深入全球分析转录丰度水平猪肺泡巨噬细胞感染猪繁殖和呼吸综合症病毒

文摘

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是一个主要的病原体的猪世界,造成相当大的经济损失。识别特定的细胞或激活信号通路与PRRSV复制和巨噬细胞功能的变化可能会导致新基因的识别目标的控制PRRSV感染。基因表达系列分析(SAGE)被用来创建和转录组的调查在体外mock-infected和PRRSV毒株vr - 2332感染猪肺泡巨噬细胞(PAM)在0、6、12、16、24小时后感染。转录组数据表明转录丰度的变化发生在PRRSV-infected PAMs感染超过590后随着时间的推移,独特的标记与识别水平显著改变转录丰度()。引人注目的是,先天免疫基因(转录丰度通常是改变以应对其他病原体或侮辱包括引发,亚兰,和il - 1β)没有或很少改变感染后在任何时间点。

1。介绍

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的病原体猪生殖与呼吸综合征(PRRS)在猪,是一个成员Arteriviridae家庭的顺序Nidovirales。猪行业全球PRRSV造成重大损失1)由于生殖失败(晚期流产和死产)怀孕母猪和呼吸道疾病(肺炎)在托儿所和种植者/完成猪(2]。PRRSV感染也容易使猪感染细菌病原体以及其他病毒病原体(3- - - - - -7]。临床疾病引起的PRRSV高度变量,从温和的,任何年龄的亚临床感染急性死亡的猪(8]。毒性的差异归因于许多因素包括主机遗传学、管理实践和病毒株异质性(9- - - - - -16]。

相对很少有人知道PRRSV和宿主细胞的相互作用。主细胞PRRSV的目标是猪肺泡巨噬细胞(PAM) [17,18]。PRRSV复制已被证明在腹膜巨噬细胞不同程度肺血管内巨噬细胞、II型pneumocytes,睾丸生殖细胞,PAMs [19- - - - - -22]。马克- 145细胞,一只猴子肾细胞系,用于这种挑剔的病毒在传播文化。确定了一个假定的细胞表面受体,可能导致PRRSV的倾向容易感染这些细胞。sialoadhesin CD163蛋白,硫酸乙酰肝素已报告扮演重要的角色在帮助PRRSV附加和内化成细胞(23]。

PAM的主要功能是对抗细菌侮辱的终端气道内肺,在某种程度上,通过调节肺泡的本地主机的免疫反应。报告显示猪PRRSV感染有较高的并发或继发细菌感染23,24]。这使得调查人员检查由PAMs PRRSV感染细菌造成的影响(25- - - - - -28]。研究报告了PRRSV感染显著降低生产超氧化物阴离子和hypohalous酸,两者都有助于PAMs杀灭细菌的氧化能力25]。另一份报告(29日]证明了PRRSV感染导致细胞毒性PAMs导致吞噬吸收减少40%大肠杆菌。的具体机制(s) PRRSV感染改变PAM函数是未知的。据报道PRRSV感染PAMs导致降低记录大量的促炎反应细胞因子包括TNF -α,il - 1α,MIP-1β(30.]。然而,其他研究显示,肿瘤坏死因子-α,引发,IFN -α,il - 1β成绩单不显著改变PRRSV感染(31日- - - - - -35]。因此,目前尚不清楚这巨噬细胞基因PRRSV感染的影响。

一项研究试图更好地理解改变记录大量的PAMs根据PRRSV感染差异显示逆转录PCR用于识别宿主细胞基因反应PRRSV感染PAMs在24小时内(35]。四个记录发现,特别对PRRSV感染和诱导在活的有机体内在组织PRRSV持续驻留。的四个记录确认,这三个来自识别基因和第四仍然是一个新颖的表达序列标签(EST)。这三个基因识别mx₁(myxovirus阻力),UBP(泛素蛋白酶),和RHIV-1 (RNA解旋酶)。可能还有更多,有待发现,基因差异应对PRRSV感染。

各种研究技术提供可能看对感染细胞过程和响应全面和公正的方式(36]。结合有针对性的方法如基因淘汰赛中,基因转移,目标超表达和其他方法,现在可以解剖通路和网络的基因,蛋白质和小分子定义细胞功能。技术已经开发,允许高通量转录丰度的量化。最突出的是各种形式的固相微阵列杂交(37)和基因表达系列分析(SAGE;(38,39])。从这些方法中得到的信息可以被利用在很多方面包括诊断试剂的发展,了解疾病背后的分子机制(s)和制定干预方案抑制或减少感染和消极的结果。圣人已经被广泛地用于评估转录丰度变化的实验系统。近600000的可用性猪和牛est序列在NCBI数据库超过100万大大增加的效用鼠尾草这些物种基因表达研究。圣人也被用于基因发现和启用识别以前没有已知的基因的表达在粒细胞(40),在识别潜在的新细胞表面的诊断标记星形细胞瘤(41]。

这是我们假设PRRSV感染PAMs改变正常转录组的方式,使病毒复制,就是说,正常的宿主免疫反应。这里我们报告一个转录丰度水平的综合评价在未感染和PRRSV-infected PAMs作为最初的一步一个更全面的对PRRSV发病机制的理解。尽管微分转录后的全面理解和转译后的反应PAMs还有待确定,改变转录组检测模式识别PRRSV的毒性机制,可能导致延迟或缺乏保护性免疫反应和病毒的持久性。

2。结果

2.1。基因表达系列分析

细胞总RNA制备在体外PRRSV-infected PAMs在0、6、12、16和24小时后感染,mock-infected PAMs在0和24小时。五个圣人图书馆是由0小时mock-infected 6, 12、16和24小时PRRSV-infected细胞。库随后被测序获得大约100000标签,除了感染24小时图书馆,测序近200000标签(表1)。五个圣人库产生643255测序标签被用来填充改性Identitag数据库。SAGE数据的检查表明,转录丰度有重大变化发生在PRRSV-infected PAMs基于超过590独特的标记与显著改变转录丰度(Bonferroni调整)。表1总结了这些库的一般统计。标签的频率1不考虑量化的目的,因为他们可以代表工件排序或圣人的过程(42]。

2.2。功能分类记录和丰富的变化

获得更大的理解细胞反应PRRSV,确认成绩单与生物过程进一步分类,定义的基因本体联盟(http://www.geneontology.org/),根据创新路径分析(IPA)数据库(智慧系统,http://www.ingenuity.com/)。费舍尔的确切的测试是用来计算每个生物功能分配到的概率值确定数据集由于单独的机会。转录丰度差异高级功能组中观察到的第一个24小时PRRSV感染比较。细胞运动,它描述了与运动相关的细胞功能和细胞定位,显著调节差异表达记录中第一个6 h p。细胞间信号和互动,描述功能参与细胞间的相互作用,包括功能与特定的细胞参与信号和交互的组件,巨噬细胞功能的一个重要方面,包括最显著衰减,差异表达记录。我们的兴趣是在那些影响PAM功能的表达变化;尤其是在先天免疫方面,抗原呈递,内部和细胞外信号。

2.3。检测病毒RNA转录

分析数据显示标签的存在源于PRRSV毒株感染产生的记录;从而确认该病毒感染了PAMs。PRRSV产生3′co-terminal subgenomic rna,因此所有病毒rna有相同的标签(43]。病毒标记,没有检测到mock-infected图书馆,首次出席6小时π和数量增加到最高点后12小时下降(表1)。这些数据被实时PCR验证(数据没有显示)。有一个高水平的病毒RNA在感染细胞在感染后12小时,在腺苷酸RNA病毒RNA占到近10%的在这些细胞。病毒RNA的数量下降了24小时小时后感染可能因为RNA转录复制/下降,病毒RNA的降解,释放病毒从细胞或三者的结合。

2.4。实时PCR验证记录丰富的水平

感兴趣的基因的转录丰度的变化验证使用实时逆转录酶聚合酶链反应(RT)(图1)。在这项研究中,β2-microglobulin被发现有稳定转录水平测试(图1(一))和被选为内部控制所有实时rt - pcr检测。

实时rt - pcr扩增的细胞记录之前证明有改变转录丰度水平PRRSV感染是为了确认感染后按预期进行(图1(b))。正如所料,记录编码蛋白质mx₁和rHIV (RNA解旋酶)显示6.4 - 24小时π和增加4.8倍,分别(图1(b)),诱导0到12 h postPRRSV-infection [35]。记录的编码il - 1的促炎的蛋白质α和亚兰(巨噬细胞炎性蛋白质,MIP-1β)拒绝在丰富如前所展示了44]。mx₁记录的标签标识在16和24小时感染圣人库但是在非常低的水平,因此无关紧要的SAGE数据的标准化。

总的来说,上述实时rt - pcr验证,除此之外没有显示,有高度的相关性SAGE数据,从而提供他们的信心,让每个库的标签的数量是准确的表示在这些PAMs转录丰度水平。这表明额外的圣人的验证库实时PCR并不是必要的。

2.5。记录编码免疫反应的蛋白质

有一个一般的细胞因子和趋化因子数量的下降,成绩单,表明没有诱导表达,预计将在病毒感染的先天免疫反应。圣人揭示转录丰度降低il - 1α和il - 1β(表2(一)和2(b))。咆哮,MIF MCP3 CXCL5,显示增加转录在感染(表2(a))。MCP3, CXCL5显示增加只有在感染过程中,虽然CXCL8(引发)在感染的早期显示增加转录然后衰变(表未感染水平2(a))。有趣的是,有两个标签确定CXCL8表达与表现出类似的模式。促炎细胞因子CXCL8和CXCL5 neutophils化学引诱物,il - 1α和il - 1β是重要的促炎细胞因子,在感染早期预计将增加。il - 1α和il - 1β促进各种白细胞的浸润通过诱导趋化因子生产和增加各种间充质细胞粘附分子的表达和postcapillary小静脉内皮细胞。

记录的增加数量的细胞色素p450 3 a29 BNIP3 (proapoptotic蛋白)和GRP78(内质网伴侣蛋白)也证实了(图1(c))。的转录水平的变化的编码的蛋白质参与国防和先天免疫反应也验证(图1(c)、表2)。变化的记录编码CCL3 (MIP1 -水平α),CXCL8(猪引发)和il - 1β被发现是非常接近,这表明由圣人下降随着感染的进展。感兴趣的额外成绩单,编码il - 6,圣人数据库中不存在代表。有趣的是,记录编码il - 6(没有不编码标记国民三世限制网站的记录),因此,它没有被圣人。唯一的信息在这些细胞il - 6转录丰度水平得到实时rt - pcr。这揭示了一个急剧下降的il - 6记录在第一次由PRRSV感染后24小时(图1(c))。

2.6。额外的通路和功能

数据评估的迹象激活细胞内信号或其他途径PRRSV-infected PAMs。标签来自记录编码主要蛋白质组成AP-1即早期转录复杂被确定(表2(c))。标签对应c-jun,junB, junD和c-fos记录显示丰富的水平下降,下降到最低水平在12小时和24小时显示出一些反弹的π。这些数据表明,没有明显的诱导AP-1 PRRSV-infection后信号通路。同样,激活NF -κB(表没有被观察到2(c))。样子,NF -的负面调节器κB以及基因转录激活NF -κB, SAGE数据显示无显著变化。有趣的是,我κBα显示在转录丰度稳步下降24小时π在我κKα没有显示出显著变化的实验。toll样受体4 (TLR4)的激活的细胞表面受体识别细菌细胞膜脂多糖,结果激活下游的NF -κb .记录编码TLR4显示稳步下降过程中PRRSV感染(表2(c))。

一个有趣的发现是,精氨酸酶转录水平的大幅增加6小时π,rt - pcr和SAGE数据紧密地互相模仿(图1(c))。此外,共有四个不同的标签,可能代表不同的mRNA的物种,被发现了来自arginase-encoding成绩单;所有显示转录丰度增加6小时π(表2(c))。用于验证设置的底漆精氨酸酶转录水平放大序列中找到记录的编码序列,因此,实时PCR扩增的结果序列从所有四个记录。6小时π时间点检查这里只代表一个“快照”的细胞,所以不知道完整的表达模式。

3所示。讨论

导出目录报告的表达基因在这里代表了第一次尝试生成综合分析PRRSV-infected PAMs丰富档案记录。在感染后不同时间点。允许检测获得的丰富的信息改变转录的基因在正常猪肺泡巨噬细胞生理学,以及基因的转录丰度改变了PRRSV感染。

一个动物的能力应对特定的外交特点或病原体的分子模式是先天免疫的一个重要方面。这是第一次,一般快速一步响应病原体的入侵和保护性免疫反应的开始。很重要的是,这种反应开始迅速和充分的时尚阻止入侵者和终止感染的传播。在许多情况下,病原体具有能够抑制或阻止眼前的先天免疫反应,从而使其先发优势。破译的中断机制先天免疫反应是相当大的重点研究和开始提供答案的不同意味着病原体用来实现这一目标。这里的重点是辨别PRRSV如何抑制感染PAMs先天免疫反应。本研究产生的转录资料未感染和PRRSV-infected PAMs提供洞察的抑制病毒在宿主转录丰度水平所必需的一个强大的免疫反应。这项工作已经导致巨噬细胞转录丰度在正常细胞的特性以及转录丰度变化与进步PRRSV发生复制。特异性转录丰度变化被发现提供了有趣的线索背后可能的机制免疫抑制和缺乏一个强大的先天和适应性免疫反应。功能基因组分析纯PAMs刚获得健康猪群显示PRRS病毒未能引起显著增加(> 2倍)免疫相关基因的转录。 The character of the innate immune response to a virus is thought to dictate the quality of the adaptive immune response that ensues. Given the key roles that the cytokines produced by cells of the innate immune system, play in the development of adaptive immunity, clarification of the pathways responsible for modulating their generation during the initial innate immune response to PRRSV could have important implications in the development of effective vaccines against this major pathogen of swine. The results obtained in this project helped us understand that the unique character of the innate immune response to PRRS virus is likely to be influencing the quality of adaptive (acquired) immune response to this virus. Thus, the knowledge derived from this study will contribute to the elucidation of the molecular mechanisms controlling the development of adaptive immunity in swine to PRRS virus and will allow for the rational development of effective vaccines against this pathogen.

以前的工作已经演示了13个基因的转录丰度差异与未感染PRRSV-infected PAMs [33,35,45,46]。最近,Genini et al。47PAMs感染体外的异形基因表达与欧洲Lelystad PRRSV毒株的生物相似但不同的血清学属性从北美vr - 2332隔离48),在12 h p。利用一个Affymetrix 24 K猪芯片阵列。在Genini的研究中,统计方差分析显示微分表达式的1409个基因(方差分析)。申请截止后阈值基于PAMs感染和控制之间的叠化1.5,148个基因表达有差异与控制(47]。在我们的研究中,大于590显著()转录丰度的变化水平。

转录组数据分析基因本体的上下文中允许我们把生物功能分化转录丰度数据集。的值和分数计算异丙醇作为进一步研究的出发点和作为rough guides识别重要的流程或通路的影响实验。但是请注意,函数值表现出很少或根本没有意义的变化从一个时间点到另一个可能会改变。

然而,本研究的一个重要方面是没有什么改变,而是没有什么。特别感兴趣的是明显缺乏明显的先天免疫反应PRRSV-infected PAMs。这是证实缺乏趋化因子和细胞因子基因转录增加通常观察到增加与其他病原体感染。这些包括CCL3,亚兰,TNFα1型干扰素,促炎趋化因子和细胞因子。

PRRSV感染初期,PAMs病毒的主要靶细胞。是未知信号是必要称之为免疫系统采取行动。最有可能是细胞因子,特别是那些发起白细胞的迁移和活化。斯派格et al。49)显示,甲型流感病毒有选择性地诱导单核leukocyte-attracting趋化因子MIP-1, MCP-1,咆哮和抑制neutrophil-attracting趋化因子引发和GRO -α。在这项研究中,我们已经表明,PPRSV不激活肺泡巨噬细胞炎性反应而抑制1型干扰素生产和凋亡通路。没有激活的PAMs降低il - 1所示α、il - 6、引发。Knoetig et al。50)表明,il - 1从CSFV-infected巨噬细胞释放。例如,引发免疫细胞的一个重要chemo-attractant,而il - 1和il - 6 ' B -对感染细胞和t细胞反应。趋化因子CCL3 (MIP-1α),亚兰(MIP-1β),咆哮,MCP1、MCP3 MIP3 chemo-attractants和炎症介质的占据很重要在活的有机体内(51]。合成后细胞因子mRNA半衰期较短,快速减少mRNA水平几小时后的病毒表明快速细胞内细胞因子mRNA退化或抑制转录。病毒复制和蛋白质合成已被证明开始10 - 15 hπ(52)(尽管圣人显示病毒rna在6小时π)的增加,表明增加15 h后细胞因子mRNA水平π是由于复制病毒的存在。同样的,我们没有激活NF -κB,表明缺乏这些基因的转录激活。转录因子NF -κB是一个中央监管机构记录大量的促炎基因和许多病毒操纵NF -κB通路,从而抑制的抗病毒反应或预防细胞凋亡53]。

发现精氨酸酶基因转录的急剧升温,6小时π感染后早期的事件可能会提供一些线索,抑制一个先天免疫反应。精氨酸酶与一氧化氮合成酶(NOS)衬底精氨酸对一氧化氮(NO)的生产。没有在许多病理生理的过程中是一个重要的早期信号。早期抑制生产会影响下游的事件。增加精氨酸酶的转录丰度可以调节巨噬细胞中没有生产和影响下游免疫反应(54- - - - - -56]。

4所示。结论

完善,许多病原体引起特定基因表达的变化,保护主机和清除感染。这种类型的反应是没有看到在这些PRRSV-infected PAMs。特别感兴趣的是最小的相关基因的表达在吸引其他免疫细胞的感染。此外,没有引起炎症反应基因。这是第一个全面研究显示免疫反应的抑制PAMs PRRSV。然而,结果也给我们线索这背后的机制(s)抑制。有特定的细胞蛋白质,控制保护基因的表达和未来研究的基因,转录丰度、蛋白质含量和蛋白质功能将提高我们理解PRRSV感染猪巨噬细胞之间的交互。可能的结果可能包括识别的毒性机制,开发诊断化验和理性的疫苗设计更有效地限制病毒的复制和传播。

5。方法

5.1。细胞和病毒

主要PAMs分离、培养和感染,如前所述[57]。短暂,PAMs收获从三个临床健康,PRRS-negative国债6 - 8周的年龄。动物是人道的安乐死,动物保健和使用协议后,在无菌条件下,PAMs收获。PAMs被PCR对猪圆环病毒和测试支原体spp [58,59),免费的。PAMs整除的冷冻和储存在液氮。典型的收益率10⁸-10年⁹PAMs可行性> 95%。立即使用之前,PAMs解冻,PAMs决心的可行性被台盼蓝染料排斥85%到90%。可行PAMs培养在37°C, 5%的公司₂在杜尔贝科修改鹰媒体5%胎牛血清(的边后卫;Gibco-Invitrogen,卡尔斯巴德,CA)和1%的抗生素/ antimyotic (Gibco-Invitrogen) 2小时。PRRSV毒株vr - 2332 (60)股票在马克- 145细胞传播(61年)和存储冻结在−80°C到使用。

5.2。感染和RNA隔离

PAMs孤立从三头猪被单独维护。所有三个处理组PAMs都是完全相同的。在文化建立PAMs之后,细胞被感染了PRRSV毒株vr - 2332。附近实现同步感染,烧瓶包含附着PAMs被感染,感染复数(MOI) 10在4°C冷冻媒体和孵化1小时允许病毒绑定,而不是进入细胞。预热媒体添加和细胞放置在37°C, 5%的公司₂直到为RNA分离收集。细胞总RNA制备使用试剂盒RNeasy迷你包(试剂盒,瓦伦西亚,CA),根据制造商的指示,从每个PRRSV-infected PAMs瓶(0)6、12、16、24小时后感染。细胞总RNA从mock-infected PAMs收集在0和24小时。

5.3。圣人图书馆建设

圣人库建立了如前所述[62年)使用国民锚定酶III。每个库是由池总RNA的克分子数相等的数量从每个猪在每个时间点。圣人库提供的人口意味着每个时间点的转录丰度水平。圣人被放大,使用高通量测序克隆测序管道ABI 3730自动测序仪和ABI化学(应用生物系统公司公司,促进城市,CA)。圣人与标签库数量提交基因库地理并加入GSE10346数量。

标签来自原始序列的数据库数据分析了身份标签的成绩单以及它们的相对丰度。标签序列测序错误纠正使用R和sagenhaft [63年]。库总标签被规范化。相对丰度计算是基于标记的次数代表是在给定的圣人图书馆(64年]。标签被映射到成绩单和基因完全正则表达式匹配序列在基因库,哈佛基因指数,和猪表情数据库(日本)数据库和解析成一个修改Identitag数据库(65年]。多维统计检验:Audic和Claverie成对测试;确切概率法;Greller和托宾测试;R测试和成对和通用卡方测试(66年)被应用于确定哪些标签数量的变化显著。确切概率法是适合检测基因表达的差异在处理成对比较。圣人库相互比较来识别常见的转录丰度或微分模式。学者注意到那些记录转录丰度变化可能影响PAM功能;尤其是在先天免疫方面,抗原呈递,内部和细胞外信号。

5.4。实时rt - pcr验证

验证结果和确证的改变转录丰度水平分析了实时一(rt - pcr)的个体样本100 ng总RNA从每个猪在每个时间点。实时rt - pcr是在25日完成μL反应第三卷使用上标铂SYBR绿色一步存在工具包(表达载体,卡尔斯巴德,CA)根据供应商的规范。引物组用于分析如表所示1。引物都是在200海里。PCR循环条件95°C 15分钟紧随其后40 94°C的周期为10秒,60°C 30秒和72°C 30秒使用一个内髓2荧光thermocycler (BioRad, Inc .,大力神,CA)。放大产品的最终分析是由融化曲线在PCR反应是加热的速度从50到94°C 0.5°C / s。等于放大目标动力学和参考基因(β2-microglobulin)经所述串行稀释67年]。量化的mRNA水平计算使用2^−ΔΔCt方法,它表达了信使rna在细胞治疗相对于模拟感染细胞后正常化β2-microglobulin (β2米)(68年]。实时PCR和SAGE标签计数比较,β2-microglobulin (β2米)担任内部控制,SAGE标签的数量β2 m来源于这个库和实时PCR的扩增曲线被认为是相等的。

作者的贡献

l·c·米勒:研究概念、数据收集和分析,研究设计,手稿写作。j·d·尼尔:研究概念、研究设计、生产圣人图书馆建设,手稿。g . p . Harhay:研究设计,圣人数据库建设、生产数据分析,手稿。k . m .啤酒:病毒股票、数据收集、手稿生产。w·w·Laegreid:学习概念、手稿生产。m . e . Kehrli:学习概念、手稿生产。所有作者阅读和批准最终的手稿。

免责声明

本文中提到的贸易名称或商业产品是专为提供具体信息,并不意味着美国农业部推荐或认可。美国农业部是一个平等机会提供者和雇主。

确认

这项工作是支持的,在某种程度上,通过国家猪肉委员会的资助j·d·尼尔和l·c·米勒(NPB # 06 - 122)。我们要感谢w .造木船的匠人,波尔和r . Steeves技术援助,美国黑轮的秘书协助准备手稿。作者还要感谢他的帮助在注释达雷尔•贝勒斯博士圣人库。

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