文摘

骨结核病引起的结核分枝杆菌继续给人类带来巨大的挑战。有效治疗严重骨结核病,一种新颖的复合支架与长期双重药物释放行为准备满足骨再生和公开的需要药物治疗。由于改进的O / W乳液技术,水溶性异烟肼(INH))下载明胶微粒被裁剪的内容了β磷酸三钙(βtcp)在异烟肼扮演重要角色的截留效率和药物释放行为。通过混合聚ε己内酯)块聚(乳酸-有限公司乙醇酸)(b-PLGC)解决方案包含油溶性利福平(RFP)通过粒子浸出与相分离技术相结合,双重drugs-loaded复合支架制作,具有相互联系的多孔结构,实现了稳定的异烟肼和RFP药物释放三个月了。此外,这种双重drugs-loaded系统可以实现各自的药物没有明显的准角色相互影响。这种策略对智能复合材料的制备与多种药物支架承载能力和长期控制释放行为将潜力和前途的基质骨结核病的临床治疗。

1。介绍

细菌感染是最常见的一种疾病威胁着人类的健康,已导致严重疾病摧毁受感染的组织,例如骨结核病(TB)和骨髓炎1- - - - - -4]。传统治疗感染的消毒/抑菌作用和补偿主要包括破坏组织。比如严重的骨结核病,标准课程涉及超过6个月的药物治疗抑制细菌和骨头植入病变切除手术后填充和修复蛀牙。本地药物输送系统(DDS)提供了一个有效的骨结核病的药物治疗方法。具有优势的具体站点交付,药物剂量优化和发布时间。因此,DDS技术被认为是实现药物治疗的最佳人选,组织工程是最潜在缺陷补偿方法(5- - - - - -9]。由此可见,DDS和组织工程应该是一个自然的方式同时满足骨结核病治疗的两个方面。

最近,许多研究人员一直在关注这个可行的策略。例如,黄的团体和康的团体利用化学粘结技术共轭可生物降解聚合物的药物分别获得组织工程支架,可以实现长时间的药物释放和满意的组织再生。然而,化学粘结技术总是进行了长期的药物释放(约6个月)稍微初始破裂释放。此外,它不可避免的有缺陷的可能药物变性和不完整的药物释放,尤其是在药理作用可能改变化学成键和在聚合物的降解。当它的分子量小于5000年,polylactone与药物分子的降解片段可以溶解在水中,被认为是一个药物分子,但是否能扮演相同的角色作为药物分子是怀疑。因此,物理混合技术更可取的实现控制药物释放支架(10- - - - - -14]。这时,一个新设计的polylactoneb采用-PLGC生产能力的组织工程骨支架延伸98天的药物释放时间和减少初始破裂释放低于40%。然而,它主要是报道,类似的物理混合技术释放时间只能持续不到50天,初始破裂释放达到高于60% (15]。尽管技术的差异,上述工作可以满足的要求修复和抑菌功能。然而,只有一个药物的不断释放的重点感染可能导致细菌的耐药性;在这种情况下,迫切需要采用多个局部治疗药物在临床实践中16,17]。因此,建立长期多个药物释放系统是一个正确的方向前进不仅在本研究在临床领域。

除了一线对公开药物如异烟肼(INH)、利福平(RFP)、吡嗪酰胺和乙胺丁醇,其他类似p-aminosalicylic酸、乙硫异烟胺、丙硫异烟胺和环丝氨酸的多种药物疗法还包括骨结核病(18- - - - - -23]。这些药物的溶解度分为两类可分为水溶性和油溶性。为了简化实验室模型,一个典型的药物从每个类别被加载在组织工程支架在同一时间。考虑到临床广泛使用,异烟肼是水溶性药物和RFP的合适的代表是油溶性药物。很容易RFP加载到组织工程支架的物理混合技术,因为油溶性RFP可以溶解在有机溶剂中分散均匀polylactone脚手架。相对的,异烟肼的加载是困难的。异烟肼的相分离和polylactone可能会导致异烟肼分布不均匀。此外,异烟肼的水溶性要求无水的清洗过程,以避免不受控制的损失,但大多数情况下,组织工程的支架制造技术解决方案/ porogen浸出,在无机盐(主要是氯化钠粒子)采用porogen而水浸出过程中是必需的(24- - - - - -26]。为了规避这个问题,明胶涂层和交联技术被送往异烟肼加载到TCP纳米颗粒。在这种情况下,粒子可以带入polylactone / TCP复合支架与小异烟肼损失后porogen浸出过程。

在这项工作中,我们结合TCP纳米颗粒进入RFP-containing PLGC聚合物基质形成复合支架。PCL以来高导磁率为药物分子和PLGA在退化调整灵活性,支架的RFP-releasing行为和降解速率主要是由退化和控制药物的渗透性b-PLGC聚合物,可以有效地提高均匀性,延长释放持续时间和抑制初始破裂释放。此外,通过复杂的物理混合技术,水溶性异烟肼药物也被封装到复合支架产生一种新颖的双抗结核药物复合支架,实现可控长期局部给药。使用这一原则,许多复杂的支架材料与药物的多个加载和定制的版本可能在骨结核病治疗有很大的应用。

2。材料和方法

2.1。材料

丙交酯和乙交酯从Purac购买(荷兰)和纯化在乙酸乙酯重结晶两次。ε-caprolactone购买从穿越Chemica(比利时),干用氢化钙24 h和蒸馏真空(82°C / 133 Pa)。亚锡辛酸酯(分析纯)和异烟肼(INH、99%)从Sigma-Aldrich购买。从中国能源化工、RFP购买。β磷酸三钙(βtcp与直径300 - 500 nm)粉购自上海第四试剂厂,中国。乙酸乙酯是由P干的₂O₅一夜之间,然后蒸馏。氯化钠质量分析是购自北京化工厂,中国。这是已筛和粒子直径150 - 300μ米被选中。明胶(分析纯),溶剂和其他化合物得到从北京化学试剂公司,中国。所有试剂都是用作收到除非另有注明。

2.2。特征

¹H NMR光谱得到的力量drx - 400光谱仪chloroform-d用四甲基硅烷(TMS)作为内部参考。凝胶渗透色谱法(GPC)的测量进行了ve - 2001(英国Viscotek)维持在35°C使用氯仿作为洗脱液流速为1.0毫升/分钟。扫描电子显微镜(SEM)图像获得的加速电压5 kV地产- 6700 f显微镜(JEOL、日本)。样本与一层薄薄的Pt sputter-coated 120年代之前使导电样品测试。热重分析(TGA)测量进行助教仪器,Inc . mdsc - 2910。温度程序从30到700°C的增加率10°C min⁻¹流动的空气。紫外可见光谱测量在日立u - 3010光谱仪和荧光测量进行了日立F4600光致发光光谱仪与氙灯作为光源。共焦激光扫描显微镜(510年蔡司LSM样品形貌,德国)被激发在314海里。

2.3。的制备和表征b-PLGC

根据我们以前的报告,聚ε己内酯)块聚(乳酸-有限公司乙醇酸)(b通过两个步骤(-PLGC)共聚物合成15]。首先,PCL pre-polymer是开环聚合的准备的ε己内酯(CL) 65 Pa在密封玻璃安瓿瓶在140°C 20 h十六醇为引发剂的存在和辛酸酯亚锡作为催化剂(0.05 wt %)。随后,纯化PCL pre-polymer、乙交酯丙交酯,辛酸酯亚锡在真空密封成脱氧玻璃管在160°C 20 h。之后,原始的产品是溶解在氯仿中,沉淀成乙醇,然后彻底干燥真空下48 h。

2.4。明胶INH-Loaded粒子的制备和表征

INH-loaded凝胶粒子通过修改后的O / W乳液技术准备(27]。首先,异烟肼溶液浓度的10 wt %是由去离子水溶解异烟肼。然后添加了一定量的TCP纳米颗粒。TCP纳米粒子均匀分散后,1.0 g的明胶放入10毫升的异烟肼解包含TCP纳米颗粒。溶液被加热到45°C为水相,这是慢慢地添加到350毫升的豆油含有0.675克的跨度80年作为油相搅拌速度为200 rpm。十分钟后,搅拌速度是400 rpm,进一步保持30分钟,而系统是自然冷却到室温。之后,该产品是由丙酮洗4次,异丙醇为3次。接下来,获得微粒子被冻干48 h,然后由戊二醛交联溶解在丙酮的100毫升。之后,粒子被添加到300毫升溶液10更易与甘氨酸和0.1 wt %跨度80删除剩余戊二醛。最后,微粒被用水洗3次。 After the freeze-dried process for 48 h, the final samples were sealed and kept in a 4°C refrigerator. The microparticles with theoretical TCP content of 0 wt%, 33 wt% and 50 wt% were abbreviated as(电子邮件保护),(电子邮件保护)和(电子邮件保护),分别。

微粒被涂上一层铂使用溅射后涂布机(e - 1010、日立、日本),他们的形态扫描电镜观察到(地产- 6700 f, JEOL有限公司、日本)。计算出的平均直径测量5 SEM照片每个样本有超过100个粒子在每个测量照片。TCP内容以TGA(美国PerkinElmer Pyris 1) 30 - 700°C的温度范围,温度上升的速度10°C /分钟。

2.5。复合支架的制备及表征

基于我们之前的研究中,复合支架被所使用的粒子浸出结合相分离技术(15,24,25]。b-PLGC支架装载(电子邮件保护)和RFP准备如下:首先,b-PLGC, RFP,恶烷的比例5:1:90 (wt.比率)搅拌24 h形成一个解决方案。然后一定质量的(电子邮件保护)和pre-sieved氯化钠粒子重量的40/1b-PLGC被添加到解决方案,大力搅拌成浆混合物。接下来,泥浆被安装成模具,冻结在−20°C和冻干48 h。完成后用蒸馏水洗净和随后的24小时冷冻干燥,PLGC支架加载与异烟肼和RFP。的内容(电子邮件保护)在获得支架50 wt %所以这些支架是缩写为我/ RP50。

的b-PLGC支架装载(电子邮件保护)准备类似,唯一不同的是,没有RFP介绍了吗b-PLGC解决方案。的内容(电子邮件保护)在支架50 wt % 70 wt %,所以这些支架是标记为我/ P50和我/ P70,分别。

b-PLGC支架加载与异烟肼(电子邮件保护)准备同样的,唯一的区别是,TCP纳米颗粒和异烟肼分别添加到吗b-PLGC解决方案直接代替(电子邮件保护)的INH-loadedb-PLGC脚手架没有(电子邮件保护)被任命为异烟肼/ TCP /b-PLGC。后支架被涂上一层铂使用溅射涂布机,其形态扫描电镜的特点。支架携带明胶颗粒含有伊文思蓝和TCP被切成薄片,共焦激光扫描显微镜下观察(样品形貌,蔡司LSM 510,德国)在540海里。孔隙大小测量使用ImageJ软件(美国国立卫生研究院)根据SEM显微图。对于每一个支架,孔平均直径的计算是基于100年测量。支架的孔隙度确定如前所述[28]。TCP含量测量支架通过TGA(美国PerkinElmer Pyris 1) 30 - 700°C的温度范围,温度上升的速度10°C /分钟。

2.6。异烟肼加载内容和凝胶粒子的截留效率

异烟肼加载内容和截留明胶颗粒经提取方法的有效性。首先,标准曲线是由一系列的获得异烟肼浓度在PBS使用紫外分光光度计(tu - 1901、PERSEE、中国)λ_马克斯= 263海里。然后10毫克INH-loaded粒子添加到氢氧化钠溶液,溶液被加热到60°C 2 h粒子溶解完全。接下来,盐酸是中和碱性和PBS稀释至5毫升。之后,解决方案是在8000转离心10分钟去除TCP粒子和获得清晰的解决方案,并分析了使用紫外分光光度计λ_马克斯= 263海里。与此同时,相同的纯粒子没有质量异烟肼治疗以同样的方式作为INH-loaded粒子和作为控制获得的清晰的解决方案。异烟肼浓度通过校准曲线计算得到的异烟肼在不同浓度标准的解决方案。异烟肼的比例加载和封装效率计算如下:

2.7。异烟肼释放行为的粒子

体外释放行为(电子邮件保护),(电子邮件保护)和(电子邮件保护)进行了在10毫升的37°C 0.1 PBS (pH = 7.4),分别。释放介质被撤回在预先确定的时间间隔,取而代之的是新鲜每次PBS。然后异烟肼是由紫外分光光度计λ_马克斯= 263海里。异烟肼的浓度计算校准曲线与异烟肼在不同浓度标准的解决方案。

2.8。各种支架的药物释放行为

各种支架的体外释放行为进行在10毫升的37°C 0.1 PBS (pH = 7.4),分别。释放介质带走在预设时间间隔和流离失所的新鲜每次PBS。异烟肼和RFP紫外分光光度计测定λ_马克斯分别为= 263 nm和474 nm。异烟肼和招标书的内容与校准曲线计算在不同浓度异烟肼和RFP的标准解决方案。

2.9。统计分析

定量数据都表示为平均值±标准偏差 。统计分析的基础上t以及和差异。

3所示。结果与讨论

3.1。制造b-PLGC支架与异烟肼和RFP加载

3.1.1。INH-Loaded明胶微粒的制备和表征

INH-loaded明胶微球的形态是由O / W乳液技术修改。如图1SEM照片显示,TCP的粒度范围300 - 500 nm INH-loaded凝胶粒子的大小在10 ~ 30μm。TCP内容的增加,粒子的大小(电子邮件保护),(电子邮件保护)和(电子邮件保护)分别为17.2±2.1μ米,21.8±1.9μm和23.1±2.4μ米从ImageJ获得软件,分别。

TCP内容的微粒子测量热重分析(TGA)作为显示在图2。的数量(电子邮件保护),(电子邮件保护)和(电子邮件保护)0 wt %,分别为29.3 wt % 50.0 wt %,符合他们的理论内容,表明最小损失的TCP微粒的制备。

如表所示1、异烟肼加载内容和各种微粒截留效率范围从3.7%到5.0%和37%到50%,分别。当TCP内容增加,异烟肼加载内容和截留效率相应增长,这是归因于TCP的相对较大的表面积,拥有一定的药物吸收效果。然而,仍有部分药物损失微粒制备过程中由于机械搅拌和轻微的溶解在丙酮异烟肼。上述结果显示成功制备INH-loaded明胶微粒。

3.1.2。的制备和表征b-PLGC支架装载(电子邮件保护)和招标书

的b-PLGC支架装载(电子邮件保护)捏造了粒子浸出分离技术结合阶段。支架的形态是由SEM观察和比较b -PLGC支架装载异烟肼没有微粒,如图3。支架的孔隙大小和加载(电子邮件保护)在200 - 300的范围吗µ异烟肼/ TCP / m。相似b-PLGC支架,大量的微孔隙(10 - 50µ米)可以看到macro-pores的墙上。结果显示,微粒子并不影响支架的特性,可以为细胞提供高表面积播种、附件和增殖,提供营养和代谢消除产品(29日- - - - - -32]。

支架的孔隙尺寸和孔隙度也获得分别凭借ImageJ软件和体积排斥方法如表所示2。我/ P50和我的孔隙大小/ P70支架在200 - 300的范围µm在孔隙度在80%以上。这些结果指出,支架的孔隙尺寸和孔隙度略减少合并后(电子邮件保护)

为了进一步分析微粒子的分布,水溶性荧光聚合物,伊文思蓝,加载在微粒子代替异烟肼。形成复合支架,称为e m / P50和e m / P70共焦激光扫描图进行了分析4。结果表明,这些微粒子分布在支架的相对一致性,例如一些粒子传播不同的毛孔和其他嵌入式交界处的内支架。

支架的TCP内容也符合理论值与TGA的验证测量(图5(一个)),表示最小TCP损失在支架的制备。由于TCP分布在骨再生支架施加影响,TCP的内容我/ P50支架在不同地区也以TGA(图5 (b))。顶部、中部和底部部分内容为21.2 wt %,分别为24.7 wt % 27.8 wt %。TCP的琐碎的分布差异的内容在整个支架可能归因于一些沉积在准备过程中微粒的支架,但这并不会影响支架的使用。

的b-PLGC支架装载(电子邮件保护)和RFP根据前面的方法(15]。我/ P50相比,我/ RP50也拥有随机相互关联的多孔结构在图6。其孔隙大小的200 - 300µ以及大量的微孔隙(10 - 50µmacro-pores m)在墙上。此外,孔隙率和TCP的内容我/ RP50支架也类似于我/ P50支架(相应的数据和曲线,避免重复未显示)。这些结果显示,RFP对支架的形态没有明显的影响。

3.2。药物释放行为的b-PLGC支架与异烟肼和RFP加载在体外

3.2.1之上。异烟肼微粒的释放行为在体外

最初的版本(电子邮件保护),(电子邮件保护)和(电子邮件保护)24.4 wt %,分别为19.8 wt % 17.9 wt %在图吗7。随着TCP内容增加,破裂释放摔倒,表明TCP在一定程度上可以抑制初始破裂释放。在初始破裂后释放,异烟肼释放行为这三个与线性趋势微粒子在本质上是统一的。释放率降低为TCP扩充内容。但是,药物释放的速度(电子邮件保护)加速后三周的抑制效果,特别是对于(电子邮件保护)在第四周的累积释放达到98.2%,高于92.7%的(电子邮件保护)和85.7%(电子邮件保护)

28天后,微粒的形态观察图8。显然,明胶微粒没有TCP仍能够保持他们的球形而大多数这些粒子包含TCP退化以及TCP的接触表面。TCP的更高的内容可能导致这些微粒的快速降解,这是符合3周后的药物释放行为。基于上述结果,异烟肼截留效率高,初始药物释放速率缓慢和彻底的终极药物释放的内容,(电子邮件保护)是一种理想的材料制造异烟肼加载b-PLGC支架。

3.2.2。异烟肼装载的药物释放行为b-PLGC支架在体外

异烟肼的药物释放行为b-PLGC支架图所示9(一个)。最初的异烟肼破裂释放异烟肼/ TCP /b-PLGC更高,累积异烟肼发布第一周超过60%,但我的/ P50和我/ P70支架还不到20%。异烟肼持续释放我/ P50和我/ P70支架可以保持84天,和攀爬的累积释放增加内容(电子邮件保护)在支架。异烟肼的快速释放异烟肼/ TCP /b-PLGC应该归因于水溶性异烟肼直接混合的支架,容易与水接触。异烟肼持续释放b-PLGC支架装载(电子邮件保护)主要是由于持续异烟肼释放吗(电子邮件保护)此外,由于微粒子与聚合物涂层支架制备过程中,一些粒子嵌入支架(图的内部5)和异烟肼预防是直接接触水,导致减少初始破裂释放,释放时间延长。提到这双drugs-loaded系统可以实现准角色各自的药物没有明显影响。

我的异烟肼和RFP配置文件/ RP50支架图所示9 (b)。在初始阶段,发生了轻微的异烟肼和RFP的初始破裂释放约为15%和20%,分别。之后,一个长期持续的异烟肼和RFP发布概要文件获得的累积释放ca。75%和82%在84年的一天,这表明我/ RP50支架可以进行持续的异烟肼和RFP发布3个月,与异烟肼和RFP个人INH-loaded(图的释放行为9 (b))和RFP-loaded支架。RFP的初始破裂释放应该归因于不可避免现有RFP分子表面的衬底在脚手架准备。虽然RFP分子嵌入聚合物矩阵会慢慢释放通过水分子渗透和RFP扩散效应。异烟肼和RFP释放在活的有机体内及其对骨组织的修复和重建的影响将在未来进一步的研究工作。此外,最初仍有不可避免地爆发释放需要改进的问题。例如,我们将设计和制造另一个智能系统实现可控varied-drugs交付通过进一步结合超分子相互作用和共价键的方法。

4所示。结论

总之,我们准备了(电子邮件保护)微粒子初始破裂释放,更高的累积释放和更长的持续异烟肼释放,TCP内容密切相关。粒子浸出后结合相混合物的分离技术(电子邮件保护)和b-PLGC解决方案包含RFP,异烟肼,RFP-loaded b-PLGC支架得到比INH-loaded异烟肼释放速率越快b-PLGC支架的均匀分布的微粒子在这些支架。这个药物释放系统可以实现两种药物各自的角色,和加载过程不是彼此影响。轻微的初始破裂后释放发生在第一天,异烟肼和RFP慢慢释放支架为84天,累计释放达到约75%和82%在84年的一天,分别。因此,我们相信,这些双重抗结核药物复合支架将骨结核病治疗的潜在临床应用。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

大为李和曹国伟李同样这项工作。

资金

我们极大地承认金融支持中国的国家自然科学基金(国家自然科学基金委、81972081、81972081),北京新项目(Z181100006218059)和开放的研究项目基金(K2019-27)。