文摘

客观的。探索人参皂苷的效果和机制Rg3纳米颗粒在非小细胞肺癌的恶性行为。方法。纳米颗粒载体是由使用一个静电系统的覆盖人参皂苷Rg3涂层后,运用高效液相色谱法测定纳米颗粒载体与人参皂苷Rg3单体。H125细胞增殖测定使用MTT测定,Transwell试验是用于检测H125细胞的侵袭性。细胞划痕试验被用来确定H125细胞的迁移能力,和西方墨点法是用来测量H125细胞中PTEN的表达水平;在H125 mir - 192细胞的表达水平测量通过RT-qPCR和H125细胞的凋亡水平被Tunel分析检测。结果。首先,明胶纳米粒子和透明质酸纳米颗粒均匀分布,均匀在形状、大小和球后,涂层人参皂苷Rg3,纳米颗粒的大小有显著增加。其次,mir - 192的表达水平调节H125细胞中,可有效地抑制治疗Rg3单体和HA-Rg3纳米颗粒。第三,mir - 192的可拆卸的显著地抑制H125细胞增殖,入侵,迁移和增强H125细胞凋亡。此外,PTEN基因被证明是一个目标mir - 192。最后,通过抑制在H125 mir - 192细胞的表达水平,Rg3单体和HA-Rg3纳米颗粒调节PTEN的表达,从而发挥其抗癌作用;HA-Rg3的影响相对更重要比Rg3单体。结论。Rg3单体和HA-Rg3纳米粒子减轻人类非小细胞肺癌的恶性行为H125细胞分子轴,通过mir - 192 / PTEN和HA-Rg3纳米粒子表现出更好的抗肿瘤效果。

1。介绍

人口老龄化和生活环境的恶化,肺癌已成为世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,发病率和死亡率呈上升趋势。它已成为一个在中国的发病率和死亡率最高的恶性肿瘤其中约80%至85%作为非小细胞肺癌(1]。人参皂苷Rg3是人参提取物的活性成分之一。根据临床证据,人参皂苷Rg3可以抑制肿瘤的恶性行为如肿瘤浸润和转移,可以减轻化疗的毒性作用,也可以使敏感肿瘤的抗肿瘤药物。然而,人参皂苷Rg3单体在人体低溶解度,从而导致低效率。几项研究表明,纳米级粒子载体可以提高药物的溶解度,因此增加身体的吸收,提高药物的生物利用度。

小分子核糖核酸(microrna)是一类非编码单链RNA分子,影响各种生物的行为。的作用机制主要是通过与3′utr影响靶基因的mRNA的表达。许多研究表明[2microrna的表达的改变将导致其差别upregulation或对这些目标基因mRNA表达,然后影响细胞增殖和细胞凋亡。此外,异常microrna的表达也可以诱发一系列人类疾病,包括癌症。之前的研究表明,mir - 192非小细胞肺癌组织中的表达显著增加。因此推测,mir - 192与非小细胞肺癌的发生和发展。肿瘤抑制基因磷酸酶和tensin同族体(PTEN)是一个dual-specific蛋白质和脂质磷酸酶,可以阻止PI3K信号通路的激活一种蛋白激酶抑制细胞增殖和生存。因此,PTEN对癌症有一定的抑制作用[3]。通过预测,发现PTEN可能mir - 192的下游靶基因。因此,推测,mir - 192可能会影响非小细胞肺癌的发生和发展通过调节PTEN的表达。因此,在这项研究中,纳米颗粒载体覆盖着人参皂苷Rg3单体准备调查其对恶性影响人类行为的非小细胞肺癌细胞系H125和它的底层机制。

2。材料和方法

2.1。细胞系和试剂

在这项研究中,人类正常的肺上皮细胞BEAS-2B是购自中国科学院细胞银行,和人类非小细胞癌细胞H125买来FuHeng细胞中心,上海,中国。从吉林人参皂苷Rg3 (Shenyi胶囊)购买亚太药业有限公司有限公司;胎牛血清和DMEM培养基从苏州Laisa购买生物技术有限公司有限公司;MTT装备购买从北京Kanglong Kangtai生物技术有限公司有限公司;Transwell室从美国BD公司购买;Tunel工具包和丽珀•细胞溶解产物是购自上海Biyuntian生物技术有限公司有限公司;Lipofectamine 2000工具包和逆转录工具包是购自上海Kemin生物技术有限公司有限公司;ECL开发工具包是购自中国Solarbio和dual-luciferase报告基因检测设备是购自北京YuanPingHao生物技术有限公司有限公司

2.2。制备纳米粒子

明胶和透明质酸纳米粒子也准备了一个静电场制备系统。此外,4μL的准备人参皂苷Rg3解决方案(25毫克/毫升)分别添加到996年μL准备明胶和透明质酸纳米颗粒(最终浓度人参皂苷Rg3是100年μg / mL)静电场制备的涂层系统。覆盖面的人参皂苷Rg3由高效液相色谱法。

2.3。细胞培养和转染

H125细胞在DMEM播种介质(含10%胎牛血清,100 U / L青霉素、和100 mg / L链霉素)和恒温培养箱中培养37°C公司为5%₂。mir - 192抑制剂,miR-NC、pc-PTEN pc-NC, sh-PTEN岛提供的上海。对数生长期的细胞转染microrna的模仿和siRNAs根据Lipofectamine 2000套件。细胞转染48 h后,收获了后续实验。在这项研究中使用的引物序列如表所示1。

2.4。MTT实验

单细胞悬液是由胰蛋白酶化H125细胞对数生长期。细胞浓度调整到5×10³cell /好,接种到96孔板。细胞被培养在孵化器在37°C公司为5%₂。24小时后,细胞治疗根据实验设计,然后培养在37°C公司为5%₂24 h。这些细胞被洗两次与PBS缓冲溶液,然后在含10%胎牛血清的DMEM培养基培养48 h。20μ肝癌和L(5毫克/升)的解决方案是添加到每个好,和H125细胞的增殖活动以严格按照MTT工具包的指令。

2.5。Transwell实验

参议院Transwell室的涂层与基底膜基质和H125细胞对数生长期拍摄和播种1×10的浓度⁵细胞/在参议院Transwell室包含一个无血清培养基。包含10%胎牛血清的DMEM培养基添加到众议院。细胞接种后24小时取出,用甲醛固定,与结晶紫染色5分钟,洗3次与PBS缓冲,拍照,和计算。

2.6。细胞划痕试验

5×10⁵细胞被添加到每个6-well板。细胞融合率达到95%时,细胞膜与PBS缓冲飞跑,慢慢洗3次,划定细胞被移除,无血清培养基补充道。板是在孵化37°C, 5%的公司²孵化器24 h和24 h后拍照,并使用ImageJ划痕的距离决定。

2.7。西方墨点法

H125细胞转移到EP管,细胞溶解在冰上使用里帕细胞溶解产物为30分钟,然后在14000转离心5分钟在4°C。上层清液是提取和加载缓冲区添加到上层清液。样本然后变性在100°C的10分钟,然后储存在−20°C。25μ然后g蛋白质样品加载和电泳40 100分钟。之后,然后转移到膜在100 V 90分钟。添加主抗体后,细胞膜在4°C的环境中过夜,然后在室温下孵化2 h后的二级抗体。形象发展严格基于ECL工具包执行指令和灰度分析蛋白质的乐队使用ImageJ软件执行。

2.8。RT-qPCR

H125细胞RNA提取和2μL提取的RNA是添加到98年μL (ddH₂O RNA含量和纯度测量基于吸光度值通过一个紫外分光光度计。的cDNA然后根据指令的逆转录合成装备。根据表进行了PCR反应2;具体来说,反应条件如下:95°C, 10分钟;95°C, 20年代;60°C, 1分钟,总共40个周期。

2.9。通过Tunel分析检测细胞凋亡

处理后样品与PBS缓冲液冲洗,周围的液体样本删除。100年μL (TdT酶反应的解决方案是添加到每个样本,在黑暗中进行的反应是在37°C 60分钟,然后稀释SSC的解决方案是添加到终止反应。与PBS缓冲液冲洗后,样品被封锁在0.3%过氧化氢/ PBS和孵化在室温下4分钟。100年μL streptavidin-HRP工作解决方案的补充道,并在37°C反应进行了60分钟。坏生色的解决方案是添加,紧随其后的是冲洗细胞与PBS缓冲三次,然后用中性树脂密封,在显微镜下观察到。

2.10。Dual-Luciferase报告基因分析

后3′utr PTEN基因的片段被放大并插入到双荧光素酶报告基因质粒,筛选阳性克隆,测序,扩增,纯化的质粒。mir - 192质粒和空向量在类似的方式获得。报告基因的质粒,mir - 192,和空向量与发育cotransfected H125细胞,细胞被培养在恒温培养箱在37°C,公司为5%₂24 h。之后,蛋白质纯化,基质添加;荧光素酶活性测定采用荧光计数器。

2.11。统计分析

统计软件SPSS(22.0版)是用于数据分析,在这项研究中获得的数据被表示为 ,的t以及用于对比组,比较分析了在多个组单向方差分析。时显著的区别或 。

3所示。结果

3.1。纳米颗粒检测和向量筛查

准备的明胶纳米粒子运营商和透明质酸纳米颗粒载体均匀分布,发现了统一的大小和电子透射显微镜下球面形状,和纳米颗粒的粒径运营商分别为4.5±0.75和16.4±4.2 nm,分别。如数据所示1(一)和1 (b)MTT实验的结果显示,细胞的可行性H125细胞显著减少当cocultured 20μL明胶纳米粒子载体悬浮( ),而类似显著降低细胞的可行性H125细胞观察,当cocultured 40μL透明质酸纳米颗粒载体悬浮( )。后coculture H125细胞凝胶聚合物或聚合物,H125细胞的活动类似于凝胶或HA纳米粒子;参见图1 (c)。涂层后人参皂苷Rg3 Gelatin-Rg3纳米颗粒和透明质酸HA-Rg3纳米颗粒显示少量的粒子聚集,和纳米颗粒的粒径明显不同于之前涂层( );粒子的大小分别为40.3±5.8和31.2±8.4 nm,分别。覆盖面的人参皂苷Rg3对明胶和透明质酸纳米颗粒以高效液相色谱法为13.715±1.985%和36.410±6.472%,分别。因此,为了减少对H125细胞纳米载体的影响,HA-Rg3纳米颗粒被选为后续实验。

3.2。影响HA-Rg3 Bio-Polymerized纳米颗粒在mir - 192的表达水平

如图2(一个),在H125 mir - 192细胞的表达水平显著高于BEAS-2B细胞。然而,在H125 mir - 192细胞的表达水平均明显下调后cocultured与人参皂苷Rg3和HA-Rg3 bio-polymerized纳米颗粒( ),和mir - 192的表达水平达到最低当H125细胞被cocultured HA-Rg3 ( )如图2 (b)。

3.3。mir - 192对H125细胞的恶性行为

RT-qPCR的结果显示,在H125 mir - 192细胞的表达水平与对照组相比显著下调mir - 192转染后的抑制剂( ),如图3。和mir - 192的可拆卸的显著抑制H125细胞的活动( )如MTT(图所示4(一)),显著抑制入侵H125细胞( )如Transwell结果(图所示4 (b)),同时显著地抑制H125细胞的迁移能力 )细胞划痕实验结果所示(图4 (c))。此外,击倒mir - 192也大大促进了H125的凋亡细胞( )如图4 (d)。

3.4。PTEN是mir - 192的目标基因

通过使用ENCORI数据库,我们预测,3′utr PTEN的mRNA有部分碱基序列绑定5′utr mir - 192年底,如图5(一个)。免疫印迹结果(图5 (b))表明,PTEN的表达水平显著下调H125细胞( ),而mir - 192的可拆卸的显著增强H125细胞中PTEN的表达( )。此外,如图5 (c)dual-luciferase试验的结果证实,PTEN是mir - 192的目标基因。

3.5。的作用机制HA-Rg3 Bio-Polymerized纳米颗粒在非小细胞肺癌

MTT试验表明,H125细胞的增殖活动在第二组我和组明显低于NC组( ),和H125细胞的增殖活动组III和IV显著抑制( ),而H125 V组细胞的增殖活动没有明显不同于NC组。此外,H125细胞的活动在第二组显著抑制与组相比我( )如图4(一)。Transwell结果(图4 (b))表明,H125细胞的侵袭性组我,II, III和IV是抑制与NC组相比,差异具有统计学意义( ),而H125细胞的入侵在V组没有明显不同于数控集团和H125细胞的侵袭性组二组显著低于我 )。划痕试验结果(图4 (c))测量细胞迁移能力还显示,H125细胞组我,II, III和IV抑制与NC组相比,差异具有统计学意义( );H125细胞在V组没有明显不同于NC组和二H125组细胞的迁移能力明显低于集团我( )。Tunel检测细胞凋亡结果(图4 (d))表明,H125细胞的凋亡在我组,第二组,第三组,第四和组增加不同程度与NC组相比,差异具有统计学意义( )。没有显著差异的数量H125细胞的凋亡在V组与NC组相比,一次又一次的数量H125细胞的凋亡在第二组显著低于集团我( )。

4所示。讨论

肺癌是原发性支气管癌,其中非小细胞肺癌是最常见的一种癌症,占总数的75%到80%的肺癌患者4]。由于缺乏特定的早期症状,肺癌通常在临床诊断发展到高级阶段。虽然手术可以用于治疗早期肺癌,70%的病人无法治愈的(4]。最近,放疗和化疗是治疗肺癌成为主流方法。然而,随之而来的有毒副作用和较高的复发率,也是要求而言,病人的身体素质。近年来,中医的优势在癌症治疗逐渐引起了人们的关注,它可以减少对病人的放疗和化疗的副作用,延长患者的寿命质量,减轻癌症治疗的耐药性(5- - - - - -7]。

人参皂苷Rg3从人参中提取的活性成分。的主要成分是四环三萜皂苷,可抑制肿瘤血管的形成,阻止肿瘤的浸润和转移,提高免疫力和癌症患者的生活质量。吴et al。8)报道,人参皂苷Rg3可以抑制甲状腺癌体外和体内的增殖并显著抑制甲状腺癌的转移。戴et al。5)表明,人参皂苷Rg3可以提高吉非替尼的抗癌活性,提高非小细胞肺癌,吉非替尼的敏感性。目前,“Senyi胶囊”含有人参皂苷Rg3营销在中国已获批准,已用于临床治疗的癌症,已取得了一定的疗效。然而,低溶解度的单体的人参皂苷Rg3人体导致其低生物利用度因此其有效性。由于粒径小,nanocarrier一直被认为是有利于增加稳定性、溶解性,最终药物在人体内的生物利用度。研究表明,仿生50 nm纳米颗粒与紫杉醇涂层可以防止药物吸收人体的正常肺细胞由于其表面特征,最终可以更有效地提供药物,提高药物的生物利用度(9]。我们的研究结果表明,透明质酸纳米颗粒涂层与人参皂苷Rg3显示更好的体外抗肿瘤作用,与人参皂苷Rg3单体。入侵,它更有效地抑制增殖和迁移H125细胞以及促进H125细胞的凋亡。尽管人参皂苷Rg3具有一定的抗肿瘤疗效,但其作用机制尚未完全了解。因此,它是必要的和迫切需要探索的作用机制人参皂苷Rg3及其对非小细胞肺癌的生物聚合物纳米颗粒。

小分子核糖核酸(microrna)是一类非编码单链RNA分子大约22个核苷酸组成的调节蛋白的表达在植物和动物。研究表明各种microrna的表达异常在癌症组织或病人的血清。例如,mir - 125 b的表达水平在病人的血清可以用作生物标记对卵巢上皮癌的诊断和预后10]。miR-21-5p的表达水平,mir - 141 - 3 - p, mir - 205 - 5 - p尿液中可作为生物标志物的诊断前列腺癌和膀胱癌11]。通过回顾文献,mir - 192被发现可以使用调节在非小细胞肺癌和非小细胞肺癌的诊断的生物标志物(12]。通过总结文献综述,这是猜测,mir - 192可以影响各种生物行为H125细胞通过调节PTEN的表达。这项研究的结果表明,mir - 192的表达调节H125细胞和mir - 192的可拆卸的显著抑制H125细胞的恶性生物学行为。通过双荧光素酶报告基因实验中,PTEN是显示下游mir - 192的目标。

总之,HA-Rg3纳米颗粒抑制H125细胞增殖有更多的优势,入侵,迁移,促进H125细胞凋亡比单体的人参皂苷Rg3。进一步的研究表明,人参皂苷Rg3单体和HA-Rg3纳米颗粒可能会抑制非小细胞肺癌表达下调在H125 mir - 192细胞的表达水平,从而促进H125细胞中PTEN的表达。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

回周和黄成梁Cai这项研究同样起到了推波助澜的作用。

确认

这项工作是由吴Jieping医疗基金(没有。320.6750.12213)。