褪黑激素负载纳米颗粒，用于增强抗抑郁作用和HPA激素调制

摘要

背景．本研究旨在构建具有控释和ph敏感性的褪黑素纳米颗粒(MTNPs)，将褪黑素用于治疗抑郁症样行为和下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴失调。方法．根据MTNPs的大小、药物掺入和在体外在不同的pH值环境中释放。其优点是在活的有机体内对表现出抑郁样行为和HPA轴活性异常的松果体切除大鼠进行实验，计算糖精偏好的改善、游泳静止时间和HPA轴的负反馈。结果．结果表明，MTNP显示纳米尺寸，药物负荷的15.77％，封装效率的33.82％，不同的pH环境中的不同控制释放曲线（pH 1.2，pH 6.8和pH 7.4），模拟肠液中的更灵敏度释放（pH 7.4）和血液（pH6.8），模拟胃液中的敏感性较小（pH 1.2）。此外，与自由褪黑素相比，MTNP在减少强制游泳试验的不可动脉时间时显示出更好的抗抑郁作用，以增加对糖精的偏好，并敏感HPA轴的钝性负反馈。结论．纳米控释制剂是对褪黑素剂型的有效改进，值得未来全面评价。

1.介绍

2017年世界卫生组织（世卫组织）发布的报告显示，抑郁症已成为最普遍和繁琐的精神疾病[1］．目前全球约有3.5亿患者，预计到2022年，抑郁症将成为发展中国家最流行的疾病[2，3.］．褪黑激素(MT)是一种内源性生物活性物质，主要由松果体分泌[4］．褪黑素有广泛的生理活动，包括调节体温[5]神经调节[6、内分泌调节[7]，免疫调节[8，以及荷尔蒙分泌[9］．褪黑激素在抑郁过程中分泌减少，缓解后分泌增加，提示褪黑激素异常在抑郁症发病机制中发挥作用[10.，11.］．作为对抑郁神经内分泌治疗的深刻理解，已发现褪黑素对改善抑郁样行为有一定的影响[12.，13.］．Boer等人。［14.]报道褪黑素可作为一种新型抗抑郁药用于临床治疗多种抑郁症，特别是重度抑郁症(MDD)的治疗。临床研究表明MDD患者血浆褪黑素水平下降[15.］．在评价褪黑素抗抑郁疗效的临床前研究中，发现每日给药(2.5-10 mg/kg) 3 ~ 6天后，强迫游泳试验(FST)小鼠的静止期呈剂量依赖性减少[16.］．通过腹腔(0.1-30 mg/kg)或侧脑室(0.001-0.1 nmol/site)途径给予褪黑素也减少了尾悬试验(TST)中的静止期[17.］．应激诱导的小鼠高水平血清皮质酮的不可预测的慢性暴露;然而，口服外源性褪黑激素5周(1和10 mg/kg)可降低较高的血清皮质酮水平[18.］．这些研究为褪黑素作为抗抑郁剂的假说提供了直接证据，褪黑素可能对下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA)的活动具有调节作用[19.- - - - - -22.］．

口服后，褪黑激素的血液浓度迅速增加，然后迅速下降，半衰期较短，在血液中约为60分钟，生物利用度低，约为15% [23.］．制药剂型是有用的在药物传输的精度和合理化,从而实现持续稳定的药物释放和长期有效的血药浓度,避免了热电浓度的波动,减少政府的频率(24.］．此外，有效剂型还可以减少药物的副作用，如对胃肠道的保护[25.，26.］．通过使用聚合物纳米材料和药物负载的纳米颗粒技术，将褪黑激素化合物包裹并连接到纳米粒子上，以减缓溶解速率并改善药物吸收在活的有机体内［27.- - - - - -29.］．褪黑素剂型的设计已成为提高其对各种疾病疗效的新策略[30.，31.］．

本研究利用明胶、聚乳酸(PLA)和壳聚糖制备载褪黑素纳米颗粒(MTNPs)。然后是对抑郁行为和荷尔蒙分泌的影响在活的有机体内在Pinealcectomized大鼠中比较MTNP和游离褪黑素之间的比较。

2.材料和方法

2．1．载褪黑素纳米粒子的制备

将含褪黑素(0.5 mL)的无水乙醇溶液与含明胶(0.5 mL)的水溶液混合，在50℃下得到澄清溶液。将该溶液缓慢滴入含有聚乳酸(9.0 mL)的二氯甲烷溶液中，搅拌1 h，超声振动1 h，得到白色乳剂i。褪黑素、明胶和聚乳酸的最终浓度分别为0.4%、0.1%和1.2%。将乳剂I缓缓滴入含有Span-80和Tween-80的二氯甲烷溶液(30 mL)中，搅拌1 h, 39℃加热蒸发30 mL二氯甲烷，超声振动1 h，得到黄色乳剂II (10 mL)。将乳剂II缓缓滴入含0.25%壳聚糖和1%乙酸的水溶液(50 mL)中，搅拌1 h，超声振动1 h，得到白色乳剂III。将乳剂III在30℃下搅拌挥发有机溶剂24 h，再以5000 rpm/min离心得到沉淀。沉淀物经去离子水洗涤，离心3次，真空减压干燥，得到载褪黑素纳米颗粒(MTNPs)。该过程示意图如图所示1．

2．2.颗粒尺寸，PDI和形态的测量

通过动态光散射（DLS）分析MTNP的流体动力直径和多分散性指数（PDI）值。使用来自Malvern Instruments（Malvern，UK）的Zetasizer Nano分析仪进行五次测量。透射电子显微镜（飞利浦CM12，埃因霍温，荷兰）被应用于评估MTNP的形态。通过从多个TEM图像测量与ImageJ测量工具的直径来确定MTNP的粒径。

2．3.药物掺入的判定

将每毫升二氯甲烷MTNPs中的一毫克用30%乙醇稀释100倍。然后充分搅拌，静置20分钟，收集水相。用紫外分光光度计在278 nm处测定水相的吸光度。根据褪黑素在278 nm处的标准曲线计算褪黑素浓度。用公式(1)和(2),分别为

2.4。在体外释放研究

制备pH 7.4、pH 6.8、pH 1.2的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，分别用于模拟血液、肠液和胃液。10 mL 0.1 mg/mL MTNPs放入透析袋。将透析袋放入50 mL不同pH的PBS中，37℃磁化搅拌。在指定的间隔时间内，取1ml样本PBS进行分析，并补充新的PBS (1ml)。用紫外分光光度计在278 nm处测量样品PBS的吸光度，绘制累积释放曲线。所有的药物释放研究均为3个重复。

2．5．动物和组

雄性Wistar大鼠被饲养在一个温度控制的房间(25°C)，光照/黑暗周期(12:12 h, 08:00亮灯)。实验程序经湖北医科大学动物伦理委员会批准。将大鼠随机分为4组，每组10只:假手术组，正常组;Pin组，松果体切除大鼠;Pin-MT组，松果体切除大鼠给予游离褪黑激素治疗;Pin-MTNPs组用MTNPs处理去果仁大鼠。

2.6。手术和治疗

手术是按照Hoffmann和Reiter先前报道的方法进行的[32.］．短暂地，大鼠被麻醉并适应了立体定向装置，然后刮除头顶的毛发。在两耳之间切开横向切口，显露矢状缝和lambdoidal缝。用矢状缝为对称轴的尖齿毛刺从硬脑膜上剥离一块矩形骨。切断硬脑膜后，在两侧结扎矢状静脉窦并在中间切断，然后切除矢状静脉窦下的松果体。用明胶海绵止血后，将矩形骨放回原位，缝合皮肤。除了松果体被切除外，假老鼠也经历了同样的过程。手术7天后，大鼠可用于研究。

溶解在含有4％乙醇的盐水中的游离褪黑激素或MTNP，在下午17:00皮下注射。在10毫克kg的剂量⁻¹60毫克千克⁻¹,分别。这些剂量确保了给老鼠的褪黑激素的等量。假手术组和Pin组皮下注射等量生理盐水。给药持续4周。

2.7。糖精偏好测验

在给药的最后四天里，所有的大鼠都被喂食了两个称重的瓶子，一个装有纯净水，另一个装有0.1%的糖精溶液。24 h后，称重两瓶，根据检测前后的差异计算饮水量。记录连续4天的食用量，然后根据公式(3.),

2.8。强制游泳测验(FST)

在最终给药1小时后，将每组大鼠放入玻璃缸中（ϕ注满24厘米的水，在25°C。每只大鼠自由游泳6min，最后4min记录静止时间。每次试验前都更换水，以避免粪便和气味的干扰。

2.9。激素测定

地塞米松(Dex)攻毒前，采集大鼠血液，采用ELISA法检测基础皮质酮(CORT)水平。然后腹腔注射右美托咪定(30 mg/kg)抑制皮质激素的分泌在活的有机体内．注射2 h后采血，再次检测CORT水平。

2.10。统计分析

所有的统计分析都使用SPSS(版本12.0.1,SPSS Inc, Chicago, IL, usa)进行。数据表示为 ，和 被认为具有统计学意义。采用单因素方差分析，然后进行组间差异的事后检验。

3.结果

3．1.mtnp的基本特征

MTNPs的流体力学粒径为 ，PDI值为 ．TEM图像显示MTNPs的形貌为球形(图)2)．直方图表示MTNPS的粒度分布（图3.)．MTNPs的粒径分布在23 ~ 106 nm之间，平均粒径为 ．39.45 ~ 55.90 nm的粒径占51.6%，为相对集中的粒径范围。

3.2。封装效率和MTNP的药物负载

由3批生产的MTNP的药物负载是 在图4．3批样品的包封率为 ．

3.3。在体外MTNPs在不同pH溶液中的释放概况

褪黑素的释放动力学在三种不同中评估在体外环境(pH 1.2，模拟胃液;pH 6.8，模拟肠液;pH值7.4，模拟血液)。在模拟胃液(pH 1.2)中，褪黑素释放速度最慢，在8 h时小于20.3%(图)5（a）)．在模拟的肠道环境(pH 6.8)和血液环境(pH 7.4)中，PLA和壳聚糖的降解速度加快，褪黑素释放率上升至81.4%(图4)5（b））和96.7％（图5（c）)。

3．4．MTNPs对去松果体大鼠糖精偏好的影响

对糖精的偏好是评价快感缺乏的一个指标。如图所示6，在Pinealcectomy之前，每组的糖精的偏好相似（ )．松果体切除术后，Pin组大鼠对糖精的偏好显著降低( )，这表明去了松果体的老鼠有类似抑郁的行为。不同给药方式后，MT和MTNPs均可增加松果体切除大鼠对糖精的偏好。与MT组相比，MTNPs组大鼠对糖精的偏好更高，但无统计学意义。

3．5.MTNPs在FST中的作用

如图所示7，第0周时，各组在静止时间( )．松开切除术和给药4周后，显示了PIN组和假组之间的不动时间的显着差异（ )，代表诱发抑郁症的老鼠。然而，与Pin组相比，MT和MTNPs治疗组均显著缩短了FST的静止时间。此外，FST结果显示，MTNPs比MT ( )．

3.6。MTNPs对HPA轴活性的影响

观察基础状态(右美托咪定注射前)和右美托咪定注射后血浆皮质酮水平(图)8)．右美托咪定注射前，去松果体大鼠CORT基础血浆水平高于假手术大鼠，但差异无统计学意义( )．右美托咪定注射后，所有大鼠血浆皮质酮水平均显著降低( )，呈现HPA轴的负反馈机制。在分析皮层水平时，观察到PIN组的CORT级别明显高于假组（ )．与PIN组相比，MT组的内皮水平显示出降低的趋势而无统计差异（ ）;然而，MTNP组的CORT水平显著降低( )．在分析CORT水平褶皱减少时，Pin组褶皱减少明显低于sham组，说明松果体切除术损害了HPA轴的负反馈。MT组和MTNP组大鼠的CORT水平均显著降低，变化倍数显著增加( )，表示MT和MTNP可以提高否定的负反馈。与MT组中的皮质折叠的减少相比，MTNP组的减少折叠显着高（ )，暗示MTNPS改善了损坏的HPA轴超过MT。

4.讨论

虽然褪黑素迅速代谢在活的有机体内并且有一个大约60分钟的半衰期[23.[控释剂型可以延迟褪黑素残留物的消除时间体内，延长滞留时间，维持褪黑素的生理作用。褪黑素控释制剂的载体多种多样，如二氧化硅[33.，二胺聚合物[33.]、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯[34.),海藻酸(35]和聚乳酸-羟基乙酸(PLGA) [28.，36.］．本研究采用聚乳酸和壳聚糖作为褪黑素的控释载体，明胶作为分散剂。亲水性明胶是无毒、非抗原蛋白，具有乳化、稳定作用。聚乳酸具有良好的生物降解性，良好的生物相容性[37.，38.，无毒[39.］．PLA完全水解给乳酸，人体的天然物质，又转化为二氧化碳，从肺部排出[40，41.］．壳聚糖是一种具有良好生物相容性、生物降解性的天然聚氨基葡萄糖[42]和生物活动[43］．根据聚合物的特点，采用乳化-溶剂蒸发技术制备了载褪黑素纳米颗粒(MTNPs)。褪黑激素化合物被聚乳酸和壳聚糖吸附、嵌入和附着，而不是与这些聚合物化学连接，因此不会破坏褪黑激素的性质。在药物生产过程中，包封效率和粒径是两个最基本的特征。药物的用途决定了颗粒的大小。MTNPs的粒径为54.71 nm，小于100 nm，有利于达到穿透血脑屏障的可行性目的。然而，MTNPs的封装效率较低。搅拌速度、聚合物浓度和溶剂蒸发温度可调节包封效率的提高。控释的过程[44[来自MTNP的褪黑激素首先显示为吸附在MTNPS表面上的褪黑激素的分离和扩散。其次，位于MTNPS外层的PLA和壳聚糖进行肿胀，并且溶胀导致MTNPS表面上的多个微孔。这些作用促进了通过微孔的逐渐溶解和释放褪黑激素，并通过微孔促进溶剂进入MTNP的内部，从而再次加速褪黑素的溶解和释放。最后，MTNP的载体材料降解和侵蚀，从而完全释放褪黑激素。该过程起到维持褪黑激素的控制释放方面的作用。

已有文献报道褪黑素在哺乳动物胃肠道中有结合位点，这些结合位点在肠道不同区域的密度不同。Lee等发现结合部位密度由大到小依次为回肠、空肠>、十二指肠、结肠>、盲肠>、食管[45］．Poon等发现人体的结合位点主要位于结肠、盲肠、阑尾，少数肠梗阻[46］．Bubenik等人。［47相比之下，肠道内的结合位点密度总体上高于胃内。在本研究中，我们根据褪黑素结合位点的组织分布特点，制备了褪黑素在胃中缓慢释放、在肠中快速释放的MTNPs。由于肠道组织的吸收表面积大，褪黑素在肠道组织大量释放的同时也能被快速吸收。因此，该作用可提高褪黑激素的生物利用度。由于松果体被切除，所以在活的有机体内褪黑激素的水平要低得多。褪黑素的控释可以维持褪黑素的滞留时间在活的有机体内并保持药物效果很长一段时间;因此，它在模拟松果腺体的生理功能方面发挥作用。

Delagrange等[48表明褪黑素及其受体激动剂是抗抑郁药。首发抑郁症患者在抑郁发作时血浆褪黑素水平低于健康人，也明显低于首发精神分裂症患者。这表明褪黑激素水平的下降与抑郁症尤其密切相关。Delagrange等人也证实，随着抗抑郁药治疗后抑郁症状缓解，血浆褪黑激素水平显著升高。在临床试验中，也有报道MDD患者血清褪黑素水平异常，尽管该水平并不能区分抑郁症的严重程度[49］．口服外源性褪黑素治疗抑郁症是有效的。褪黑素对反复进行强迫游泳测试的老鼠有抗抑郁作用[16.］．褪黑素还具有改善MDD患者情绪的作用，安全性好，耐受性好，无不良副作用[50］．在我们的研究中，松果体切除术在大鼠中产生了抑郁样行为，包括显著降低了Wistar大鼠的糖精偏好，延长了游泳静止时间。外源性褪黑素可有效改善这些指标[51］．我们的结果与报道的结果一致。此外，与游离褪黑素相比，MTNPs在缩短静止时间方面更有效，并有增加糖精偏好的趋势，说明MTNPs具有更好的药物效果。据推测，这种更好的改善可能是由于MTNPs控制褪黑素释放，从而维持血浆水平较长时间。

以往的研究表明褪黑素对下丘脑-垂体-靶轴(性腺、甲状腺和肾上腺)的活动有抑制作用[52，53］．此外，褪黑素还对免疫系统有改善作用，引起细胞因子分泌的变化，调节神经内分泌。这使得褪黑素对神经内分泌的影响更加多样化和复杂，特别是在HPA轴上许多不一致的结果[52］．例如，由松果切除术引起的褪黑激素的减少对雄性大鼠的皮质分泌没有显着影响[54]，而雌性大鼠的分泌则上调[55］．在本研究中，由于松果切除术引起的褪黑素的缺陷表明，虽然四组没有统计学差异，但在DEX注射之前提高了基础血浆皮质水力水平的倾向。然而，在DEX注射之后，销群中的内皮水平的减少折叠显着小于假组中的折叠，表明没有松弛腺体破坏了HPA轴活动的塑性变化。松果切除大鼠的较高的皮质水平也与抑郁状行为的症状一致。施用外源性褪黑激素或MTNPS可以增强在DEX注射后的降低折叠折叠，使HPA轴敏感的可塑性，提高HPA轴的负反馈。此外，MTNP可以提高对自由褪黑激素的负反馈机制，证明褪黑激素的长期释放可能有助于缓解由松弛切除术引起的褪黑激素的总体减少。

5.结论

在目前的工作中，负载褪黑素的控释纳米颗粒治疗松果体切除的大鼠得到了证实。这些纳米颗粒能有效封装褪黑素，保护褪黑素不被降解。负载褪黑素的纳米颗粒既具有ph敏感性，又具有控释性。它有助于在肠道组织中快速释放和吸收，提高褪黑激素的生物利用度。然后在活的有机体内结果证明纳米颗粒治疗可有效改善松果体切除大鼠的抑郁样行为和HPA轴激素分泌。但本研究尚处于起步阶段，尚需优化包封效率，并采用慢性不可预测的轻度应激大鼠进行完整的药物疗效评价。

数据可用性

本研究中使用和分析的所有原始数据均可在合理要求下由通讯作者提供。

的利益冲突

作者对本文的出版物没有利益冲突。

作者的贡献

闵思和孙乾书对这部著作贡献相当。

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