从猎鹰身上分离高致病性H5N1禽流感病毒(法尔科cherrug)在中东

摘要

越来越多的证据表明，猛禽易受高致病性禽流感病毒的致命感染。本研究对2005年和2007年分别从沙特阿拉伯和科威特死隼中分离的2种HPAI H5N1病毒进行了抗原、分子、系统发育和致病性研究。系统发育和抗原分析将这两个分离株归为进化枝2.2(青海样病毒)。然而，病毒似乎是通过不同的飞行路线向西传播的。目前尚不清楚这些病毒是如何在2005年爆发后从青海迅速传播的，以及它们是如何被引入这两个国家的猎鹰的。一些人认为，中东的H5N1疫情是由野生候鸟介导的。然而，由于非法进口活鹌鹑来喂养运动隼，它们可能面临额外的风险。

1.介绍

猛禽感染高致病性禽流感(HPAI)仅在个别病例中有报告。2000年，Manvel等人报道从游隼中分离出HPAI H7N3 [1］．另一种H7亚型高致病性禽流感病毒于2000年在意大利家禽中爆发期间在一只Saker猎鹰中发现[2］．香港发生了一系列案件。二零零四年一月，香港当局证实一只游隼因感染H5N1病毒而死亡[3.，4］．2006年3月，在另一只游隼身上发现高致病性H5N1病毒[5］．最近一次是在2008年3月，一只被发现患病的野生游隼证实感染H5N1病毒[6］．在比利时，两只冠鹰(Spizaetus nipalensis)，被发现从泰国走私往一个商业猛禽养殖场，并感染高致病性禽流感病毒，被当局宰杀[7］．科威特于2007年2月报告了39例H5N1感染确诊病例;在科威特南部的一个动物园和一个农场，20只受感染的鸟是猎鹰，其余的是关在户外的家禽[8，9］．沙特阿拉伯于2006年1月报告了首宗经证实感染致命高致病性H5N1病毒的个案[8］．2007年11月，沙特阿拉伯Al-Kharj地区的一个农场爆发H5N1禽流感，导致1500只鸡死亡，该地区位于利雅得以南约150公里处[8］．沙特阿拉伯或科威特迄今未报告人间病例。

感染高致病性H5N1病毒的猎鹰数量不断增加，表明它们对这些病原体敏感。由于许多猎鹰物种是迁徙的或占据广泛的领土，受感染的猎鹰可能会促进禽流感病毒在国家内部或国家之间的传播。最受研究的隼类是游隼(法尔科peregrinus)和萨克隼(法尔科cherrug)，只吃活的中型鸟类，如鸽子、水鸟、水鸟和鸣禽[10，11］．部分猎物对高致病性H5N1感染的易感性[12增加了病毒传播给猎鹰的风险。游隼能高速飞行和俯冲，长期以来一直被用于中东地区的训鹰运动。虽然仍然没有直接证据表明病毒从猎鹰传播给人类，但猎鹰狩猎的做法使猛禽与人类密切接触，从而增加了传播给人类或家禽的风险。

目前尚不清楚2005年中国西部青海湖爆发后，高致病性H5N1病毒是如何如此迅速地向西传播的，也不清楚中东的猎鹰是如何感染高致病性H5N1病毒的。为了获得可能回答这些问题的信息，我们对从该地区死亡的雌性萨克隼分离出的两种高致病性H5N1病毒进行了特征分析:A/Falcon/Saudi Arabia/D1795/2005 (Fa/SA/05)和A/Falcon/Kuwait/D286/2007 (Fa/KW/07)。据推测，在沙特阿拉伯死亡的这只猎鹰在过去2年里一直待在沙特，很有可能在这期间一直被囚禁。这只猎鹰在生命的最后两天失去了食欲，排出绿色的粪便。它已证实死于H5N1禽流感病毒[8］．不幸的是，没有关于在科威特发现的猎鹰死亡的信息。2005年11月和2007年2月，从这两只猎鹰身上取出的器官分别被送往阿拉伯联合酋长国迪拜的中央兽医研究实验室。

2.材料和方法

2．1．病毒和细胞

H5N1分离株Fa/SA/05和Fa/KW/07是从阿联酋迪拜中央兽医研究实验室获得的，并储存在圣犹大儿童研究医院的流感病毒库中。所有实验均在美国农业部批准的生物安全级别(BSL) 3+控制设施中进行。将田间样品接种于10日龄鸡胚蛋的尿囊腔中，并在35℃孵育，制备种鸡病毒^°C放置48小时。库存病毒的等量储存在−80^°C. Madin-Darby犬肾(MDCK)细胞从美国类型培养收集物(Manassas, Va, USA)中获得，并保存在添加了10%胎牛血清和1%抗生素(青霉素/链霉素)的Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)中。

2．2．传染性

50%组织培养感染剂量₅₀)在37^°3 d, 50%卵感染剂量(EID)₅₀)在10日龄的鸡胚中，经40小时的孵育，在35^°c . TCID₅₀和开斋节₅₀用Reed和Muench方法计算13］．

2．3.流感病毒基因序列测定及系统发育分析

用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen, Valencia, california, USA)从含病毒尿囊液中分离病毒RNA，用通用引物集进行一步RT-PCR (Qiagen) [14］．PCR产物采用QIAquick PCR纯化和凝胶提取试剂盒(Qiagen)进行纯化。测序由圣犹大的哈特韦尔生物信息学和生物技术中心使用大染料终结者(v.3;Perkin Elmer应用生物系统，福斯特城，加利福尼亚，美国)化学和合成寡核苷酸。系统发育分析基于HA和NA基因。从1996/1997年以后分离的H5N1病毒中选定的HA和NA序列从洛斯阿拉莫斯国家实验室的流感序列数据库下载(http://www.flu.lanl.gov/) [15］．使用ClustalW比对算法和BioEdit序列比对编辑器对序列进行比对。为了估计系统发育关系，使用系统发育推断包(PHYLIP) 3.65版本，通过100个bootstrap采用邻居连接法分析核苷酸序列。

２.４.鸡、鸭和小鼠的致病性

所有的动物研究都是在适用的法律和指导方针下进行的，并经过圣犹大动物保护和使用委员会的批准。采用3组(Fa/SA/05，种群病毒浓度:10^8.769开斋节₅₀/mL)或10 (Fa/KW/07，种群病毒浓度:10^9.231开斋节₅₀/mL) 6周龄无特异性病原体白来航鸡(背带吊裤带家)，用10倍稀释的含病毒尿囊液0.1 mL静脉注射。连续10天每天检查鸡的临床症状和死亡率。实验在接种后24小时内发现鸟类死亡后停止。

野鸭的致病性如前所述[16］．五只五周龄绿头鸭(阿拉斯platyrhynchos)接种10⁶开斋节₅₀气管和喉咙各0.3 mL，鼻孔和眼睛各0.2 mL。在10天的时间内，每天观察所有鸟类的临床体征和死亡率。从p.i.第3天开始，每隔一天采集一次气管和泄殖腔拭子。，病毒滴度(TCID)₅₀)测定。

在6周龄雌性BALB/c小鼠中测定了两株猎鹰H5N1分离物在哺乳动物中的致病性。小鼠分组()鼻内接种100个菌斑形成单位(PFUs)的病毒PBS的L。每组3只小鼠分别于第3、6和9 p.i天采集脑、肺、肝、脾和血液。评估器官取向。器官在1ml的PBS中均质，并滴定病毒(log₁₀TCID₅₀/mL)。

2．5．利用H5n1型雪貂抗血清进行血凝素抑制试验

通过在St. Jude或Marshall农场(North Rose, NY, USA)的雪貂育种计划获得的雪貂经鼻接种10⁶开斋节₅₀在异氟醚麻醉下用1ml PBS检测病毒第21天采集血清。或PBS中1 mL稀释倍数为1:10的原株病毒经足垫注射或鼻内接种增加剂量后10天。抗血清经受体破坏酶处理后用于HI试验，如Palmer等人先前所述[17］．

3.结果

3．1.抗原特征

我们通过血凝素抑制(HI)试验评估了猎鹰H5N1流感病毒与其他H5N1病毒的关系。两种猎鹰H5N1分离株的反应模式略有不同(见表)1)．两种病毒对A/chicken/Pakistan (Lahore)/NARC2411均有较高的HI效价(Fa/SA/05为160,Fa/KW/07为320)。一个/06 (clade 2.2) antiserum, suggesting that they are closely related to the H5N1 virus from that region and to viruses of clade 2.2. The Fa/KW/07 virus was not highly reactive with antisera generated against Fa/SA/05, suggesting that the two isolates differ antigenically despite their common origin.

3．2．分子鉴定

其HA蛋白在12、178、512和553位存在4种氨基酸差异。178位的氨基酸靠近HA受体结合位点(H5 HA编号)。两种病毒的HA蛋白在HA之间的连接肽处含有多个碱性氨基酸₁和哈₂(PQGERRRKKR位于321-330位)，这是在鸡体内具有高致病性的流感病毒的特征[18，19］．有趣的是，两种猎鹰H5N1病毒的HA裂解位点(R>G)与其祖先病毒Gs/Gd/1/96和Ck/HK/220/97以及2004年在泰国、印度尼西亚、越南和中国东部分离的H5N1病毒(PQ)的HA裂解位点(R>G)不同ERRRKKR)。

我们还分析了聚合酶基因的氨基酸。1997年H5N1病毒在小鼠体内的高毒力需要PB2蛋白627位由谷氨酸(E)转变为赖氨酸(K) [20.，21]人类感染H7N7病毒[22］．序列分析显示在这两个分离株中都有赖氨酸，表明这两个菌株对小鼠都是致命的。两株H5N1分离株的PB1和PA蛋白在436位含有酪氨酸，在515位含有苏氨酸。相比之下，PA中T515>A氨基酸的变化和PB1中Y436>H的变化已被证明消除了H5N1构建物在鸭中的致病性，而PB1中Y436>H的突变降低了在鸭中的传播效率。PA的T515>A突变消除了病毒在鸭子中的致死率，但在小鼠和雪貂中没有[16］．

3．3.对抗病毒治疗的潜在敏感性

抗金刚烷胺型流感A变种在M2蛋白的26、27、30、31或34位残基携带氨基酸替换[23，24］．在任何一种H5N1病毒中，序列分析均未发现这些残基的替换(见表)2)，表明两者都可能对M2抑制剂敏感。保守的NA框架或催化残基(氨基酸残基119、274、292和294,N2编号)的突变可能降低病毒对NA抑制剂的敏感性[25］．在研究的H5N1病毒的NA残基中未观察到替换(见表)2)，提示它们可能对神经氨酸酶抑制剂敏感。

3．4．系统发育分析

HA和NA系统发育树来源于A/Chicken/Hong /220/97病毒HA和NA基因。Fa / SA / 05的HA基因病毒系统密切相关的分离的病毒从2006年的鸡在以色列和加沙地带(进化枝2.2),而Fa /千瓦/ 07年的HA基因密切相关的一种病毒隔离在俄罗斯从2007年的鸡(进化枝2.2)(见图1)．在此分析的基础上，将两者归为H5 HA分支2的亚分支2。这些病毒与2005-2007年从亚洲、非洲和中东分离的病毒在系统发育上聚在一起(见图)1)．

由于茎长不同，N1树的总体拓扑结构与HA树不同。目前2003-2007年和2001-2002年中国家禽分离株的茎段(位置49 - 68)存在20个氨基酸缺失。在H5N1/97香港人和家禽分离株中观察到19个氨基酸缺失(位置50至68)。两种隼型H5N1病毒在NA的茎段均有20个氨基酸缺失。Fa/SA/05病毒的NA基因与A/chicken/Egypt/1129N3-HK9/2007(进化支2.2)亲缘关系密切，而Fa/KW/07病毒的NA基因与A/chicken/Afghanistan/1207/2006(进化支2.2)亲缘关系密切(见图)2)．

3．5．小鼠器官趋向性模型

为了确定两种猎鹰H5N1分离物在哺乳动物宿主中的致病性，我们通过鼻内接种BALB/c小鼠，并测量病毒在大脑、肺、肝脏、脾脏和血液中的复制。接种100 PFU的Fa/KW/07病毒，病毒效价高(平均10^7.35TCID₅₀/mL);滴度在第6天和第9天有轻微下降。(见图3.)．Fa/SA/05病毒的病毒效价比Fa/KW/07低约1 log。在第6天。，the mean Fa/KW/07 virus titer in the brain was 10^5.07TCID₅₀/mL, Fa/SA/05为10^3.02TCID₅₀/毫升(见图3.)．接种Fa/KW/07病毒的小鼠仅在第3天和第6天脾脏中检测到病毒，接种任何一种隼型H5N1病毒的小鼠均在第9天死亡。

3.6。鸟类的毒力和致病性

为了确定这两株猎鹰H5N1分离物是否对禽类保持致病性，我们接种了6周龄无特异性致病性白来航鸡。这两种病毒在24小时内都造成了100%的死亡率。

然后通过自然途径(气管、喉咙、鼻孔和眼睛)接种2组5只野鸭，接种10只⁶开斋节₅₀Fa/SA/05和Fa/KW/07砧木病毒在10天的观察期内，所有鸭均存活。5只鸭中2只在接种Fa/KW/07后第5天观察临床症状(混浊和共济失调)。Fa/SA/05只导致5只鸭中1只在第5 ~ 7天出现眼云。从p.i.第3天开始，每隔一天采集一次气管和泄殖腔拭子。两种病毒均于p.i.第3天从气管脱落。(见图4)，在第3天泄殖腔标本中检测到Fa/KW/07病毒。在第5天、第7天和第10天获得的标本中未发现病毒。

4.讨论

不断积累的数据表明，猎鹰对高致病性H5N1感染极为敏感。我们研究了从中东死亡猎鹰中分离的2种H5N1病毒的分子、系统发育、抗原和致病特性。系统发育和抗原分析表明，这两种病毒都起源于2005年导致中国野生鸟类大规模死亡的青藏型H5N1病毒。然而，尚不清楚这些病毒是如何传入该地区的，以及受影响国家的猎鹰是如何感染高致病性H5N1病毒的。

有几种可能可以解释这些病毒的引入。由于2005年以前中东没有报告H5N1感染病例，第一种可能是该病毒是在2005年中国爆发疫情后由向西迁徙的野鸟引入的。该病毒迅速向西传播，通过多个地区，包括中东[26]，随后传播到家禽，可能还传播到其他鸟类，包括猎鹰。

另一种可能性是，该病毒是通过从中国、蒙古、俄罗斯非法进口到中东的感染了病毒的猎鹰传播的。数以千计的野生猎鹰在没有兽医检查、没有获得《濒危野生动植物种国际贸易公约》的许可证和边境管制的情况下在黑市交易[27］．隼的非法交易可能导致全球高致病性禽流感病毒的传播，因此应严格管制进出口活动。例如，进入阿联酋的猎鹰必须隔离21天;在第1周和第2周对血液和鼻腔粘液进行H5N1病毒测试[28］．到目前为止，这些特别的安全措施已经防止了阿联酋猎鹰发生任何高致病性H5N1感染病例。

第三种可能是猎鹰是通过病鸽子和/或鹌鹑感染的，这是它们的正常食物来源。为了给狩猎的猎鹰喂食，成千上万只活鹌鹑未经兽医检查就从阿拉伯湾空运到中亚各地的皇家猎鹰营地。27］．北美、德国和波斯湾地区的许多猎鹰在吃了鸟类(特别是鸽子和鹌鹑)和其他感染了禽流感病毒的猎物后死亡[29］．因此，圈养的猎鹰只能喂食经兽医检查过的鸟类。

H5 HA的系统进化树显示，虽然两种隼型H5N1病毒起源于相同的祖先病毒(枝2.2，青海样)，但它们可能通过不同的飞行途径向西传播。由于Fa/SA/05的HA与2006年从加沙和以色列分离的鸡的HA具有很强的序列相似性，这种病毒似乎已经通过“南部”的飞行通道从青海湖向非洲大陆传播。相比之下，Fa/KW/07的HA与来自俄罗斯的2007年鸡肉分离物的HA密切相关，表明科威特分离物是通过“北方”飞行通道被带到欧洲的。这两种病毒与接种不同H5N1病毒的雪貂抗血清的反应模式略有不同。Fa/KW/07病毒与抗血清反应较差的事实是针对Fa/SA/05病毒产生的(见表)1)，提示其血凝素基因可能发生了轻微的抗原漂移。此外，同源和异源滴度的四倍差异也表明只有微小的抗原差异。因此，基于这一观察，应该根据HA系统发育分析来判断分离株的不同来源，而不是根据两个猎鹰分离株的轻微抗原差异。序列分析显示，两种病毒的NA茎均有20个氨基酸缺失;这是鸡适应流感病毒的特征。

有趣的是，尽管这两种猎鹰H5N1分离株对鸡都是致命的，但它们在绿头鸭中的复制却有限。只有约三分之一的接种鸭出现临床症状，病毒仅在p.i第3天脱落。(见图4)．这种低致病性可能使鸭子被动地携带和释放这些和其他高致病性H5N1病毒。

沙特阿拉伯和科威特猎鹰H5N1病毒在小鼠的多个器官中复制，特别是大脑和肺，事先没有进行适应(见图)3.)．H5N1型流感病毒的致死率和向小鼠大脑的传播通常需要多次传代才能适应[30.］．这些分离物在小鼠中的高致死率可能与PB2蛋白的K627残基有关[20.，21］．有趣的是，从人类分离的所有H5N1病毒以及从青海湖(中国西部)、俄罗斯和尼日利亚最近爆发的所有禽流感H5N1病毒分离物中的PB2s在627位含有赖氨酸(K) [21，31]，而其祖禽病毒PB2s在此位置含有谷氨酸(E)。

甲型流感病毒的所有亚型都有可能成为大流行毒株，但目前流行的高致病性H5N1病毒是最令人担忧的。我们的研究首次提供了从中东死猎鹰中分离出的高致病性H5N1病毒的分子和生物学见解。这些信息将有助于确定应采取哪些措施，以便在受影响国家和全球范围内有效监测和保护这些鸟类。在本手稿的准备过程中，Lierz等人[31]报告说，接种灭活的H5N2病毒后，猎鹰在高致病性H5N1感染后幸存。接种疫苗的鸟类确实释放了病毒，但滴度降低了。这种方法可能为圈养猎鹰的保护提供部分解决方案。

致谢

这项工作得到了A195357、A157570和CA21765的部分支持。HHSN266200700005C由美国卫生与公众服务部和美国黎巴嫩叙利亚联合慈善机构(ALSAC)提供。作者感谢Sharon Naron的编辑协助，James Knowles的行政协助，Natasha Lyushina和Jacco Boon的技术支持，以及哈特韦尔生物信息学与生物技术中心和圣犹大儿童研究医院动物资源中心的贡献。

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