阶段利用重组病毒在每个单独的糖蛋白基因被删除,取而代之的是一个记者保持野生型基因表达水平。这些工程病毒允许我们研究糖蛋白的角色在装配和萌芽的传染性病毒。显微镜数据显示,F糖蛋白参与本地化糖蛋白与其他病毒蛋白质的质膜。生化分析表明,F和G蛋白的缺失影响公司的其他病毒蛋白发了芽的病毒粒子。然而,有效的病毒释放的影响删除任何单独的糖蛋白或音乐会。这些研究属性小说角色F和G蛋白在病毒蛋白定位和组装。

1。介绍

人类呼吸道合胞体病毒(HRSV)是全球领先的病毒引起严重的小儿呼吸道疾病和发病率在老年人的常见原因1,2]。目前没有可用的疫苗和唯一的治疗是一种单克隆抗体给高危婴儿(3]。疫苗研究开发和治疗设计正在进行,但一个明显的障碍是缺乏一个完整的复制周期的理解。单个病毒基因产物的作用在病毒复制的每个步骤,尤其是在病毒粒子的组装和释放,目前还不清楚。

HRSV的一员副黏液病毒科家庭,有消极意义上讲,单链RNA基因组15222个核苷酸。基因组包含10基因编码11已知的基因产物。病毒核糖核蛋白(RNP)由RNA基因组使壳体化核蛋白(N),有相关的磷蛋白质(P)和依赖RNA的RNA聚合酶(L) (4,5)以及M2-1蛋白质,参与转录持续合成(6]。病毒基因组也编码结构基质蛋白(M) (7)和三个跨膜糖蛋白,提出了表面的病毒粒子,小疏水性糖蛋白(SH) [8),附件糖蛋白(G) (9,融合糖蛋白(F) (10]。病毒的主要识别糖蛋白的功能项。所需的F蛋白融合细胞和病毒膜(11),从而使病毒基因组进入宿主细胞的细胞质中。G蛋白参与了宿主细胞附件(12)和传染性是必要的在活的有机体内在某些培养细胞类型而在其他删除对传染性(没有影响13]。SH蛋白质的作用仍不清楚,尽管它最近发现抑制细胞凋亡14,15]。病毒糖蛋白的M, N, P, L, M2 HRSV蛋白质结构和酶至关重要组成部分。如何将这些病毒组件组装形成一个新传染性病毒粒子以及如何释放病毒的宿主细胞协调在很大程度上是未知的。

HRSV组装和芽从感染细胞的质膜来获得它的信封(16- - - - - -18]。对许多地利亚来说,这已经表明,粒子释放的M蛋白是充分的,并且在某些情况下,F糖蛋白可以提高过程(19- - - - - -24]。在其他情况下,比如SV5,病毒出芽要求M蛋白,它的两个病毒糖蛋白之一,N蛋白(25]。这些研究使用瞬时转染系统分析病毒蛋白表达个人和分析对释放病毒样颗粒的数量的影响(一种)。类似的研究完成了HRSV发现M, P, N, F蛋白的形成和通道的最小要求一种包含minigenomes [26]。然而,这项研究并没有专门看发布的一种;因此目前还不清楚是否需要F蛋白只有病毒条目或条目和后续步骤导致车牌区域。

以前,我们检查的影响HRSV糖蛋白删除病毒的目标定向在极化上皮细胞(27]。这个早期的研究是一个定性的调查表明,HRSV粒子能够芽定向在缺乏这三个糖蛋白。然而,这些病毒蛋白的贡献的定量分析病毒蛋白的晚期走私、组装、释放并没有完成。在目前的研究中,三个病毒糖蛋白的作用病毒从感染细胞进行了组装和出口。首先,每个糖蛋白病毒装配的贡献进行了分析通过调查剩余病毒结构蛋白的定位在质膜上的共焦显微镜。接下来,颗粒释放的蛋白质组成细胞感染WT或糖蛋白删除HRSV生化测定的数量来确定一个或多个糖蛋白参与病毒蛋白的结合新形成的病毒颗粒。最后,每个糖蛋白的影响从感染细胞病毒粒子萌芽的效率进行了分析。

2。结果

2.1。改造的病毒

检查每个的参与在装配和释放HRSV糖蛋白,我们使用病毒之前单独设计有每个糖蛋白基因删除HRSV基因组及其子与报告基因(图所取代1)[27]。我们也利用一个与所有三个糖蛋白基因工程病毒删除(27]。由于HRSV转录是词素顺序,每个基因结由于衰减,更换任何删除基因是必要的,以保持真正的病毒基因表达水平。简而言之,在个别缺失的情况下,GFP是用来替换删除基因。当三个基因,SH、G和F,分别删除他们取代了GFP,猫,和GUS报告基因(图1)。上面描述的所有病毒不仅保持了相同数量的基因在WT HRSV但也有真正的基因间的连接保持真实的转录水平。

2.2。单一的糖蛋白删除对HRSV蛋白质的胞内定位网站的病毒装配

HRSV蛋白质必须聚集在质膜开始萌芽的RNP形成新包膜和感染性病毒颗粒释放的细胞。在极化上皮细胞,这一过程发生在顶端膜(18]。我们之前证明糖蛋白不参与定向针对病毒的病毒蛋白质释放从顶端膜发生27]。然而,在这个之前研究中使用的技术没有分析个人糖蛋白基因缺失的影响与其他病毒蛋白在细胞内组装。为了解决这个问题,colocalization水平的质膜三种糖蛋白的N蛋白,用作ribonucleocapsids标记,通过显微镜进行了分析。

A549细胞感染了WT或者个人糖蛋白删除病毒的莫伊0.2。24小时后感染细胞被固定,permeabilized,和孵化主要抗体N, SH, F, G,或者蛋白质,紧随其后的是647年和594年二次抗体共轭AlexaFluor荧光染料。共焦显微镜使用多个z平面图像(z两天)通过细胞节中描述4。因为病毒装配发生在我们关注的质膜z堆栈包含部分的受感染的细胞,所有图片所示,图中所示2(一个)。在数据2 (b),2 (c),2 (d)N蛋白所示绿色三种糖蛋白,在个人面板,显示为红色(F和N染色是图所示2 (b),G和N染色显示在图2 (c),SH和N染色是图所示2 (d))。合并面板所示的两种染色蛋白质也随着合并的放大,进一步证明colocalization在每个图像。还显示了在每个面板的数量合并colocalization量化NIH ImageJ软件(28),被描述为皮尔森系数(29日),附近的一个数量+ 1表明完美的两个生物分子之间的相关性,0表示没有相关性,附近的一个数量和一些附近−1显示生物分子的逆相关或排除。

平均14每染色细胞成像,和他们的平均皮尔森系数的量化与平均数标准误差(SEM)。如图2 (b)之间,类似水平的colocalization观察N和F蛋白在细胞感染了WT,ΔSH和ΔG病毒(皮尔森系数为0.26,0.38和0.33,分别地)。这表明SH和G蛋白组装不需要剩余的细胞表面糖蛋白和rnp。在图2 (c)类似数量的colocalization观察N和G蛋白在细胞间WTΔSH病毒感染(皮尔森系数的0.42和0.40,分别地。)而九倍降低colocalization N和G蛋白在细胞间ΔF病毒感染(皮尔森系数0.05)。这表明,F是参与的colocalization N和G蛋白在细胞表面。此外,G蛋白的分布在细胞的质膜不同ΔF病毒感染与细胞感染WT或ΔSH病毒。在缺乏F糖蛋白G蛋白有一个更多的单分散分布而不是丝状的形式出现在WT-infected细胞(cf图2 (c),细胞感染WT病毒和ΔF病毒)。Colocalization观察之间的N和SH细胞内蛋白质WT病毒感染,虽然仍处于相对较低的水平(图2 (d);皮尔森系数0.19)。略有增加,但同样低水平之间的colocalization N和SH蛋白质在细胞感染ΔG病毒(皮尔森系数0.28)。ΔF病毒感染的细胞,然而,colocalization WT大约一半的水平(皮尔森系数0.11)。因此,上述结果表明,F蛋白的缺失影响了colocalization G蛋白的N蛋白的质膜,并在较小程度上,F蛋白的缺失影响了colocalization SH蛋白的N蛋白的质膜。

接下来,我们检查删除个人糖蛋白的影响之间的水平的colocalization剩下的两个显微镜在质膜糖蛋白。A549细胞感染WT或工程病毒固定和permeabilized然后孵化主要两种糖蛋白抗体。在图3(一个),F糖蛋白所示红色和绿色所示的G蛋白。在数据3 (b)和3 (c)SH糖蛋白是显示为红色,而F和G蛋白所示绿色,分别。在每种情况下的合并面板两种蛋白质也合并的放大显示在每个图像进一步说明colocalization的程度。也显示在面板的数量合并colocalization描绘成皮尔森系数作为图的描述2。平均12每染色细胞成像,和他们colocalization显示随着平均数标准误差(SEM)。

高水平的colocalization观察之间的F和G糖蛋白在细胞感染WT病毒(图3(一个);皮尔森系数0.77),删除SH基因并不影响F和G蛋白colocalization(图3(一个);皮尔森系数0.76)。Colocalization WT - SH和F蛋白之间或ΔG-infected细胞观察以相对较低的水平(皮尔森系数的0.15和0.29,分别地;图3 (b))。之间的colocalization也观察到少量SH和G蛋白在ΔF-infected细胞(WT -皮尔森系数的0.10和0.13,分别地;图3 (c))。综合这些数据表明,删除任何一个糖蛋白并不影响其他两个糖蛋白的本地化。此外,这些数据显示,F和G糖蛋白colocalize显著;然而,SH并不colocalize F或G蛋白高度。

2.3。影响HRSV糖蛋白删除病毒蛋白的结合成新发了芽的病毒粒子

进一步审查的潜在作用HRSV糖蛋白在病毒复制周期的晚期,释放粒子是生化病毒蛋白质成分分析。A549细胞感染了WT或糖蛋白的莫伊HRSV 1.0删除。24小时后感染的细胞被放射性标记的³⁵半胱氨酸/ 16 h。包含病毒粒子释放的上层清液被离心收集和集中。分析了病毒蛋白存在于颗粒状病毒粒子通过免疫沉淀反应后SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中描述部分4。的比值HRSV结构蛋白,M, F, G, SH相对于N蛋白测定。糖蛋白中的比率相比删除病毒颗粒是WT病毒颗粒(图中找到4(一))。翻译F糖蛋白作为前体蛋白F0然后裂解为F1和F2。裂解产品F1是最有效的标签³⁵半胱氨酸/满足,所以我们量化这种蛋白质代表f .如图4(一)当细胞被感染了ΔSH病毒没有实质性差异的M G、F蛋白观察到病毒颗粒相比WT粒子。细胞感染了ΔG M和F蛋白的病毒水平WT-like释放病毒粒子;然而,SH蛋白质结合的数量下降到大约40%的WT病毒颗粒。病毒释放ΔF-infected A549细胞M蛋白的水平略有下降,在70%的WT发现病毒。最具戏剧性的差异粒子释放ΔF-infected细胞中观察到的数量合并SH和G蛋白,这WT水平分别降低到25%和30%,分别。细胞感染了ΔSH、G、F病毒WT-like M蛋白的结合。

尽管所有工程病毒含有糖蛋白删除替换报告基因,以确保WT的下游基因的转录水平(30.),细胞工程病毒感染的病毒蛋白水平也进行分析,以确定蛋白质合成的水平是影响糖蛋白的删除。确认发了芽的病毒颗粒中观察到蛋白质结合缺陷并非由于减少了大量的病毒蛋白在感染细胞,HRSV结构蛋白在感染细胞溶解产物也量化和报告的N蛋白比例。如图4 (b)的比率,SH, F蛋白的N蛋白在细胞溶解产物糖蛋白删除感染病毒相当于或大于那些WT-virus-infected细胞溶解产物。这些数据表明,G和F糖蛋白删除对SH下降的影响纳入粒子并不是由于整体SH蛋白质合成减少。

我们使用A549细胞在这些研究中因为传染性实验在不同的细胞类型表明ΔF病毒,这对病毒利用GP64条目(31日)没有给出生产HEp2感染细胞(见补充图1 (a)在网上补充材料doi: 10.1155 / 2011/343408)。我们发现A549细胞允许更健壮的比HEp2ΔF病毒的感染和Vbac细胞(32(补充图1 (a))。相比之下,ΔSH病毒的感染水平相当于所有细胞类型测试(补充图1 (b))。然而,在A549细胞离散群一个成熟的定量检测84 kD G蛋白在WT-infected细胞溶解产物是困难的。我们怀疑,在A549细胞的非均相分散性质广泛O-linked G蛋白的糖基化和低蛋氨酸含量防止检测一个离散的乐队。然而,先前的研究表明,基因转录水平并没有改变在糖蛋白删除病毒(30.),我们知道从显微镜数据在这项研究中,G蛋白染色的数量在WT -和ΔF-infected A549细胞可比数据2 (c)和3 (c))。因此,虽然我们无法证实等效G-to-N-protein比率在细胞溶解产物糖蛋白删除感染病毒相比WT-infected细胞溶解产物(图4 (b))、数据强烈表明,G蛋白质合成是删除F糖蛋白的影响。

2.4。HRSV糖蛋白参与病毒释放

因为我们观察到病毒糖蛋白的组装,我们问他们还参与其他复制周期的后期阶段,病毒释放。我们知道从我们以前的工作所需的糖蛋白没有病毒释放(27),但这些研究并没有定量研究糖蛋白的影响上删除病毒出芽的效率。解决这个问题,我们与WT或糖蛋白删除A549细胞病毒感染和量化的粒子释放病毒在细胞总数的百分之一。在感染细胞的N蛋白要么与病毒基因组形成rnp和本地化的质膜病毒装配或保持可溶性蛋白质在细胞质中。量化HRSV生产和释放病毒,我们只考虑N蛋白绑定到rnp因为这是组装成病毒颗粒的形式从质膜和味蕾。因此,我们的第一步是单独的N蛋白rnp从免费在受感染的细胞溶解产物可溶性N蛋白测量细胞内的病毒。感染A549细胞放射性标记的³⁵半胱氨酸/节中描述和细胞溶解4。溶菌产物分层的40%甘油缓冲和超离心机中描述的部分4。分数被从顶部的管(分数1)管的底部(分数4),和溶解的颗粒是resuspended缓冲区。HRSV蛋白质在每一部分通过免疫沉淀反应其次是分析12% SDS聚丙烯酰胺凝胶中描述的部分4。如图5(一个)、可溶性蛋白质如G, F1, N, P, M,和SH在分数1 - 4被发现而主要蛋白质绑定到病毒基因组,L, N, P,和M2-1颗粒。

量化的病毒从感染细胞释放,A549细胞感染了WT或糖蛋白删除病毒的莫伊1.0。24小时后感染的细胞被放射性标记的³⁵半胱氨酸/满足。上层清液含有病毒粒子释放被离心收集和集中,如前所述在[27节),4。颗粒状病毒粒子中断和HRSV蛋白质被确定通过免疫沉淀反应后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。受感染的细胞也细胞溶解和rnp由甘油沉降如上所述。RNP绑定N蛋白存在于颗粒状病毒粒子,在受感染的细胞溶解产物在SDS凝胶和量化分析。N蛋白的量存在于释放病毒显示为总额的百分之一N蛋白rnp量化溶解产物和病毒(数字5 (b)和5 (c))。细胞感染ΔSH、ΔGΔF病毒,或三重删除病毒ΔSH, G, F,没有任何病毒颗粒释放的水平下降与WT病毒感染细胞。这些发现表明病毒糖蛋白不影响病毒出口的效率。

3所示。讨论

HRSV主要结构蛋白的核衣壳蛋白(N),矩阵(M)的蛋白质,和F, G, SH糖蛋白,所有这些副质膜的病毒装配和释放。对蛋白质的需求HRSV在病毒复制的后期阶段。它已经建立了许多地利亚的M蛋白是病毒颗粒的形成所必需的(19- - - - - -25),但参与病毒糖蛋白的视。HRSV糖蛋白定义了角色在附件和条目,但描述他们的潜在角色的下游步骤复制周期困难是因为F蛋白的必要性病毒进入细胞。

在这项研究中,我们利用转基因HRSV糖蛋白基因的一个或多个被删除,取而代之的是报告基因(图1)。重组病毒缺乏使用F蛋白结合的细胞系表达GP64克服固有的病毒进入赤字F删除病毒(32]。在此前的一项研究中使用这些工程病毒我们与所有三个显示HRSV糖蛋白基因删除病毒颗粒释放特别的顶端膜极化上皮细胞(27],它证实了糖蛋白没有基本定向目标或病毒释放。然而,我们并没有解决病毒的糖蛋白的影响定量效率是否出口还是糖蛋白参与大会的其他病毒蛋白在质膜上形成新感染性病毒颗粒。

病毒从感染细胞出芽,前三个HRSV糖蛋白在质膜必须与rnp组装。确定个人糖蛋白参与大会的另一个结构蛋白,我们研究了细胞感染病毒个体糖蛋白基因删除和检查剩余的colocalization通过共焦显微镜在质膜糖蛋白。我们观察到的删除任何个人的colocalization糖蛋白并不影响其余的糖蛋白在细胞表面(图3)。使用N蛋白作为rnp的标志,我们也调查了是否删除个人的糖蛋白影响装配的糖蛋白和N蛋白在质膜上。我们发现删除的F糖蛋白大大减少colocalization G蛋白的N蛋白在质膜上。F蛋白的缺失也减少colocalization SH和N蛋白在细胞表面(数字2 (c)和2 (d)、职责)。这些数据表明,F蛋白起着未知作用在本地化病毒结构蛋白HRSV组装。ΔF-virus-infected有趣的是,我们还观察到细胞的染色模式G蛋白在质膜改变相比WT-virus-infected细胞(图2 (c),比较WT-infected G染色细胞在ΔF-infected细胞)。这些发现与之前的研究结果相一致,表明,G糖蛋白本地化病毒质膜的纤维细胞感染WT病毒,但不是在细胞感染与F蛋白的胞质尾工程HRSV删除(FΔCT) [33),进一步表明F蛋白是参与蛋白质排序在细胞表面。

一旦病毒蛋白质聚集在细胞表面,它们并入新成立的病毒粒子rnp芽从质膜。我们分析是否删除其余的能力影响的每个糖蛋白结构蛋白结合成发了芽的病毒粒子。我们发现缺乏F细胞感染病毒糖蛋白结合减少大量的G和SH蛋白相对于N蛋白释放病毒(图4(一))。这些发现与先前的观察一致,F蛋白的缺失导致了大量colocalization rnp与G和SH蛋白质在细胞表面(数字2 (c)和2 (d)、职责)。细胞感染病毒缺乏G蛋白质也包含少量SH释放病毒粒子(图4(一))。这些结果表明,F和G糖蛋白参与HRSV粒子组装。

我们使用两种方法,显微镜和蛋白质生物化学,研究糖蛋白的影响上删除病毒装配。这两个方法进一步分析装配过程分为两个步骤:在质膜病毒蛋白质的积累,这是病毒的组装,和积累的整合蛋白出芽病毒颗粒。两个实验得出的结论是,上海也没有参与病毒装配阶段WT-like colocalization水平观察之间的剩余结构蛋白在ΔSH-infected细胞的质膜,和WT-like HRSV蛋白质中发现了粒子释放。显微镜和生化数据表明,F糖蛋白是参与这两个步骤之间的装配过程是colocalization N和SH蛋白质和NΔF-infected细胞和G蛋白之间的减少相比WT-infected细胞。细胞感染ΔF病毒也减少了大量的G和SH蛋白质纳入发了芽的病毒粒子相比WT粒子。G糖蛋白似乎没有涉及病毒蛋白质的积累在WT以来的质膜和高浓度的colocalization观察之间的N, SH, F蛋白在细胞感染ΔG病毒。然而,G蛋白参与了公司的SH蛋白质进入出芽病毒粒子SH-to-N-protein下降率如图所示的粒子释放ΔG-infected细胞相比WT病毒粒子。这种二分法的原因是未知的。SH蛋白存在于一些修改和未修改的形式包括polylactosaminoglycans的修改,而这些形式以及修改的形式存在于病毒粒子(34]。会感兴趣的决定可能有一个或多个修改之间的交互形式的SH和高度糖基化的阿克蛋白质。M蛋白结合在接近WT-like水平在所有糖蛋白删除病毒,包括三重删除病毒,表明M蛋白组装到出芽病毒糖蛋白的独立。

最后一步后产生新的病毒颗粒病毒蛋白质聚集在感染细胞的质膜是出口。来确定病毒糖蛋白参与崭露头角的过程中,我们分析了删除的糖蛋白是否影响病毒释放的效率。我们发现没有任何或所有的三个糖蛋白没有有害影响的病毒从感染细胞释放(图5)。事实上,ΔF——和ΔG-infected细胞稍微增加了大量的病毒颗粒释放到上清液比WT感染细胞。我们推测,较少的糖化蛋白在病毒导致回贴的病毒颗粒细胞。这导致更少的细胞相关病毒粒子,因此在上层的病毒颗粒释放的增加。

先前的研究显示SH和G蛋白在细胞之间的交互感染WT HRSV [35)这可以解释要求G蛋白质结合的SH出芽病毒。相互作用也被证明为G和M蛋白(36)和G和F蛋白(37]。一个低聚物的复杂也在受感染的细胞溶解产物之间的F, G, SH蛋白(38]。被假定F糖蛋白与其他病毒蛋白相互作用通过其胞质尾(CT),根据研究表明,F蛋白的能力与质膜的脂质筏很混乱,F和G蛋白的定位在质膜上时改变细胞感染FΔCT病毒(33]。这些以前的研究以及本文提供的数据表明,这三个HRSV糖蛋白与其他病毒结构蛋白在感染细胞相互作用,而且,重要的是,这项研究小说的角色属性F和G糖蛋白病毒复制的后期阶段。

4所示。材料和方法

4.1。细胞和抗体

A549、州立和HEp2从美国获得的细胞类型文化集合(写明ATCC)。A549细胞生长在火腿的F12K介质(西格玛奥德里奇,圣路易斯,密苏里州)含10%胎牛血清,和州立HEp2细胞生长在杜尔贝科的基本介质(DMEM;表达载体,加利福尼亚州卡尔斯巴德)含5%胎牛血清。Vbac细胞(维洛细胞表达了杆状病毒GP64蛋白质携带HRSV F COOH-terminal残留563年至573年)在[前面描述的32]。单克隆抗体(mab) 19日和29日提供的杰拉尔丁•泰勒(动物卫生研究所,康普顿,英国),就像牛多克隆抗体对所有HRSV蛋白质,R45。mAb15,单克隆抗体是由詹姆斯·斯托特(动物卫生研究所,康普顿,英国)。兔子anti-SH完他所提供的抗体(乔治亚大学)。AlexaFluor-conjugated二级抗体来自分子探针(加利福尼亚州卡尔斯巴德)。

4.2。传染性HRSVs的互补和恢复建设

所有的互补都由HRSV A2应变。互补工程含有糖蛋白基因删除这些研究建立了如前所述在[27,30.,33]。简单地说,使用标准克隆技术,建立了向量缺乏G和F跨膜糖蛋白开放阅读框(ORF),包含EGFP ORF相反,如图1。所有HRSV orf维持在原来的基因组位置保持表达谱相似的野生型病毒。一代的野生型(WT)重组病毒,向量包含了真实的SH, G和F子,没有标记蛋白质羊痘疮。每个向量中包含的子被真实HRSV分离基因间的连接和两侧独特的限制性位点工程师协会我和Asc即使用匹配工程师协会我和Asc我限制网站,向量被克隆到一个SH / G / F-deleted cDNA骨干。这些工程的互补筛选通过限制性内切酶分析,和所有修改的区域是由核苷酸测序验证病毒之前恢复。

传染性病毒在[恢复cDNA如前所述31日]。值得注意的是,为了减轻选择压力可能造成的影响基因置换,一个嵌合质粒编码VSV病毒G蛋白是包含在最初的转染,和Vbac细胞被用于病毒扩增。病毒rna病毒从感染的细胞工程在通道3,rt - pcr放大,选择区域的序列被大量核苷酸序列分析验证。没有发现变化。病毒在段落股票3到5是用于描述的实验。

4.3。病毒感染

HRSV细胞的感染是由吸附病毒细胞为1.5 h 33°C,其次是去除剂和洗细胞一旦增长媒体在33°C,然后继续孵化24 h或48 h,这取决于试验。

4.4。免疫荧光染色法和共焦显微镜

A549细胞被镀在无菌盖玻片6-well板块(BD生物科学,加州圣何塞)。细胞被感染改造病毒的莫伊0.2和进一步孵化33°C。感染后24小时,细胞被洗过两次的PBS和固定的3.7%多聚甲醛(PFA)磷酸盐(PBS)在室温下15分钟(RT)。细胞与PBS洗两次,permeabilized triton x - 100, 0.02%阻塞在1% BSA 10分钟,并沾染了以下主要抗体稀释0.1% BSA: F mAb19 1: 5000;G mAb29 1: 2000;N mAb15 1: 15000;兔子anti-SH 1: 200 1 h rt,细胞与PBS洗两次,与1% BSA阻塞,并与二次孵化antimouse或antirabbit抗体共轭AlexaFluor 594或647(表达载体)的稀释1:1000 30分钟在rt,当costaining主要抗体从相同的主机,顶端标签工具包(英杰公司)直接使用共轭主抗体AlexaFluor 647。细胞被洗两次与PBS和沾染了赫斯特染色(分子探针)在PBS 0.05毫克/毫升。细胞与PBS洗了三次,安装在幻灯片,并存储在黑暗中在4°C。照片拍摄在蔡司LSM 510 -紫外线共焦显微镜使用40或100 x的目标。 1 μ米z通过每个单元两天拍摄,质膜堆栈顶部被送往可视化HRSV大会的网站。等离子体膜含有部分被确认为最顶端堆栈包含持有焦点的染色和不可见核染色。

质膜堆栈顶部的荧光测定的数量确定的水平之间colocalization N和每个糖蛋白或两个糖蛋白。定量的像素是用ImageJ JACoP插件(39]。阈值为每个波长测定JACop使用成本自动阈值(40),和colocalization像素的数量高于阈值确定和报告为皮尔森系数()±标准平均误差(SEM)。

4.5。病毒装配和释放化验

A549细胞被镀在60毫米菜(BD生物科学)和孵化在37°C。大约6小时后,被感染的细胞工程病毒在1.0和孵化的莫伊33°C。24小时后,细胞放射性标记的使用³⁵S半胱氨酸/认识反式混合(威斯康星州麦迪逊Promega)和孵化33°C。16 h后上层清液包含发布病毒从细胞单层很仔细,放入2毫升管。上层清液离心机在750 g×4分钟颗粒细胞碎片。含有病毒颗粒的上层清液被转移到一个新的1.5毫升管和离心机在1500 g×30分钟,脆弱的速度,允许HRSV粒子集中,仍然保持传染性(27]。我们确认这个造粒方法集中病毒粒子与一个糖蛋白或两个糖蛋白删除,以确保粒子与降低密度仍然颗粒状的低速(数据没有显示)。病毒颗粒在0.1毫升resuspended裂解缓冲NP40组成的1%,0.4%去氧胆酸,66毫米EDTA,和10毫米Tris-HCl, pH值7.4。整个成交量牛多克隆抗体孵育R45 1: 100稀释+兔anti-SH抗体在1:25 + anti-G mAb29 1: 100一夜之间在4°C。与此同时,受感染的细胞单层膜与PBS洗一次然后在裂解细胞溶解缓冲区(如上所述)。溶菌产物被收获到1.5毫升管,孵化冰7分钟,涡30秒。细胞核被移除,在14000转离心1分钟。RNP-associated蛋白被颗粒状通过超速离心法40%甘油垫在190000×在4°C g 2 h。丸resuspended在0.1毫升裂解缓冲和孵化R45抗体在1:100稀释一夜之间在4°C。第二天,25μL (G蛋白琼脂糖(通用电气医疗集团,皮斯卡塔韦,新泽西)添加到每个溶菌产物+抗体和释放病毒抗体和孵化至少1 h在4°C。免疫沉淀反应是洗3 x NP-40洗缓冲区组成的1%,0.5%的医生,0.1% SDS, 150毫米氯化钠,和10毫米Tris-HCl, pH值7.4,然后煮3分钟25μL 2 x减少Laemmli缓冲区。所有的样品都在12%聚丙烯酰胺凝胶电泳。凝胶是固定的,干,暴露在电影和phosphorImage屏幕。蛋白质含量从phosphorImage扫描量化模型860风暴扫描仪和ImageQuant软件(分子动力学)。

确认

作者感谢Wertz实验室的成员在准备论文的有益的讨论。具体来说,他们感谢蒂娜雅各在实验室和技术援助Djamila Harouaka批判阅读的论文。这项工作是支持的公共卫生服务授权AI20181 g . w . Wertz NIAID的美国国立卫生研究院。

补充材料