槐耳多糖SP1通过调控TGF-对胃癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响β/ SMAD信号通路

摘要

客观的．研究槐耳多糖SP1对胃癌细胞株MGC-803增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响及其机制。方法．MGC-803细胞体外培养，SP1处理。采用CCK-8法、流式细胞仪、Transwell法检测SP1对MGC-803细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力的影响。Western blot和qRT-PCR检测相关基因的表达。结果．我们的研究表明，槐耳多糖SP1在体外具有抑制MGC-803细胞增殖、迁移、侵袭和促进细胞凋亡的作用，且呈剂量依赖性。槐耳多糖SP1可抑制TGF-的激活β通过上调SMAD7的表达，从而下调SOX4、ZEB2、MMP9、Snail和Slug的表达。结论．怀尔多糖SP1通过促进SMAD7的表达，抑制TGF-的激活，调控胃癌细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭β/SMAD信号通路及其下游致癌基因的表达。

1.介绍

胃癌是世界上常见的恶性肿瘤之一，近年来在根治性手术、传统化疗、放疗、靶向治疗等治疗策略上有了很大的发展。然而，它的死亡率仍然很高[1，2]，这主要是因为对晚期和/或转移性胃癌患者没有更好的治疗方法，全身化疗仍是主要选择[3.，4］．由于传统的化疗药物正在引起更高的耐药性，以及细胞毒性和严重的副作用[5，6]，寻找一种新型、高效、副作用少的抗癌药物对治疗胃癌，减少化疗不良反应具有重要意义。

robiniophila Trametes robiniophila Murr，又称槐耳，是一种中国药用真菌[7］．最近的研究发现，从怀尔提取的多糖对各种肿瘤细胞有抑制作用，如乳腺癌细胞[7，8]、肝癌[9，10]，透明细胞肾细胞癌(CCRCC) [11］．此外，怀耳多糖具有多种抗癌作用。例如，Luo等报道槐耳多糖SP1通过下调MTDH蛋白引起乳腺癌MCF-7细胞凋亡[8];Li等证明槐耳多糖通过抑制血管生成抑制肝癌生长和转移[9];Fang等发现槐尔多糖HP-1通过抑制上皮-间充质转化来抑制CCRCC的进展，提高舒尼替尼的疗效[11］．目前尚无槐耳多糖在胃癌中的研究，其作用机制尚不清楚。

根据Luo等人的方法[8从栓菌属),我们提取Huaier多糖SP1 robiniophila Murr,探索其功能在胃癌细胞株mgc - 803,并进一步解释了相应的机制,从而为应用程序提供一个理论依据Huaier多糖SP1的化学治疗剂治疗胃癌。

2.材料和方法

2．1．槐耳多糖SP1的提取与鉴定

槐耳多糖SP1按Luo等报道的方法提取[8］．首先从刺槐Trametes robiniophila Murr的子实体中分离纯化了砂质和米色粉状水溶性粗多糖(SCP)。然后，通过DEAE纤维素和琼脂糖CL-6B凝胶过滤层析进一步纯化SCP，得到不同平均分子量分布的多糖。收集水溶性中性组分SP1并进行冻干进一步研究，通过高效液相色谱对产物进行鉴定。单个峰表示产物的均匀性，平均分子量约为56 kDa(图)1)．气相色谱分析表明SP1由半乳糖、阿拉伯糖和葡萄糖组成，摩尔比为3.1:1.1:1.1:3.3。

2．2.细胞培养与处理

人胃癌细胞株MGC-803购自美国ATCC。MGC-803细胞系常规培养于含10%胎牛血清、100µ100 g/ml链霉素。细胞在37℃、含5%二氧化碳的湿化培养箱中培养。

2．3.细胞生存能力测试

MGC-803细胞以3000细胞/孔的密度接种于96孔板中，预培养24小时。然后加入不同浓度的SP1，分别在24、48、72 h加入CCK-8试剂(日本Dojindo)。吸光度(一个)在450nm波长下，用分光光度计测量。相对细胞活性=(处理组值-空白背景值)/(对照组值-空白背景值)× 100%。

2．4．细胞迁移试验

用划痕法检测细胞迁移能力。用不同浓度SP1处理MGC-803细胞，其融合率为95%。用尖在垂直于培养板的细胞上划一条直线，然后用PBS冲洗去除分离的细胞。然后加入不同浓度SP1的无血清DMEM高糖培养基。细胞在细胞培养箱中培养，24小时拍照。计算细胞迁移率。相对细胞流动性= (0h划痕宽度−培养后划痕宽度)/ 0h划痕宽度× 100%。

2．5．细胞凋亡检测

将MGC-803细胞接种在12孔板上，并在培养箱中用不同浓度的SP1处理72 h。收集细胞，PBS洗涤2次，Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒染色。用流式细胞仪对样品进行分析。凋亡率(%)=早期凋亡率(%)+晚期凋亡率(%)。

2．6．细胞入侵检测

用Transwell法测定细胞侵袭能力。一个100μl基质凝胶(美国康宁公司)和无血清DMEM培养基(1:8)的混合物涂于上部transwell室(康宁公司)。细胞(5 × 10⁴)，基质凝胶固化4h后，用不含血清的DMEM培养基播种于上室，下室加入含10%胎牛血清的DMEM培养基。细胞培养24小时，用甲醇固定，结晶紫染色，显微镜下对膜下表面的细胞进行拍照计数。

2.7。免疫印迹

用RIPA裂解液提取的蛋白用BCA蛋白检测试剂盒进行定量，等量的蛋白在10% SDS-PAGE上进行电泳，然后在硝化纤维素膜上进行免疫印迹。用5%脱脂牛奶在室温下封闭膜2小时，然后用一抗在4℃下孵育过夜。与酶标二抗孵育后，蛋白在ECL凝胶成像系统上显示。一抗购自Abcam公司。

2.8。中存在

用TRIzol试剂(Takara, Japan)提取细胞总RNA，用Prime Script RT试剂试剂盒(Takara)合成cDNA。所有反应均使用TaqMan基因表达分析系统(Applied Biosystems，美国)和TaqMan通用PCR主混合试剂(Thermo Fisher Scientific，美国)进行。用2^−ΔΔct方法β-actin作为内部参考。所有实验至少重复三次。实验所用引物见表1．

2.9。统计分析

数据以均数±标准差表示，每个实验至少独立重复3次。采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。实验组和对照组之间的比较使用学生的t-检验和单因素方差分析。被认为具有统计学意义。

3.结果

3．1.SP1抑制MGC-803细胞增殖

数字2结果表明，MGC-803细胞在不同浓度SP1(25、50、100、200、400和800)作用下对MCF-7细胞的生长具有剂量依赖性抑制作用μG /ml)， 24、48、72小时( )．随着SP1浓度增加到50μG /ml时，细胞活力显著降低。当浓度超过200时，细胞活力下降趋势相似μ克/毫升。因此SP1可抑制MGC-803细胞增殖。

３．２．SP1促进MGC-803细胞凋亡

如图所示3.，流式细胞分析显示MGC-803细胞暴露于不同浓度SP1(25、50、100、200)μg/ml)处理72小时后，随着SP1 ( )，提示SP1可促进MGC-803细胞凋亡。

3．3．SP1抑制MGC-803细胞的迁移

如图所示4分别用25、50、100和200处理MGC-803细胞μg/ml SP1显示细胞迁移明显减少，且呈剂量依赖性( )，提示SP1可抑制MGC-803细胞迁移。

3．4．SP1抑制MGC-803细胞侵袭

如图所示5， transwell实验显示，MGC-803细胞分别用25、50、100和200处理μg/ml SP1显著降低细胞侵袭，且呈剂量依赖性( )，证明SP1可抑制MGC-803细胞的侵袭。

3．5.SP1抑制TGF-的激活β/ SMAD信号通路

MGC-803细胞经200μg/ml SP1处理72 h后，我们发现SP1可以显著提高SMAD7 mRNA和蛋白水平(图)6(一)和6 (b))，进而抑制TGF-的表达βRI。同时SP1可显著降低SMAD2、SMAD3及TGF-下游蛋白的磷酸化水平βRI(图6 (b))．

3.6。SP1抑制TGF-中下游癌基因的表达β/ SMAD信号通路

我们检测了TGF-中增殖、凋亡、迁移、侵袭相关下游基因的mRNA和蛋白表达β/SMAD信号通路包括SOX4、ZEB2、MMP9、Snail和Slug，这些基因的表达水平被SP1抑制(图)7)．

4.讨论

越来越多的证据表明草药有抗肿瘤作用。怀耳是一种常见的药用真菌，在中医中已使用了1000多年[12］．此外，由于其具有抗肿瘤和免疫促进功能，且副作用极小，因此越来越受到人们的关注。在本研究中，我们从怀耳中分离纯化了多糖SP1，并证明SP1通过抑制TGF-具有抗肿瘤作用β信号通路。

体外研究表明，槐耳多糖SP1能显著抑制MGC-803细胞的增殖、迁移和侵袭，并能促进MGC-803细胞凋亡。然而,没有研究在胃癌Huaier多糖的影响,所以我们有第一次证明了Huaier多糖SP1对胃癌有显著的抗癌效果,可作为化疗或辅助药物治疗胃癌。通过口服，槐耳多糖SP1可直接进入胃，作用于胃癌，可能具有更好的抗肿瘤作用。

到目前为止，对槐耳多糖抗癌作用机制的解释还不够充分。在本研究中，我们发现SP1可以抑制TGF-的激活β通过上调SMAD7的表达来调控/SMAD信号通路。TGF -β转化生长因子β，是一种多效性细胞因子，通过细胞膜受体和细胞内SMAD蛋白发出信号，在受体激活后进入细胞核，作为转录因子。TGF -β/SMAD信号通路在癌细胞的生存、EMT、迁移、侵袭等恶性进展中发挥关键作用[13，14］．在转化生长因子受体1 (TGF-βR1)，受体调节的SMAD蛋白SMAD2和SMAD3被招募和磷酸化激活。活化的SMAD2和SMAD3继续与SMAD4形成寡聚SMAD复合物，共同转入细胞核，与DNA结合，调控靶基因的表达[15］．SMAD7作为TGF-的负调控因子β/SMAD信号通路可与TGF-相互作用βR1在细胞质中，导致TGF-βR1退化(16］．在本研究中，我们发现SP1可以显著提高SMAD7 mRNA和蛋白的水平，抑制TGF-的表达βRI，从而降低TGF-下游SMAD2和SMAD3的磷酸化水平βRI。

同时，我们的研究发现SP1可以抑制增殖、凋亡、迁移及侵袭相关基因SOX4、ZEB2、MMP9、Snail、Slug的mRNA和蛋白的表达，这些都是TGF-的下游分子β/SMAD信号通路[17，18］．SOX4是SOX转录因子c亚家族的一员，通过使癌细胞存活、迁移和侵袭来促进肿瘤的发生[19];MMP9是基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)家族的一员，在肿瘤迁移侵袭、血管生成、细胞凋亡等方面发挥着重要作用[20.];Snail和Slug是EMT过程中的重要分子，能够促进肿瘤的侵袭转移，通过调节细胞周期和凋亡促进细胞存活[21，22］．因此，我们认为SP1通过抑制TGF-调控胃癌细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭β/SMAD信号通路及其下游分子Sox4、Zeb2、Mmp9、Snail、Slug的表达(图)8)．

本研究提取了淮格尔多糖SP1，并通过体外实验证实SP1能抑制TGF-的激活β/SMAD信号通路及下游致癌基因SOX4、ZEB2、MMP9、Snail、Slug的表达，通过促进SMAD7的表达，从而调控胃癌细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭，为SP1在胃癌治疗中的应用提供了理论基础。

数据可用性

用于支持本研究发现的数据可由通讯作者要求提供。

的利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

作者的贡献

陈苗亮、陆英对这项工作贡献相当。

致谢

基金资助:浙江省基本公益性科研计划(批准号:2017102129@163.com);LGF19H160017)。

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