提高疗效的Puerarin-Encapsulated PEG-PLGA纳米颗粒在体外脑梗死模型

文摘

本研究旨在探讨葛根素的疗效和机制(PUE)结合聚乙二醇纳米颗粒在老鼠脑梗死细胞模型。在这种背景下,PEG-PLGA / PUE纳米粒子是由薄膜水化法和PEG-PLGA / PUE纳米颗粒的毒性脑毛细血管内皮细胞(BCEC)被MTT检测。BCEC / TF细胞模型是通过感应BCEC细胞与肿瘤坏死因子-α。BCEC / TF细胞模型是由免疫荧光标识;蛋白表达是由免疫印迹检测;mir - 424细胞的表达水平是衡量RT-qPCR;针对mir - 424之间的关系,证实了PDCD4 dual-luciferase记者分析。我们发现PEG-PLGA / PUE纳米粒子由薄膜水化法均匀粒径,常规的形状,和良好的稳定性和细胞没有毒性。的vWF BCECs广泛表达于细胞质中。BCEC / TF TNF-α治疗后获得的细胞模型,和组织因子(TF)表达被广泛BCEC / TF细胞的细胞膜上。此外,它是发现PEG-PLGA / PUE纳米颗粒显示更好的疗效比PUE BCEC / TF细胞模型。PEG-PLGA / PUE纳米颗粒和PUE抑制PDCD4蛋白的表达增加mir - 424的表达在BCEC / TF细胞。 In summary, the therapeutic effect of PEG-PLGA/PUE nanoparticles on the in vitro cell model of cerebral infarction is better than that of PUE. Moreover, PEG-PLGA/PUE inhibits the expression of PDCD4 protein by lowering the expression level of miR-424 in cells, thereby reducing the hazard of cerebral infarction.

1。介绍

葛根素(PUE),一个异黄酮活性成分提取豆科植物的根状茎葛根和南五味子南五味子抗氧化,降低胆固醇,降血压效果和常用治疗心血管和脑血管疾病(1]。然而,PUE是有限的临床应用其溶解度低,半衰期短,低浓度的脑组织,人体和绝对生物利用度较低。

近年来纳米药物输送系统已经使用目标药物到特定的网站来提高药物的生物利用度。然而,普通的纳米颗粒是静脉注射后迅速清除,这间隙应避免在药物输送到肝脏以外的组织。一层亲水聚合物是由普通纳米颗粒表面的物理吸附,这样的纳米颗粒被称为聚乙二醇纳米颗粒。聚乙烯glycol-poly lactic-co-glycolic酸(PEG-PLGA)共聚物作为nanopolymer载体和特点。的PEG-PLGA聚合物两亲性是因为亲水、亲脂性的双方。此外,具有良好的生物相容性和nonimmunogenicity,它有一个聚乙二醇纳米领域广阔的应用前景。基于上述优势,因此PEG-PLGA纳米粒子可以延长循环时间、加载系统的血液,从而针对特定组织或器官,发挥持续的释放和长期疗效[2]。它已经被记录(3]PEG-PLGA纳米粒子可以达到深层渗透,在肿瘤组织有很长的停留时间。作为脑梗死部位和肿瘤组织有相似的炎性浸润,推测PEG-PLGA纳米粒子可以脑梗死部位起到类似的作用。因此,PUE的治疗效果和潜在机制结合PEG-PLGA纳米颗粒在老鼠脑梗死细胞模型研究提供一个新的理论依据脑梗死的治疗。

2。材料、对象和方法

2.1。研究和设计

这个实验协议是一个体外控制研究的基础上设计的。

2.2。研究材料

动物。清洁SD雄性大鼠(50 - 60 g)是购自湖南Silaike Jingda实验动物有限公司有限公司

2.3。药品和试剂

药物。葛根素(纯度≥98.0%)是购自上海阿拉丁生化科技有限公司有限公司

试剂。PEG-PLGA购自上海Shunna生物科技有限公司有限公司;甲醇、75%乙醇、4%多聚甲醛,甘油从山东购买白药化工有限公司,有限公司;MTT装备,D-Hanks, Percoll梯度离心法解决方案,BSA,和胶原酶二世从北京购买Kanglong Kangtai生物技术有限公司有限公司;多克隆兔反VWF抗体,兔子anti-rat TF多克隆抗体,和DAPI从Sangon购买生物工程(上海)有限公司,有限公司,TNF -α购自上海酶联生物科技有限公司有限公司;总RNA提取设备和cDNA逆转录工具包购自上海及其生物科技有限公司有限公司;总蛋白提取设备、ECL工具包和dual-luciferase记者分析工具包是购自南京Camilo生物工程有限公司有限公司. .

2.4。实验方法

2.4.1。制备PEG-PLGA / PUE纳米颗粒

PEG-PLGA / PUE纳米粒子是由薄膜水化法使用以下过程:一定量的PUE和PEG-PLGA称重和完全溶解在一定体积的甲醇。解决方案将被放置在一个旋转瓶在35°C和氩保护。加热停止时干膜组成。10 h后在室温下吸尘,剩下的有机溶剂移除,这部电影被添加PBS缓冲水化,水化后的在合适的温度为60分钟,20分钟的超声波,站在室温1 h。后来,沉淀是被过滤为0.2 3到4倍μ米微孔隙,使粒径的纳米颗粒均匀,和PEG-PLGA /聚氨酯纳米粒子通过被冷冻干燥24小时。

2.4.2。确定封装效率和药物加载

500年μL PEG-PLGA / PUE纳米颗粒微孔过滤是利用离心力分离后10分钟,每分钟12000转高速和低温,上层是药物纳米颗粒。封装结构的纳米颗粒被添加10卷的甲醇溶液完全释放PUE,和药物加载PUE的纳米粒子通过高效液相色谱法测定和记录为M_负载。同样的方法被用来计算药物在500年的总量μL的纳米粒子,记录为M_总,PUE封装效率可以通过使用下面的公式:PUE封装效率= M_负载/ M_总。

适量的PEG-PLGA / PUE纳米冻干粉重,与它的质量记录为W₁。封装结构的纳米颗粒被摧毁的甲醇通过添加10卷粉,和药物的纳米颗粒通过高效液相色谱法测定和记录为W₀。PUE药物加载可以通过使用下面的公式:PUE药物加载=W₀/ W₁。

2.4.3。PEG-PLGA / PUE纳米粒子的识别

适量的准备PEG-PLGA / PUE纳米颗粒与蒸馏水稀释和均匀分布与超声波的使用。一滴纳米颗粒悬浮放置到铜网格和多余的液体吸干在室温下。的形态学nanomicelles当时透射电子显微镜下观察到在没有液体的铜网格。PEG-PLGA / PUE纳米颗粒的粒度分布测定ζ电位计(Zetasizer Nano-ZS;莫尔文仪器)。一个适当数量的纳米颗粒是用蒸馏水稀释10毫克/毫升,和0.5毫升的纳米颗粒的解决方案是添加到2.5毫升的硫酸钠溶液在不同浓度。解决方案被允许站10分钟37°C紧随其后的测量吸光度使用分光光度计560纳米的纳米粒子,纳米粒子的稳定性进行了评价。

2.4.4。MTT测定细胞生存能力

对数生长期的细胞增长与胰蛋白酶消化,和单细胞停赛5×10的细胞密度⁴细胞/毫升进行调整。96孔板的细胞被播种在100集中μL /好,之后的干预药物添加细胞覆盖的底部。六个复制井设置每组中,一个空白控制集。72 h细胞被孵化的37°C, 5%的公司₂。后来,每增加10μL 0.5%的肝癌和解决方案其次是另一个4小时的潜伏期。空白对照组设置为零后调整,570海里的吸光度在每个波长是由使用一个微型板块读者。细胞生存能力是使用公式计算:细胞生存能力(%)=实验组和对照组×100%。

2.4.5。老鼠BCEC细胞的分离和鉴定

隔离。3个干净SD雄性老鼠被颈椎脱位牺牲,在75%乙醇浸泡3分钟。老鼠大脑是通过隔离的皮层和冲洗3次冰D-Hanks脑膜后删除。大脑组织切成1毫米³立方体然后消化0.1%胶原酶II 90分钟,上层清液是通过在1000转离心20分钟在4°C。BSA(20%)加入1毫升的脑组织颗粒。解决方案再次在1000转离心20分钟后在4°C沉淀是分散的。再次在37°C 0.1%胶原酶的加入为60分钟,消化和解决方案是离心机的上层的丢弃。当时分散沉淀均匀Percoll梯度的解决方案,并在4°C离心后10分钟,观察到明显的分层。黄白色微血管的片段是吸气,冲洗两次,培养对微血管内皮细胞培养基含有MVGS 37°C 5%股份有限公司₂。

识别。执行固定用4%多聚甲醛在室温20分钟后跟PBS冲洗三次,每次5分钟。10%的细胞被孵化山羊血清为30分钟37°C,培养与兔子anti-vWF多克隆抗体(1:200)在4°C一夜之间,与PBS缓冲液冲洗3次,每次5分钟。第二天,细胞与PBS缓冲液冲洗三次,每个与DAPI孵化(1 5分钟μ在室温下g / mL) 10分钟,然后用PBS缓冲液冲洗三次每个5分钟。幻灯片终于安装在50%甘油和使用共焦激光扫描显微镜观察。

2.4.6。建设和BCEC / TF模型的识别

建设。河鼠BCECs被播种与TNF - 6-well盘子然后孵化α(100 ng / mL) 2 d 12 h后刺激TF表达。

识别。用4%多聚甲醛固定后,使用兔子anti-rat TF多克隆抗体进行免疫荧光染色(1:200)根据先前所描述的过程。共焦激光扫描显微镜用于观察后安装。

2.4.7。蛋白表达量的蛋白免疫印迹

细胞总蛋白的提取使用工具包,转移到膜十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳后,阻塞和脱脂奶粉1 h。添加了相应的抗体,和二级抗体膜清洗后添加。后来,发射极耦合逻辑添加颜色发展,使用凝胶成像仪观察拍照。

2.4.8。由RT-qPCR microrna的表达水平来衡量

细胞被播种密度1×10⁶/在一个6-well板,24小时后,培养基被丢弃在转染前。转染24小时后,使用一个RNA提取的总RNA提取工具,然后reverse-transcribed cDNA RNA。mir - 424的上游引物5′- CAGCAGCAATTCATGTTTTGAA-3′;下游引物5′-TTGTCGTCGTTAAGTACAAAAC-3′;内部参考U6上游引物的5′- CTCGCTTCGGCAGCACA-3′;下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT 3′。反应是在10μl 2×一体化qPCR混合,2μl通用适配器PCR引物2μl一体化的microrna qPCR底漆2μl cDNA、和4μl ddH2O。反应条件如下:95°C, 10 s;95°C, 3 s;80°C, 20年代;20年代和72°C,总共40个周期。

2.4.9。Dual-Luciferase记者分析

引物的microrna的信使rna和蛋白质预测和设计和插入pDCD4-wt pDCD-mut质粒后被测序鉴定。与20 ng的质粒cotransfection细胞后,mir - 424模拟miR-NC质粒,荧光强度测量使用dual-luciferase记者分析。

2.5。统计处理

使用SPSS 20.0统计分析。组织使用之间的数据进行比较t以及使用单向方差分析和在多个团体,和特定的数据由均值±标准差表示。

3所示。结果

3.1。PEG-PLGA / PUE纳米粒子的表征和评价

PUE封装效率和药物装载在PEG-PLGA / PUE纳米颗粒分别为83.6%和9.7%,分别,这表明PEG-PLGA / PUE纳米粒子成功准备。图1(一)显示了PEG-PLGA / PUE的决心通过透射电子显微镜(TEM)纳米颗粒。图1 (b)展品PEG-PLGA / PUE纳米粒子的粒度分布,并可以看出PEG-PLGA / PUE形成一个统一的单分散nanosolution (PDI = 0.13),平均粒径为116.4 nm的影响下水溶性维生素e .图1 (c)显示了纳米颗粒的吸光度值在560海里通过使用分光光度计测量系统。当硫酸钠的浓度低于0.45 mol / L,纳米颗粒系统的吸光度值没有显著变化,而纳米颗粒系统的吸光度值显著上升时,硫酸钠的浓度大于0.45 mol / L。即临界絮凝PEG-PLGA / PUE纳米粒子的浓度为0.45 mol / L,这远远超出人类血液中电解质浓度,表明PEG-PLGA / PUE纳米颗粒具有良好的稳定性。图1 (d)用MTT试验显示细胞毒性的测定。coincubation 72 h后老鼠BCECs和PEG-PLGA / PUE纳米颗粒,老鼠的存活率BCECs都在94.1%至105.6%之间,表明PUE-PEG-PLGA纳米颗粒有很好的生物相容性。

3.2。BCEC / TF模型建设和识别

产品通过离心接种成6-well板包含MVGS微血管内皮细胞的培养基。大约两周后,基本上汇合的老鼠BCECs在长轴的形状,形成一个紧密的单细胞层板的底部,和重要的接触抑制可以观察到。老鼠BCECs亚文化。第三代细胞融合后,发现老鼠BCECs显示“石板”外观和细胞呈现湍流安排。免疫荧光染色结果表明,鼠BCECs强烈表达了vWF,早期血管内皮细胞激活标记,主要在细胞质中(图2(一个))。老鼠BCECs治疗与肿瘤坏死因子-α12 h,观察到TF强烈表达鼠BCECs细胞膜,而只有跟踪TF表达在老鼠BCECs TNF -α治疗(图2 (b))。

3.3。评估的影响PEG-PLGA / PUE BCEC / TF细胞

Thrombomodulin (TM)和白介素(il - 6)产生相应的变化与脑梗死的发生;因此,检测TM和il - 6的表达水平在BCEC / TF细胞通过免疫印迹可以反映药物对脑梗死的治疗效果。免疫印迹结果表明TM和il - 6的表达鼠BCEC / TF细胞对照组最高,而TM和il - 6在BCEC / TF细胞cocultured PEG-PLGA / PUE (PUE浓度为0.5毫克/毫升)是最低的 ),对应于一个较低的TM和il - 6的表达BCEC /细胞TF cocultured PUE(0.8毫克/毫升)( )(图3)。上述实验结果表明,PEG-PLGA / PUE纳米粒子有更好的疗效比PUE BCEC / TF细胞。

3.4。的作用机制PEG-PLGA / PUE BCEC / TF细胞

RT-qPCR结果表明,mir - 424的表达水平BCEC / TF细胞明显低于BCEC细胞( ),但mir - 424的表达水平在BCEC / TF细胞增加与葛根素干预后或PEG-PLGA / PUE纳米粒子,和数据具有统计上的显著差异( )。此外,mir - 424的表达水平是最高的在coculture BCEC / TF PEG-PLGA / PUE纳米颗粒(图4(一))。miRDB数据库预测,程序性细胞死亡因素PDCD4可能mir - 424(图的目标基因4 (b)),这证实了dual-luciferase记者化验的结果(图4 (c))。免疫印迹结果表明,细胞程序性死亡4的表达(PDCD4)减少BCEC / TF细胞转染mir - 424模拟矢量(图4 (d))。PDCD4 BCEC / TF的表达细胞cocultured PUE或PEG-PLGA / PUE纳米粒子也减少,差异具有统计学意义( )(图4 (e))。总之,PEG-PLGA / PUE纳米颗粒能有效提高mir - 424 BECE / TF表达的细胞,实现有针对性的抑制PDCD4蛋白的表达。

4所示。讨论

脑梗死是一种常见的和频繁的脑血管疾病,发生在任何年龄,和脑组织坏死随位置和血栓的大小。大多数病人遭受大规模的脑梗塞,通常出现在大脑中动脉和颈动脉。现代药理研究表明,PUE可以增加脑血流量,大脑血管扩张,改善脑梗死患者的脑微循环,从而有效地修复大脑损伤(4- - - - - -6]。尽管一些研究已经表明,PUE更有效治疗急性脑梗塞患者,在临床实践中的应用仍然是有限的由于溶解度差和极低的生物利用度在人体7]。血脑屏障(BBB),大脑形成的一个独特的防护结构在长期的演化过程中,形成紧密结合脑毛细血管内皮细胞和防止血液中大多数物质进入大脑,包括药物作用于大脑的疾病。因此,仍有一些脑部疾病,因为缺乏有效的药物的障碍阻碍药物具有良好的活动达到的焦点。组织因子(TF)是细胞受体在血浆凝血因子VIIa TF-VIIa复杂可以激活修复和FX水解前凝血酶凝血酶,从而凝固的血液。TF是正态分布在血液循环,血液细胞接触TF-expressing启动凝血过程只形成血栓的血管和内皮细胞破坏。因此,TF上述特色已成为一个研究热点brain-targeted药(8,9],BCEC / TF细胞模型是一个通用模型为研究脑梗死或脑血栓形成体外。在这项研究中,BCEC细胞被隔离了老鼠大脑组织和TF-expressing鼠BCEC细胞获得使用TNF -α诱导实验。

纳米颗粒作为药物载体,可以调节药物释放率和增强药物渗透,从而增加药物的生物利用度。然而,普通纳米颗粒迅速清除进入人体后,不能达到预期的效果,因此纳米粒子与“隐形”能力吸引了越来越多的学者们的关注。聚乳酸改性的聚乙二醇(PEG)的聚丙醇,聚乳酸纤维聚乙醇酸共聚物(PLGA)两亲性,导致更好的亲水性纳米颗粒表面的性质,和可以减少识别或移除RES (10]。PEG-PLGA纳米颗粒在人体血液循环时间长后结合药物,导致大大提高药物的生物利用度11,12]。这是推测PEG-PLGA / PUE纳米粒子更有效比PUE脑梗死的体外细胞模型,并证明了在这项研究中,PEG-PLGA / PUE纳米颗粒有较强的抑制效应在TM和il - 6蛋白的表达比PUE老鼠的EC / TF细胞。

小分子核糖核酸(microrna),非编码RNA分子的22个核苷酸长度小,参与人体的各种生理活动。研究表明,mir - 424的表达强度在脑梗死患者的血清低于健康人的血清和mir - 424表达可以抑制G1 / S的激活和翻译转换因子,可作为脑梗死(新的干预目标13]。在这项研究中,我们发现mir - 424的表达强度显著降低鼠BCEC / TF细胞,而其表达后再增加PUE的介入和PEG-PLGA / PUE纳米颗粒。miRDB数据库预测结果表明,PDCD4可能mir - 424的下游靶基因,这证实了dual-luciferase记者分析。郭等人报道,减少PDCD4表达能促进神经细胞的再生而抑制细胞凋亡,从而缩小脑梗死患者的神经缺陷(14]。此外,我们发现PDCD4蛋白质的表达水平在BCEC / TF细胞明显高于BCEC细胞。mir - 424的超表达是紧随其后的是PDCD4蛋白表达降低BCEC / TF细胞。

总之,治疗效果PEG-PLGA / PUE纳米颗粒对脑梗死的体外细胞模型优于PUE,和PEG-PLGA / PUE减少脑梗死的危险增加mir - 424的表达水平的细胞而抑制PDCD4蛋白质。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

本研究支持的重点科技项目由河南省科学技术厅(122102310013)。

引用

1. x谢,Y z, d . p .μ,x l .锅和f . Y,“评价葛根素注射液在临床安全使用,“中国姚明,43卷,不。19日,3956 - 3961年,2018页。视图:谷歌学术搜索
2. x y刘、江z . b . j .罗j·h·李和x b·胡“体外评价,细胞吸收和anti-acute心肌缺血的影响葛根素PEG-PLGA胶束,“中国姚明,44卷,不。11日,第2250 - 2244页,2019年。视图:谷歌学术搜索
3. z . b .赵,j .长,y y赵et al .,“适应性免疫细胞所必需的sorafenib-loaded纳米颗粒增强的治疗效果,”Biomater Sci》第六卷,没有。4、893 - 900年,2018页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. y . Chang彭译葶。谢长廷,Z.-A。彭et al .,“神经保护机制在大脑中动脉葛根素occlusion-induced脑梗死大鼠,”生物医学科学杂志,16卷,不。1,p。9日,2009。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. 惠普,j . z杨x l . Mo et al .,“保护葛根素在大鼠急性脑损伤局部缺血,”中国姚明,30卷,不。6,457 - 459年,2005页。视图:谷歌学术搜索
6. r·张h . n .郭h .问:吴h . x Cheng和h .问:王”保护作用的葛根素对钙超载在大鼠局灶性脑缺血损伤后,“保南方亦可达雪雪,30卷,不。6,1268 - 1271年,2010页。视图:谷歌学术搜索
7. h·t·胡、f .沼泽和m·p·丁”葛根素的作用与阿司匹林在受损的血管内皮细胞的标记在急性脑梗死患者,”中国姚明,33卷,不。23日,第2829 - 2827页,2008年。视图:谷歌学术搜索
8. c·c·维瑟s Stevanovićl .本意Voorwinden et al .,“验证转铁蛋白受体的药物针对脑毛细血管内皮细胞体外,”药物杂志》的目标,12卷,不。3、145 - 150年,2004页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. c·c·维瑟、美国Stevanović和l .本意Voorwinden,“用蛋白质药物靶向脂质体在体外血脑屏障,”欧洲制药科学杂志》上,25卷,不。2 - 3、299 - 305年,2005页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. j . k .张x Tang Zhang et al .,“PEG-PLGA共聚物:其结构和structure-influenced药物交付应用程序,”《控释卷,183年,第86 - 77页,2014年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. z, j .黄y徐et al .,“Co-delivery顺铂和紫杉醇的叶酸共轭两亲性PEG-PLGA共聚物纳米颗粒治疗非小肺癌,”Oncotarget》第六卷,没有。39岁,42150 - 42168年,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. h·李,y, l .白et al .,“乳铁蛋白纳米粒子功能化PEG-PLGA紫草素对脑胶质瘤的靶向治疗,”国际期刊的生物大分子,卷107,不。Pt, 204 - 211年,2018页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. l·h·赵j . Wang高et al .,“microrna - 424对永久性局灶性脑缺血损伤保护老鼠涉及抑制小胶质细胞激活,“中风,44卷,不。6,1706 - 1713年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. Y.-B。郭,T.-F。霁,H.-W。周,J.-L。Yu”microRNA-21对神经细胞再生和神经功能恢复糖尿病结合针对PDCD4脑梗死大鼠,”分子神经生物学,55卷,不。3、2494 - 2505年,2018页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

版权

版权©2020雷雳et al。这是一个开放的分布式下文章知识共享归属许可,它允许无限制的使用、分配和复制在任何媒介,提供最初的工作是正确引用。