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聚合物技术进展
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聚合物技术进展/2020/文章
特刊

生物应用聚合物系统的设计和工程

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研究文章|开放访问

体积 2020 |文章ID. 7310657. | https://doi.org/10.1155/2020/7310657

萨米拉侯赛尼，帕特里夏克斯-Villegas的，理查德C.威尔森，马科·里托·帕洛马尔斯，玛格丽塔桑切斯 - 格斯，利奥H. Koole，马克J.麻豆，塞尔吉奥O.马丁内斯-沙帕那 “聚球基于分析的超灵敏miRNA检测“，聚合物技术进展那 卷。2020那 文章ID.7310657.那 14. 页面那 2020。 https://doi.org/10.1155/2020/7310657

聚球基于分析的超灵敏miRNA检测

Samira Hosseini那1那2 帕特丽夏Vazquez-Villegas那1 理查德·威尔森C.那3.那4.那5. Marco Rito-Palomares那5. 玛格丽塔Sanchez-Dominguez那6. Leo H. Koole.那6. 马克·j .名字那7.那8.那9. 和 塞尔吉奥·o·Martinez-Chapa1

1Escuela de Ingeniería y Ciencias, tecologico de Monterrey, Ave. Eugenio Garza Sada 2501, Monterrey 64849, NL, Mexico

2写作实验室，TecLabs，Vicerrectoría德InvestigaciónŸTransferencia德TECNOLOGIA，Tecnologico蒙特雷，大道欧亨尼奥·加尔萨沙达2501，蒙特雷64849，NL，墨西哥

3.休斯敦大学化学与生物分子工程系，美国休斯敦77204

4.休斯顿大学，生物化学系，休斯顿，TX 77204，USA

5.蒙特雷技术中心Escuela de Medicina y Ciencias de Salud, Prieto 3000 avenue Ignacio Morones Poniente, 64710 Monterrey, NL, Mexico

6.Centro de Investigación en Materiales Avanzados, s.c. (CIMAV)， Unidad Monterrey, parkque de Investigación e Innovación Tecnológica, Apodaca, NL 66628，墨西哥

7.荷兰马斯特里赫特大学健康、医学和生命科学学院

8.加州大学，生物医学工程系，Irvine，CA 92697，USA

9.加州大学，机械和航空航天工程系，Irvine，CA 92697，USA

学术编辑器:莱安德罗Gurgel
收到了 2019年7月3日
修改 2019年10月26日
公认 2019年11月11日
发表 2020年04月01

抽象的

虽然微RNA（miRNA）已成为越来越重要的目标分析物，其生物识别仍然具有挑战性，由于其体积小，高序列同源性，和低丰度临床样本英寸纳米微球，微球也获得了在生物传感器的应用越来越多的关注，由于其高比表面积和各种可利用的成分的。在这项研究中，化学设计和活性官能团被用来促进导致更好的生物识别有效的miRNA固定合成微球。当用荧光标记的探针互补结合，基于酰化物球具有间接地检测MiR159，提供显著增强的分析灵敏度，特异性和准确性，同时40皮摩尔的屈服检测（LOD）的相当低的限制。此外，存在MiR159，这是已知的乳腺癌发病和进展被反向相关，在竞争性测定，这是有希望的用于当前测定升级到临床使用已成功检测到。

1.介绍

microRNAs（miRNA）是短的调节性核糖核酸（RNA）的长度为18至25个核苷酸[1］.MiRNA的过度表达或曝光表达与各种疾病相关，具有特异性疾病的不同阶段[2-6.］.MiRNA表达水平的监测变化对于及时启动治疗和/或监测正在进行的治疗的有效性[7.-9.］.由于其体积小、序列同源性高、二级结构半稳定，mirna成为生物识别领域具有挑战性的目标[10.］.常规应用用于检测MiRNA的策略，包括Northern印迹，微阵列或实时聚合酶链反应（PCR）需要复杂的设备和数据分析，而它们是昂贵的，并且在每种临床设置中都不可用[8.那11.］.此外，一些报告表明，在处理这些技术时，特异性和敏感性不足，增加了现有miRNA检测的挑战[12.］.

由于它们的主要有利特征包括（i）扫描和复用，因此纳米/微球引起了对免疫测定的大量兴趣;（ii）与二维（2D）平台相比，促进分析物表面相互作用的二维（2D）平台明显较大的比表面积;（iii）与兴趣的生物分子相互作用的高空间自由度[13.-21.］.在文献中报告使用不同粒子类型的miRNA检测[22.那23.］.用于miRNA检测的颗粒范围很广，包括磁性、碳、氧化石墨烯、银和铜颗粒[24.-30.］.量子点编码的微珠（QBeads）介绍了另一种检测miRNA的策略[31.那32.］.虽然这些技术打开了有效检测miRNA的机会窗户，但绝大多数涉及耗时的官能化步骤，昂贵的试剂，复杂的程序和复杂的实验室设置[12.］.即使如此，改性的生物接受表面的稳定性也不能保证，因为它们可能会随着时间的推移而失去功能[33.那34.］.

在这项工作中，我们描述了验证的概念策略，包括不同尺寸的基于核苷酸杂交miRNA检测生物受体表面的交联聚甲基丙烯酸酯微球。基于聚合物的微球具有定制的物理和化学性质。同时提供用于分析物表面相互作用的大的表面积，球体是从羰基的（-OH）的固有存在（-C = O），羟基，和芳族基团进一步促进生物分子相互作用中受益。这使得官能化和表面活化步骤是不必要的。微球被纳入用于一步法杂交测定用于Cy3标记miR159的生物识别作为目标分析物的常规的96孔板，使用互补氨基修饰的DNA捕获探针。此外，合成的未标记的miR159在竞争性测定中检测为自miR159的血清中的浓度的进一步证明的概念反比于乳腺癌的发病率和进展在人类[相关35.］.这种直接的策略首次允许常规分析测定检测皮质摩尔（PM）范围内的MicroRNAS，而无需任何扩增。

2.材料和方法

2．1.化学药品和试剂

柠檬酸钠(Na3.C6.H5.O.7.）），氯化钠（NaCl），盐酸（HCl），十二烷基硫酸钠（SDS），聚山梨醇酯20（吐温20），甲苯胺蓝（TB），氢氧化钠（NaOH），乙酸（ACOH），无核酸酶而且牛血清白蛋白（BSA）购自Sigma Aldrich（美国圣路易斯，美国圣路易斯）。捕获探针，氨基修饰DNA（5'-TTTAAGGAGCTCACATACGCGGGCC-3'/氨基改性剂/），靶CY3标记分析物MIR159（5'-GAGCUCUUAAAGUUAACA-3'/ CY3 /），合成靶MIRNA159（5'-GAGCUCCUUAAAGUAAACA-3'）和非互动的阴性控制，Cy3标记的MiR-Lin4（5'-AcaccugggccucccggGuac-3'/ Cy3 /）购自集成DNA技术（Coralville，Ia，USA）。生物分子中的大写和小写字母分别代表互补和非互相核苷酸（氨基改性剂是没有间隔臂的伯胺）。

２.２.微球的合成

聚甲基丙烯酸酯微球通过聚合（Geleen的，荷兰）与单体甲基丙烯酸甲酯（MMA），2 hydroxylethylmethacrylate（HEMA）中的悬浮液的合成，4-碘benzyloxo - 甲基丙烯酸乙酯（4-IEMA），和四甘醇二甲基丙烯酸酯（TEGDMA）。粒子合成和表征的细节（颗粒合成和表征（储存稳定性，血液和细胞相容性，结构和不可浸出成分的情况）[36.那37.］.筛分和尺寸的球形，如下：MMS-1（200-400 μ米);MMS-2(400 - 600年μ米);MMS-3(600 - 700年μ米);和彩信-4（700-900 μ米)(图1）.球体略微亲水，并且相对致密的（〜3g / ml），作为生物释认应用的有利特征，因为缀合的颗粒将在没有聚类的情况下沉入水性介质中。这反过来，这最大化与兴趣分析物的接触。


图1
从不同大小的类别球体的SEM图像与它们的尺寸分布沿着：（一）MMS-1（200-400 μ米);(b) MMS-2 (400 - 600μ米);(c) MMS-3(600 - 700年μ米);（d）MMS-4（700-900 μm)。每组10 mg的比表面积测量显示在中心。
2.3。形态学，尺寸分布，表面积和拉曼光谱分析

装有场发射枪扫描电子显微镜（FESEM，JEOL，JSM7600F，USA）被用于从不同大小的类别镀铂球的形态学分析。The acceleration voltage of the instrument was 0.5 kV. The size distribution of each size category was calculated from optical microscope images of 500 ± 5 randomly selected spheres from each group (OLYMPUS, BX51TRF, Japan). The specific surface area of each size category (per 10 mg) was calculated from the size distribution analysis (Figure1）[36.］.拉曼光谱记录在LabRAM HR Evolution (Horiba，日本)的拉曼光谱仪上，耦合奥林巴斯BX-4显微镜。样品的激发波长为532 nm，采用Nd:YAG激光器作为辐照源。具体条件如下:激光ND滤光片25%，积累时间3 s, 6次积累，600线/mm光栅(500 nm)，一个孔50微米。

2.4。miRNA固定前后微球的地形分析

通过在空气中的攻丝模式下通过原子力显微镜（AFM，庇护研究MFP3D SA）分析MiRNA固定前后的微球的表面。庇护研究模型AC240TS-R3矩形尖端用于分析表面。扫描覆盖了60×60的区域 µm和1 × 1 µm速度间隔为0.20至0.50 Hz。第一标称共振的频率为70kHz，标称弹簧常数为2n / m，标称曲率半径为9±2nm。在AFM分析之前，将微球样品在杂交溶液中温育（1 µM捕获探针和1µM的Cy3-miRNA分析物)，然后用SSC和0.01X SSC分别洗涤2次。

2．5．寡核苷酸固定化和甲苯胺蓝滴定

微球表面容纳mirna的能力通过甲苯胺蓝分析进行评估。在读数前，使用2的校准溶液对分析进行校准μ米,4μ男，6 μ男，8 μ10 M,μM结核病。微球(10 mg)在1μM溶液的捕获探针(200μL，37°C，2小时），然后用柠檬酸钠（SSC）彻底洗涤。此方法先前在文献中报道并进行了彻底测试[38.-40］.使用甲苯胺蓝（TB）滴定来证实寡核苷酸捕获探针的存在与微球的表面粘合。该技术依赖于Tb染料和核苷酸磷酸酯基团之间的pH依赖性静电相互作用（图2(一))38.］.将不同粒径的球(10 mg)浸泡在8 mL 0.5 mM TB和0.1 mM NaOH溶液中2小时，然后在0.1 mM NaOH中洗涤，以完全去除非络合的TB染料。随后，球体在3 mL酸性溶液(50% AcOH蒸馏水)中孵育45分钟，以将络合的TB分子分离到酸性溶液中，使用Jenway (Stone, Staffordshire, UK)分光光度计在635 nm处进行测量。


图2.
具有指定峰的聚甲基丙烯酸酯球的拉曼分析。
2.6。分析测定的缓冲制剂

The stock solution of 20 times concentrated SSC (20X, 3 M NaCl, 0.3 M Na3.C6.H5.O.7.使用HCl调节至7的pH调节至7的pH值和随后的这种缓冲液（5x和0.01x）的稀释液用核酸酶的水（Sigma Aldrich，St.Louis，Mo，USA）制备。用无菌0.2过滤所有稀释液 µ米注射器过滤器（康宁，康宁，纽约州，美国）。捕获探针溶液最初制备在不含核酸酶的水和在SSC缓冲液中稀释至10 µ该浓度被用作捕获探针进一步稀释的备用溶液。分别用捕获探针和杂交miRNA孵育后的SSC溶液和0.01X SSC溶液作为洗涤缓冲液。在5X SSC中使用含有(1%，w/v) BSA、(0.02%，w/v) SDS和(0.05%，w/v) Tween 20的阻断缓冲液来减少非特异性结合的机会。

2.7。间接和竞争性杂交测定

将预定量的球体(10 mg)装入常规96孔板(Corning, NY, USA)的孔中。作为对照，间接测定也在常规96孔无球板上进行。为了尽量减少实验的可变性，所有的测定都是在完全相同的条件下进行的，并使用相同批次的缓冲液。miRNA探针被物理固定在球体表面。这些球体被装入一个96孔的平板中，每个孔中装入200个小球µl捕获探针的溶液（1 µM)。37℃孵育2小时。所有井用SSC缓冲液彻底冲洗(3次，200次)µL)，并注入阻塞缓冲液(200µl）以避免非特异性的结合。将孵育在37℃下进行1小时，然后用SSC缓冲液完成洗涤过程。随后每个井都收到200 µL的分析物溶液(在37℃下2小时)。将原浓度(100µM）具有0.01x SSC缓冲液，以达到如下所示：1000nm，100nm，10nm，1nm，100pm，10 pm和1pm。为了避免荧光漂白，从该步骤开始，测定在暗室中进行。在读出之前，通过另一轮洗涤（0.01x SSC）定位测定。用530/25nm和590/35nm激发和发射过滤器测量Cy3标记的荧光强度。在Synergy 2微孔板读卡器（Biotek Instruments，Inc.，Winooskin，VT，USA）中，使用0.1s和120％灵敏度进行读数。

由于目标分析物的浓度与乳腺癌呈负相关，另外进行了竞争性杂交分析以评估所开发的分析方法的潜力。合成miR159与cy3标记的miR159竞争。在此过程中，将10mg微球(以MMS- 3为代表组)装入96孔板的每孔中，并在1孔处用捕获探针包覆µ将荧光标记的miRNA（Cy3-miR159）稀释至100nm和1000nm，而合成mi​​r159稀释至0nm，10nm，100nm和1000nm。使用相同的缓冲剂和如上所述的相同孵育时间和温度进行竞争结合。通过将强度（针对未标记的miRNA的每个浓度）通过阴性结果（在没有未被标记的miRNA的情况下计算）来计算相对荧光强度。

2.8。测定的校准和评估

测定的校准用捕获探针进行（1 µM)和不同浓度的目标分析物(1000 nM, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM, 10 pM，和1 pM)。将数据转换成对数尺度绘制校准曲线。以非互补cy3标记的miR-lin4作为杂交miRNA (N= 10)。每个微球大小类别的截止值计算为阴性对照平均值的两倍[41.］.只有强度结果高于临界值的读数被解释为阳性。

进行了80次正和负40重复的总数，以获得重要的参数，如分析灵敏度，特异性和测定的精度。计算是在与进行重复的总数[比较来执行按照以下考虑正/负读数方程42.]：

这些方程中的变量如下:真阳性(TP)真阴性(TN)假阳性(FP)假阴性(FN)

每个尺寸类别的检出限(LOD)为平均标准偏差的3倍(S.，在最低miRNA浓度的情况下)除以校准曲线的斜率(m）以下给定的公式[34.那43.-48.]：

没有球的常规分析也进行了校准和仔细评估。

3.结果与讨论

3．1.球的形态、尺寸分布和表面积

通过SEM成像不同大小的微球，并且在图中提出了代表性形态1（一种）-1(d).记录的形态被发现是光滑的，并且球的尺寸在筛分组的预期范围内。具有一致表面形貌的均匀球体使解释集中在生物分子固定的比表面积和化学球体的影响。

直径范围和尺寸分布(图中的图形1（一种）-1(d)用光学图像计算每个尺寸的球组。随后，从各自的尺寸分布中仔细计算每个尺寸类别的比表面积(对于10 mg的微球)。表面面积为6 × 107.至17 × 107.µm2（数字1，中央饼图）。如预期的那样，最小的球体（MMS-1）提供每种质量的最高表面积，并为最大球体（MMS-4）测量每种物质的最低比表面积。原则上，较高的比表面积增强了分析物表面相互作用导致的生物分子偶联和随后的生物释认较高概率[33.那49.］.

3.2。球的拉曼光谱分析

数字2显示了微球的拉曼光谱。需要注意的是，从甲基丙烯酸基团的C=C拉伸模式没有信号，一般在1640 cm左右-1，表明共聚成功(没有游离单体的证据)[50.那51.］.将几个信号分配给参与球体合成的不同聚合物的官能团。信号在597厘米处-1可以对应于PMMA聚合物（ν（C-COO），νS.（C-C-O））[52.]以及p-HEMA (δ(O c = O)) (53.］.峰值在811.8厘米处-1可以分配给来自p-HEMA (ν(C-O-C)信谊那π（c = o）或ν（C-CH3.））[4.］.也由P-HEMA引起，信号在848厘米处-1可以分配给γ（CH.2） 或者ν(碳碳)53.］.变形局限于OCH2CH.2在955厘米处可以看到p-HEMA分子的OH部分-1[53.］.信号在1280.5厘米处-1可以分配给ν（C-O）和ν从PMMA (C-COO)。在1448.8厘米-1[52.]，由(C-CH2)，可以观察到[53.］.来自P-IEMA的芳香环伸展率为1586.41厘米-1[54.］.另一个来自羰基的信号在1719.8厘米处观察到-1（ν（c = o）h从p-hema或p-tegdma键合[55.］.宽频带约2949厘米-1源自PMMA (νS.O-CH的（CH）3.与νS.（C-H）的αch3.和ν一种（CH.2））[52.］.最后，肩高3065厘米-1可能来自p-IEMA的碘苄基部分或PMMA和p-TEGDMA的各种信号[52.那55.］.

3.3。甲苯胺蓝（TB）滴定

带负电荷的核苷酸链的球体的表面上存在由一个TB试验研究。正如前面描述的，每个TB分子含有芳香族阳离子链段和氯阴离子（图3(一个)）.ph敏感的吸附/解吸机制导致TB染料在碱性环境中电离(图)3(一个)， 第1步）。带正电荷的Tb然后绑定为负面 所述miRNA的基团（图3(一个)，步骤2)，并在随后降低pH值时解吸(图3(一个)，步骤3）。通过UV-Vis测定的TB染料的浓度预期是正比于微球的表面上的捕获探针的浓度。

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图3.
间接确认球形表面上捕获探针的间接确认的TB分析：（a）Tb分子的吸附和解吸机制到 通过从碱性至酸性环境的pH改变pH值的球体表面上可用的核苷酸组;（b）通过使用不同浓度的校准溶液滴定Tb测定绘制的校准曲线（2 μ米,4μ男，6 μ男，8 μ10 M,μ米);(c)每毫米TB吸光度2用紫外-可见光谱法(635 nm)测量表面;(d)结核分析的分解计算。60 . AFM分析((eμM)和放大视图(f) 10μM)和(g) 10μM)，杂化链表面附着后，表面粗糙度变化明显。

数字3（b）在酸性溶液中，TB测定具有高度线性校准曲线。虽然TB的浓度被认为与球表面捕获探针的浓度成正比，但重要的是要注意TB测定的结果是这种相关性的比较手段。数字3（c）表示来自不同尺寸组的10mg球体上的Tb吸光度。如可以观察到的，随着球体的尺寸增加，Tb吸光度增加，这表明较高的粒度允许较高数量的Tb染料分子结合到表面上的捕获股线，即使提供了较低的总表面积尺寸较大。后者通过：由于球体的尺寸增加，空间自由度用于捕获探针和Tb分子之间的有效相互作用的速度增加，因此随着球体的尺寸增加而增加[49.那56.那57.］.The approximate size of the TB molecules (≈0.7 to 1.1 nm) is in the range of the length of a horizontally oriented single miRNA strand (≈1 nm) on the beads so the more the space for maneuvering between the strands, the easier it is for TB to bind [58.那59.］.可能是可用的表面功能与miRNA股;因此，较小粒径微球上的miRNA间距离将使Tb扩散相当困难，这是施加较大球尺寸时的情况。在图中3.（d），提供了TB测定的击穿计算。该分析提供TB的近似浓度每毫米染料2球形表面。捕获探针的每条链由25个核苷酸组成 组。众所周知，TB与阴离子硫酸盐、羧酸盐和磷酸盐具有高度的相互作用[60.］.如果正电TB和负电TB之间相互作用 组发生在1：1的比例中，Tb吸光度将与每个mm上存在的捕获探针成比例2球的表面(图3（d））;因此，可以间接计算固定在球体总表面上的捕获探针的数量(图)3（d））.

3．4．miRNA固定前后微球的形貌分析

通过AFM分析微球的表面形貌，以在miRNA固定化之前和之后研究表面变化（粗糙度和表面积）。AFM分析（如图所示3 (e)和3 (f)， miRNA固定化前，图3 (g)(固定后)显示了原始表面之间表面地形的明显变化(图)3 (e)和3 (f)，放大视图），并且表面的miRNA固定之后（图3 (g)）.对于MiRNA固定前后的球体的表面，记录了增加的表面粗糙度（从6.8nm至41.2nm）。作为杂交链偶联的结果，捕获探针与标记的miRNA分析物共享12个核苷酸。因此，偶联的链含有总共33个核苷酸。了解每个核苷酸（~1nm）的近似大小，杂交链的尺寸可以大致粗略计算（〜33nm）。该数量与AFM（34.4nm）分析的改进的表面粗糙度紧密相对应。另外，当在固定前将表面固定的球体与其中的那些相比，发现记录的表面积更大〜100倍（从1 μm2到100.6 μm2）.这种表面区域的增强是存在于生物接受微球表面的杂交链的直接功能。

3.5。MIR159间接检测中微球的性能分析

数字4（a）示出了一个对数标度绘制在标记的miRNA的不同浓度进行的每个微球大小的组的校准曲线。增加相关系数值分别观察到MMS-1，MMS-3和MMS-4，。数字4 (b)和4 (c)在检测1nm和100nm的标记分析物中分别描述球体的荧光图像。根据这些图像，球体的部分聚类具有似乎有限的完全分析物表面相互作用。掺入温和的混合/摇动系统可以是允许球体更好地可达的合适方法，并进一步增强检测信号。

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图4.
用于miR159检测的微球的性能分析:(a)不同浓度标记miRNA (1 nM, 10 nM, 100 nM和1000 nM, 100 pM, 10 pM和1 pM)中不同尺寸的微球的校准曲线;(b, c)分别检测1 nM和100 nM标记miRNA后的微球(以MMS-3为代表)荧光图像;(d)通过间接检测miRNA对球体进行性能分析，对比截止值，截止值是不同尺寸类别(标记的miRNA浓度= 1 nM)计算的平均阴性对照组的两倍;(e)用荧光Cy3-miR159(浓度:1000 nM或100 nM)和非共轭miR159在不同浓度(1000、100和10 nM)下的混合物进行竞争分析得到的相对荧光信号;以及(f)球体表面和捕获探针之间可能的物理相互作用的示意图。

数字4 (d)与它们的截止值相比，提供与它们的截止值相反的不同尺寸组之间的检测性能比较（呈现红色的阴性结果的两倍）。该图表中的检测信号用其原始值绘制，而不减去截止值以进行大小组之间的详细性能比较。可以看出，与最大尺寸类别（MMS-4）相比，MMS-1，MMS-2和MMS-3组的MMS-3组提供更高的检测信号，当从实际检测信号中减去截止值时。本研究中发育测定中获得的总信号强度落在先前报道的中，以使用固相杂交测定成功检测miRNA [7.那61.］.然而，先前报告的检测方法都没有依赖于常规ELISA用于检测miRNA，这是目前研究的点。

3.6。竞争性测定中微球的性能

球体的性能在竞争性测定进一步评估。在这个协议中，浓度荧光标记的Cy3-miR159保持不变，而未标记的合成miR159（靶分析物）的浓度是变化的，导致降低的荧光强度作为目标分析物的浓度增加。数字4.(e)代表以MMS-3类球体为代表进行的竞争性分析的结果。未标记miRNA的浓度(X- 轴）以对数刻度呈现，而y- XIS描绘了相对荧光强度。由于未标记的miRNA浓度增加的结果，荧光强度的系统降低提供了明确的概念证据，即所提出的杂交测定是在该传统平台内定量MIR159的简便且可靠的方法。

3.7。可能Analyte-Surface交互

微球的表面促进感兴趣的分析物和表面之间的各种相互作用类型。数字4.（F）图式化球体的工程化表面和所述核苷酸链之间的可能的物理相互作用。之间的氢键（H-键） 和-NH.2捕获探针组和球体的-OH组的可能性最大。氢键发生在球的-OH基团的H原子(O和H是共价结合的)和带有孤对电子的mirna的N和O原子之间。此外，球体的芳香环可以带负电荷 离子吸引力的生物分子组（静电相互作用）[62.］.此外，球体的羰基（-C = O）可以促进与生物分子相互作用的范德华力[63.］.此外，疏水相互作用可以在将mirna吸引到表面上发挥主要作用[62.那64]，由于参与球体化学合成的单体主要是其性质中的疏水性[37.］.身体吸引的这个大量可强烈地影响生物分子固定化和miRNA的后续检测。值得注意的是，在球的表面官能团的固有存在也促进在表面通过的零长度交联试剂或间隔[应用生物分子的共价连接49.那56.］.

3.8。评估测定

在没有微球的常规96孔板中进行的测定进行并评估其在miRNA检测中的性能。数字5.详细分析了常规检测方法在miR159检测中的作用:(a)检测性能;(B)校准分析;(C)分析的评价。与获得的阴性对照对应的截止值相比，96孔板中的常规分析显示出相当低的检测能力(图)5(一个)）.虽然校准图指的是标准线性水平，但该分析方法已被证明存在低分析灵敏度(50%)、低准确度(40%)和不可接受的LOD(图)5 (c)）.96孔板的性能与没有微球的性能之间的比较显示，由于微球的存在，显着的检测增强（图5 (c)）.特别的是，大小为3的微球组的荧光强度比传统的检测方法高10倍，这种方法能够检测具有挑战性的生物分子作为miRNAs黄金标准技术。

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图5.
常规96孔板性能评价:(a)常规96孔板miRNA检测性能分析(标记miRNA浓度为1 nM);(b)绘制不同浓度标记miRNA (1 nM, 10 nM, 100 nM, 1000 nM)的ELISA校准曲线;(c)评价分析方法和计算的分析灵敏度、特异性、准确性和LOD。

表格1总结了集成微球法测定的评价参数。可以看到，在常规分析中应用这些球体，无论大小类别，其分析灵敏度都是100%。特别是MMS-1大大提高了分析的特异性。除了MMS-4，所有尺寸类别的lod都在皮摩尔范围内，这对于miRNA的检测是非常理想的。在MMS-4中，记录的分析物最低浓度的标准偏差导致LOD结果不如其他大小组的结果好。值得注意的是，该尺寸类别(MMS-4)的高TB吸收并不能保证其在分析分析中的更好性能，因为评价参数也是阴性对照、校准曲线斜率和标准偏差等关键元素的函数。
检测状态 MMS-1 MMS-2 MMS-3 MMS-4
+ - + - + - + -
阳性（TP，FP） 20. 1 20. 3. 20. 3. 20. 3.
负（Fn，Tn） 0. 9. 0. 8. 0. 7. 0. 7.
全部的 20. 10. 20. 10. 20. 10. 20. 10.
灵敏度 （％） One hundred. One hundred. One hundred. One hundred.
特异性（％） 90 80 70 70
准确性 （％） 93 90 86 90
LOD (pM) 90 40 50. 2×106.
表格1
计算微球在miRNA检测中的分析灵敏度、特异性、准确性和LOD。

虽然文献报告了广大提供了洞察biodiagnosis战略，敏感，选择性，访问和成本效益的miRNA检测仍然是一个挑战[65］.循环mirna以ng/mL水平存在于血液中。根据碎片的长度，它对应于皮摩尔范围内的分子浓度[66］.考虑到mirna的丰富程度，高效检测这些具有挑战性的生物实体需要高水平的灵敏度和选择性。虽然一些研究已经引入了超敏感靶向mirna的新方法或改进策略[67-79]，目前常规检测方法为凝胶电泳、聚合酶链反应(PCR)和实时聚合酶链反应(RT-PCR/qRT-PCR)。表格2提供了不同方面的商业应用技术的比较与提出的方法在这里。该表总结了这些技术的时间、复杂性、可访问性、特异性、敏感性和LOD。而本研究中提出的策略不如PCR或qRT-PCR有效(LOD比较见表)2)，它可以广泛地在任何实验室设置。然而，这不是PCR/RT-PCR的情况，这通常是由高度复杂的机器操作。通过结合振动/混合技术，可以进一步增强所提出的策略的LOD，这将允许球体有更高的机会与生物分子相互作用。相比之下，该策略的操作复杂度最低。96孔板几乎可以在任何实验室设置，熟悉金标准检测方法的实验室技术人员无需进一步培训就可以执行分析协议。最重要的是，PCR/RT-PCR比拟议的分析方法便宜得多，但其准确性可能会受到污染的影响。
平台 时间(分钟) 复杂 可访问性 特异性 灵敏度 LOD 参考
凝胶电泳测定 ∼280 中等程度的复合物取决于化验类型 在常规实验室设置中高度可访问 标准程序可能会诱导非特异性绑定的机会;感兴趣的DNA片段必须是凝胶纯化并验证以避免非特异性绑定 不适合检测低浓度 依赖于测定类型（皮摩尔愤怒） [80那81]
聚合酶链反应（PCR） 约35 复杂，昂贵，耗时，劳动密集型 不适合许多实验室设置 高度特点 通过污染引起伪DNA产品的扩增可以损害精度 Femtomolar范围 [65]
实时聚合酶链反应（RT-PCR / QRT-PCR） ∼120 底漆设计、标准化和优化技术是复杂的 涉及具有挑战性和个性化的流程 mirna的高通量定量容易出错 [65那82]
聚甲基丙烯酸酯sphere-based化验 ∼240 简单而直截了当 在常规实验室设置中高度可访问 适度特定 高度敏感 皮摩范围 目前的研究
表2
本发明方法对MiRNA检测的商业技术的比较。

4。结论

在这项工作中，我们已经证明了miRNA检测的概念证据方法。将甲基丙烯酸酯微球整合到96孔板中，并使用固定化的DNA探针捕获并检测皮摩尔范围内的miR159。由于球体存在，可以改善包括分析敏感性，特异性，准确性和检测极限的所有重要参数。这尤其具有很大的优点，因为这种简单的集成提供了生物释认的机会，用于具有挑战性的生物分子，包括在任何实验室设置中通常可用的传统平台内的miRNA。聚合物微球的施用保持巨大潜力，因为它们是经济效益的生物抑制平台，其可以以所需的尺寸范围和受控性能批量生产，这取决于所需生物识别的类型。

数据可用性

所有数据都在手稿中呈现。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

萨米拉·侯赛尼(Samira Hosseini)和帕特丽夏·Vázquez-Villegas也做出了同样的贡献。Marc Madou负责概念化。Samira Hosseini、Patricia Vázquez-Villegas和Margarita Sanchez-Dominguez参与了形式分析。Sergio Martínez-Chapa进行了融资收购。Samira Hosseini, Patricia Vázquez-Villegas和Leo Koole进行了方法论研究。Marco Rito-Palomares负责项目管理。Marco Rito-Palomares和Leo Koole提供了资源。Samira Hosseini、Richard Willson、Leo Koole、Marc Madou和Sergio Martínez-Chapa指导了这项研究。萨米拉·侯赛尼(Samira Hosseini)和马克·马杜(Marc Madou)撰写了初稿。玛格丽塔·桑切斯-多明格斯撰写并编辑了这份手稿。

致谢

作者要感谢Tecnológico蒙特雷，生物过程和合成生物学主席（批准0821C01004）的资金支持。作者也想感谢Tecnologico蒙特雷，墨西哥的金融支持，特别津贴（批准号：002EICII01）颁发的纳米传感器和设备专题小组，工程与科学，Tecnologico蒙特雷，蒙特雷学院，墨西哥。作者也想感谢奥斯卡E.维加博士和J.亚历杭德罗·斯佩 - 萨帕塔博士（CIMAV南卡罗团结报蒙特雷），用于进行AFM分析和拉曼测量，分别。

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